网状蛋白4B（Nogo-B）是一种新的肝纤维化调节因子

动物

所有动物研究均由耶鲁大学动物护理和使用机构委员会和康涅狄格州退伍军人事务医疗系统批准，并按照美国国立卫生研究院实验动物使用指南进行。Nogo-A/B基因敲除小鼠是Stephen Strittmatter送给我们的礼物¹²或Mark Tessier-Lavigne。¹³

胆管结扎术

2个月龄的雄性NGB KO小鼠及其同龄的野生型（WT）小鼠接受了假手术或胆管结扎（BDL）。¹⁴假手术中，胆管暴露，但未结扎。¹⁵手术后1周和4周收集这些小鼠的肝脏和脾脏样本。样品在液氮中进行snap冷冻，并在使用前储存在−80°C。

CCl4腹腔注射

向小鼠注射CCl₄使用Constandiou等人。¹⁶稍作修改。简而言之，CCl₄在通风橱里与橄榄油混合。对于腹腔注射，将一份橄榄油添加到三份CCl中₄.CCl₄混合物（≈7.5 M CCl₄)每3天给小鼠注射一次（7.5μ摩尔/μL/g体重/注射）8周。为了确保剂量恒定，每次注射都按照当前体重进行标准化。对照组小鼠注射相同剂量的橄榄油。

组织学分析

用苏木精和伊红对石蜡包埋的肝脏样品的五微米厚切片进行染色，以进行结构评估，用天狼星红对纤维化进行评估。通过计算天狼星红阳性面积（即胶原蛋白阳性面积）占分析总面积的百分比来确定纤维化。由于在1周和4周时间点之间，错误手术的肝脏中天狼星红阳性区域没有差异，因此将错误手术组的结果汇总起来。图像J1.41o（马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院Wayne Rasband）用于整个肝脏切片的图像分析。每个肝脏切片至少随机拍摄20张图像并用于分析。

大鼠肝细胞

在耶鲁大学肝脏中心核心设施从雄性Sprague-Dawley大鼠中分离出肝窦内皮细胞（LSEC）、肝细胞和HSC。为了确认LSEC和HSC分离物的纯度，我们评估了内皮型一氧化氮合酶（eNOS）和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA）表达。

免疫组织化学

福尔马林固定的人类肝脏样本，嵌入石蜡中，被切成6个-μm厚切片，用于免疫标记。¹⁷使用的主要抗体是山羊抗人Nogo-B（N-18，1:100；加州圣克鲁斯圣克鲁斯生物技术公司；识别表位1-18）。然后将这些切片与与辣根过氧化物酶（1:200）结合的二级抗体在室温下孵育1小时。用兔免疫球蛋白G代替一级抗体孵育或仅用二级抗体孵育的切片作为阴性对照。

Western Blot分析

肝脏样品或细胞在含有50 mM Tris HCl、0.1 mM乙二醇四乙酸、0.1 mM乙二胺四乙酸、0.1%十二烷基硫酸钠、0.1%脱氧胆酸、1%（vol/vol）Nonide P-40、5 mM氟化钠、1 mM焦磷酸钠、1 m M活化钒酸钠、，0.32%蛋白酶抑制剂鸡尾酒（罗氏诊断公司，德国曼海姆）和0.027%Pefabloc。在4°C下以14000 rpm离心裂解产物10分钟。使用Lowry测定法对上清液中的蛋白质浓度进行定量。等量蛋白质（50-80μg） 将每个样品装载到十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶上，并转移到聚偏氟乙烯或硝化纤维素膜上。用识别兔抗Nogo血清（1761A；1:10000）、小鼠抗–α-SMA（1:1000；西格玛，密苏里州圣路易斯）、热休克蛋白90（Hsp90）和eNOS（1:1000，BD Biosciences，加利福尼亚州圣何塞）和小鼠抗–β-肌动蛋白（1:1000；西格玛）。清洗后，用荧光团结合的二级抗体培养膜（680 nm或800 nm发射）。使用Odyssey红外成像系统（Li-Cor Biotechnology，Lincoln，NE）检测和量化波段。Hsp90或β-肌动蛋白被用作负荷控制。

定量实时聚合酶链反应分析

使用TRIZOL试剂（Sigma）从约50 mg冷冻小鼠肝脏中分离出总RNA，并使用RNA净化试剂盒（马里兰州杰曼顿市Qiagen Sciences）进一步纯化。使用DU530分光光度计测量RNA浓度（加州布雷亚Beckman Coulter）。使用4微克总RNA作为模板，使用SupertScript II逆转录酶（Invitrogen，Carlsbad，CA）和10 mM dNTP Mix（Invit罗gen）合成互补DNA。然后，将互补DNA稀释5倍，用作实时聚合酶链反应（PCR）模板。使用ABI 7500 SDS软件（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）进行实时PCR。Taq-Man基因表达分析（Applied Biosystems）用于测量3-磷酸甘油醛脱氢酶（Mm99999915_g1）、I型胶原α，转化生长因子-β1（Mm01178820_m1）和转化生长因子β受体1（Mm00 436971_m1）基因表达。

羟脯氨酸测定

将冷冻的肝组织（50 mg）在1 mL 6N HCl中均质化，并在110°C的加热块中加热20小时。冷却后，通过1 ml注射器过滤样品

过滤器（Pall Corporation，密歇根州安阿伯）。用450中和50微升过滤的匀浆μ在柠檬酸-醋酸缓冲液中加入2.2%NaOH（50 g/L柠檬酸一水合物、12 mL/L乙酸、120 g/L醋酸钠（H₂O）_三和34 g/L NaOH）-μL管。250微升氯胺-T溶液（0.141 g氯胺-T.2 mL H₂O、 将3 mL甲氧基乙醇和5 mL柠檬酸-醋酸盐缓冲液）添加到500μL中和匀浆、标准羟脯氨酸溶液或柠檬酸-醋酸盐缓冲液，并在室温下培养20分钟。向反应混合物中添加250微升高氯酸，并培养20分钟。最后，250μ添加L二甲苯甲醛溶液（2 g二甲苯甲醛溶于10 mL甲氧基乙醇中），并在60°C下培养20分钟。冷却后，使用Synergy 2多模微孔板阅读器（BioTek Instruments，Winooski，VT）在550 nm处测量吸光度。

小鼠胚胎成纤维细胞与Nogo-B基因重组NGB-KO小鼠胚胎成纤细胞

造血干细胞的分离和转化为肌成纤维细胞

通过以下方法从WT和NGB KO小鼠分离小鼠原代HSC就地如前所述，先灌注蛋白酶-胶原酶，然后进行密度梯度离心。^18,19这些HSC保存在Dulbecco改良的Eagle's培养基/F12培养基中，补充10%热灭活胎牛血清、青霉素（100 U/mL）、链霉素（100μg/mL）、1%两性霉素B和庆大霉素（20μg/mL），并在1至7天内用作HSC，或在细胞培养14天后用作活化和转化的肌成纤维细胞（MF-HSCs）。²⁰

TGF公司-β信号传递研究

以1×10的密度接种MEFs、HSC或MF-HSC⁵/在6孔组织培养板中培养，并允许在含有10%热灭活胎牛血清的培养基中过夜附着。然后用无血清培养基替换细胞，培养16小时，并用0、0.5、1.0或5.0 ng/mL重组人TGF刺激-β1（研发系统，明尼阿波利斯，明尼苏达州）24小时。收集细胞裂解物并用于western blot分析。

入口压力测量

如前所述，在假手术或4周BDL小鼠中测量门脉压力。²¹简而言之，将一根30号针头插入回结肠静脉。针头长度连接到一个短长度的PE-10管子上，而PE-10管子又连接到PE-50管子上，并连接到Hewlett-Packard压力传感器上。使用模拟数字PowerLab系统（科罗拉多州科罗拉多斯普林斯AD Instruments）监测读数并将其保存在计算机上。

Nogo-B在大鼠非实质细胞中也有表达，在肝细胞中表达极少

然后我们测定了大鼠原代细胞（LSEC、肝细胞和HSC）中Nogo-B蛋白的表达(图2). 正如在人类肝脏中观察到的那样，非实质细胞，如LSEC和HSC，表达Nogo-B，而肝细胞裂解物仅显示略低于40kDa的条带。这可能代表非特异性结合或剪接变体，但始终小于Nogo-B的预测分子量。在所有细胞类型中均未检测到Nogo-a蛋白（分子量≈250 kDa）。

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图2

Nogo-B的差异表达模式表明，Nogo-B主要由肝脏的非实质细胞表达。Nogo-B在大鼠肝细胞中表达，包括LSEC、肝细胞和HSC。eNOS被用作LSEC标记；α-SMA被用作HSC标记物。β-肌动蛋白被用作加载控制。星号表示只有在肝细胞裂解物中才能看到比Nogo-B分子量小的条带。

纤维化/肝硬化肝脏中Nogo-B蛋白水平显著升高

我们在小鼠纤维化/肝硬化实验模型中进行了western blot分析。Nogo-B有两种亚型，Nogo-B1（下部带≈45 kDa）和B2（上部带≈48 kDa。⁴Hsp90被用作负荷控制，因为该蛋白的表达不受肝硬化的影响（数据未显示）。我们分析了通过腹腔CCl产生的小鼠肝硬化肝脏中的Nogo-B水平₄注入(图3A). 条形图描述了Nogo-B1和-B2亚型的总表达。Nogo-B表达显著增加：CCl增加三倍₄注入(P（P）= 0.001). 我们还分析了通过BDL产生的小鼠肝硬化中Nogo-B的水平(图3B). 与CCl类似₄-BDL后4周分离的小鼠肝脏显示Nogo-B表达显著增加5倍(图3B)与操作不当的对照组相比。总之，这些数据表明，纤维化/肝硬化肝脏中Nogo-B水平升高。

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图3

肝硬化小鼠的Nogo-B水平显著升高。Nogo-B2（上带≈48kDa）和Nogo-B1（下带≈45kDa）均上调。（A） 腹腔注射CCl小鼠分离的纤维化肝脏₄持续8周。对照组小鼠服用橄榄油8周（每组4只）。（B） 假手术或BDL后4周从小鼠分离出的胆汁淤积性肝脏（每组3个）。

Nogo-B基因缺失减少肝纤维化

纤维化

我们使用天狼星红染色评估接受假手术或BDL的WT和NGB KO小鼠的肝纤维化(图4A). 手术后1周（早期肝硬化）或4周（晚期肝硬化）后分离肝脏。图4B显示NGB-KO肝脏中缺乏Nogo-B蛋白表达，WT-BDL肝脏中Nogo-B-表达增加。BDL后一周，天狼星红染色显示WT和NGB KO肝纤维化显著增加三倍(图4A)但WT和NGB KO肝之间的纤维化没有差异。然而，BDL后4周，NGB-KO肝的纤维化程度明显低于WT肝，表明Nogo-B基因缺失阻止了纤维化的进展(图4A).

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图4

Nogo-B基因缺失可减少肝纤维化的进展。（A） 天狼星红染色检测胶原作为纤维化指标的代表性图像。显示了天狼星红阳性区域占所分析肝脏总面积的百分比（n=5-7/组）。（B） 典型的western blot分析证实NGB KO肝脏中不存在Nogo-B蛋白。（C）α-与NGB KO小鼠相比，BDL后4周从WT小鼠分离的肝脏中SMA蛋白水平显著增加。

I型胶原α表达与羟脯氨酸水平

定量实时PCR分析证实I型胶原的表达显著降低α手术后4周NGB-KO-BDL肝脏与WT-BDL肝中信使RNA（mRNA）的比较(图5A). NGB KO BDL肝脏中的羟脯氨酸水平也显著低于WT BDL肝(P（P）< 0.04) (图5B). 此外，在WT小鼠中，BDL肝脏中的羟脯氨酸水平与非手术肝脏相比增加了4.5倍，而NGB KO小鼠中的增加仅为两倍。这些结果表明，Nogo-B基因缺失可减少肝硬化后期的纤维化。

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图5

Nogo-B基因缺失显著降低I型胶原α和TGF-β肝硬化小鼠肝脏中的表达水平和羟脯氨酸含量。对假手术或BDL后4周采集的肝脏进行实时定量PCR分析。数据根据3-磷酸甘油醛脱氢酶的表达进行了标准化（每组5-6个）。（A） I型胶原蛋白α信使核糖核酸水平。（B） 肝脏羟脯氨酸水平。（C） TGF公司-β信使核糖核酸水平。（D） TGF公司-βRI mRNA水平（每组5个）。

Nogo-B基因缺失对MEF和MF-HSCs中TGF-β刺激引起Smad2磷酸化的影响

使用从WT和NGB KO小鼠分离的MEF，我们测定了转化生长因子下游效应器Smad2磷酸化-βTGF应答的信号传导被称为最有效的纤维生成途径-β刺激(图6A). 我们发现TGF中磷酸化Smad2水平显著增加-βWT MEF中的剂量依赖性方式，但NGB KO MEF没有(图6A). 此外，当用Nogo-B重组NGB-KO MEF时，TGF后Smad2磷酸化被恢复-β刺激(图6B). 这些数据强烈表明Nogo-B增强了TGF-β/成纤维细胞中的Smad2信号通路。

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图6

无Nogo-B会降低TGF-β–介导的MEFs和MF-HSC中的Smad2磷酸化。（A） WT和NGB KO小鼠MEF中磷酸化Smad2水平。用0、0.5和1.0 ng/mL TGF处理这些细胞-β24小时。（B） 用HA标记的Nogo-B（RC）或空慢病毒载体（KO）重建的NGB-KO MEF中磷酸化Smad2水平。用0、0.5和1.0 ng/mL TGF处理这些细胞-β24小时。（C） WT和NGB KO小鼠产生的MF-HSCs（HSC培养21天后）中磷酸化Smad2水平。用0、1和5.0 ng/mL TGF处理这些细胞-β24小时。（D） WT和NGB KO小鼠产生的MF-HSCs（肝星状细胞培养21天后）的Nogo-B免疫荧光图像。Nogo-B显示为红色，细胞核显示为蓝色。3-5个独立实验的代表性数据。

然后，我们测试了是否可以在MF-HSC中重述MEF中的这一发现。我们通过至少2周的细胞培养，将从WT和NGB KO小鼠分离的静止HSC转化为肌成纤维细胞，从而生成MF-HSC(图6D)并使用它们在MEF中执行与上述相同的实验。这些MF-HSC表达α-SMA（数据未显示），表明静止的HSC激活并转化为肌成纤维细胞。与MEF细胞类似，WT MF-HSCs中Smad2磷酸化在TGF中增加-β剂量依赖性，但在NGB KO细胞中不存在(图6C). 结合MEF中的结果(图6A、B)，这一发现强烈表明Nogo-B促进Smad2磷酸化以响应TGF-β在MF-HSC中，Nogo-B缺失损害TGF-β/MF HSC中的Smad2信号传导。

我们感谢Nina Sheung女士和Jonathan Dranoff博士分离肝星状细胞，感谢Yuko Ueda女士的技术支持。

由国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所（R01DK082600，K01DK067933）和耶鲁大学肝脏中心试点基金（P30-DK034987）向Y.I.提供资助，并由国家心脏、肺和血液研究所向W.C.S.提供资助（R01 HL64793，R01 HL61371，R01 HL081190，RO1 HL096670）。