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分子细胞。作者手稿；PMC 2013年5月21日提供。
以最终编辑形式发布为：
分子细胞。2008年7月25日；31(2): 255–265.
数字对象标识：2016年10月10日/j.molcel.2008.06.014
预防性维修识别码：下午366092
NIHMSID公司：美国国立卫生研究院469624
PMID：18657507

靶向Bcl-2-IP3受体相互作用逆转Bcl-2对凋亡钙信号的抑制

伊平荣,1,2 Ademuyiwa S.Aromolaran公司,4 Geert Bultynck公司,5 费忠,1,2 向丽,三 凯伦·麦克尔,1,2 松山喜吉,1,2 斯蒂芬·赫利茨,三 H.卢埃林·罗德里克,6,7 马丁·布特曼,6 格雷戈里·米格纳里,4 Jan B.帕里斯,5 亨伯特·德·斯梅特,5和克拉克·W·迪斯特霍斯特1,2,*
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关联数据

补充资料

总结

抗凋亡蛋白Bcl-2抑制钙2+从内质网（ER）释放。一种提出的机制涉及Bcl-2与肌醇1,4,5-三磷酸受体（IP3R）Ca的相互作用2+在ER上定位于Bcl-2的通道。这里我们通过FRET记录了细胞内Bcl-2-IP3R的相互作用，并确定了IP3R调控和耦合域中的Bcl-2相互作用区域。基于该IP3R序列的肽将Bcl-2从IP3R中置换出来，并在体外逆转Bcl-2介导的对IP3R通道活性的抑制，IP3诱导的ER-Ca2+渗透性细胞中的释放和细胞渗透性IP3酯类诱导的Ca2+完整细胞中的升高。该肽还逆转了Bcl-2对T细胞受体诱导的钙的抑制作用2+升高和凋亡。因此，Bcl-2与IP3Rs的相互作用有助于调节促凋亡钙2+表明Bcl-2-IP3R相互作用是Bcl-2抑制细胞死亡相关疾病的潜在治疗靶点。

简介

Bcl-2家族蛋白调节细胞死亡和存活(科里和亚当斯，2002年;Danial和Korsmeyer，2004年). 创始成员Bcl-2保持线粒体完整性，并通过抑制Ca抑制多种刺激诱导凋亡2+内质网释放(Giacomello等人，2007年;Pinton和Rizzuto，2006年;Rong和Distelhorst，2008年). 钙2+升高激活钙2+-敏感蛋白酶和内切酶并触发通透性转换和细胞色素c（c）附近线粒体释放(Giacomello等人，2007年;Hanson等人，2004年;Orrenius等人，2003年;Pinton和Rizzuto，2006年). 钙2+另一方面，振荡激活了前生存转录因子并增加线粒体代谢。尽管Bcl-2和Bcl-XL（左）抑制持续钙2+海拔升高，钙含量增加2+振荡(Li等人，2007年;Palmer等人，2004年;White等人，2005年;Zhong等人，2006年)表明其对钙的调节作用具有多功能性2+促进细胞存活的信号。持续内质网钙的抑制2+Bcl-2的释放被归因于Bcl-2引起的内质网钙的减少2+浓度(Bassik等人，2004年;Foyouzi-Youssefi等人，2000年;Oakes等人，2005年;Palmer等人，2004年;Pinton等人，2000年;怀特等人，2005年)尽管ER Ca减少2+浓度尚未被普遍发现，对Ca来说可能不是必要的2+Bcl-2/Bcl-X的信号调节L（左）在所有情况下(Chen等人，2004年;Distelhorst and Shore，2004年;Hanson等人，2008年;Li等人，2007年).

进一步了解Ca2+Bcl-2/Bcl-X的调节L（左）在分子水平上，最近的研究集中于Bcl-2和Bcl-X的相互作用L（左）肌醇1,4,5-三磷酸受体（IP3R），基于细胞提取物的共免疫沉淀(Chen等人，2004年;Hanson等人，2008年;Li等人，2007年;Oakes等人，2005年;怀特等人，2005年;Xu等人，2007年;Zhong等人，2006年). IP3-介导的钙2+通过IP3R Ca从ER流出2+通道生成Ca2+介导多种细胞过程的信号(Berridge等人，2000年)包括T细胞受体（TCR）和B细胞受体激活引起的细胞凋亡、糖皮质激素、神经毒性损伤、氧化应激和Fas(Joseph和Hajnoczky，2007年). TCR复合物中CD3成分的抗原或抗体与TCR结合，激活磷脂酶C，生成IP3，诱导Ca2+通过IP3R从ER发布(刘易斯，2001). 由于TCR介导的钙发挥关键作用2+T细胞存活和死亡的信号(Gallo等人，2006年)，我们工作的一个主要重点是调节这些Ca2+Bcl-2发出信号。我们发现Bcl-2抑制持续钙2+强TCR激活诱导细胞升高和凋亡，同时增强IP3介导的钙2+弱TCR激活引起的振荡(Chen等人，2004年;Zhong等人，2006年). 在这些研究中，Bcl-2与IP3Rs的共免疫沉淀以及这些蛋白质在蓝色天然凝胶中的共迁移表明，Bcl-2对TCR介导的Ca2+信号通过调节IP3R通道开放的Bcl-2-IP3R相互作用介导。

本研究解决了与Bcl-2调节IP3R通道活性有关的三个重要问题。首先，内源性水平的Bcl-2是否与IP3R相互作用并抑制持续TCR介导的钙2+高程？这是一个关键问题，因为TCR诱导的钙的抑制2+Bcl-2阴性的WEHI7.2 T细胞中Bcl-2的外源性表达增加(Chen等人，2004年;Zhong等人，2006年). 在这里，我们通过证明Jurkat细胞中内源性Bcl-2（其表达水平远低于外源性表达的Bcl-2）与IP3R相互作用来解决这个问题，并且siRNA-介导Bcl-2的敲除增强TCR介导的Ca2+高程。第二，Bcl-2是否与完整活细胞内的IP3R相互作用，或者之前通过共免疫沉淀证明的相互作用只在破细胞制剂中表现出来？为了解决这个问题，我们通过两种不同的Förster共振能量转移（FRET）方法证明Bcl-2和IP3R在完整细胞中相互作用。第三，Bcl-2对TCR诱导的钙的抑制作用2+Bcl-2与IP3Rs相互作用介导的升高和凋亡？为了解决这一问题，我们在IP3R上定位了一个Bcl-2相互作用位点，从而设计了一种抑制Bcl-2-IP3R相互作用的肽。该肽不仅逆转了Bcl-2对人工脂质双层IP3R通道开放的抑制作用，而且逆转了Bcl-2对TCR诱导的Ca的抑制作用2+细胞内的升高和凋亡，表明Bcl-2与IP3Rs的相互作用有助于Bcl-2对促凋亡钙的抑制作用2+信号。

结果

Bcl-2与细胞内IP3R相互作用

Bcl-2和IP3R之间的FRET是通过固定细胞中的受体光漂白来测量的，该方法测量了受体（YFP）光漂白对供体（CFP）发射的去猝灭作用(悍马等，2003年;Karpova等人，2003年;Li等人，2005年)和活体细胞中的三立方体FRET（双色比成像）(埃里克森等人，2001年). 在第一种方法中，YFP-IP3R 1型被用作受体，CFP-Bcl-2被用作供体(图1). 荧光蛋白被标记到两种蛋白的细胞质N末端(图1B). 当在COS-7细胞中瞬时表达时，使用相对低浓度的表达载体，CFPBcl-2和YFP-IP3R在ER上共定位，少量CFP-Bcl-2定位在线粒体上，没有YFP-IP2R（参见图S1在线提供）。选择CFP和YFP共存的区域进行FRET效率计算；因此，计算的FRET效率仅代表YFP融合和CFP融合共定位区域的效率，减少了CFP对线粒体的贡献2+传感器用作阳性对照(Miyawaki等人，1997年). CFP+YFP-IP3R、YFP+CFP-Bcl-2和CFP+YFP为阴性对照，同时靶向内质网细胞质面的CFP（ER-CFP）+YFP-IP3R。ER-CFP定位到ER(图S1)作为阴性对照，以排除CFP-Bcl-2和YFP-IP3R对产生的FRET仅仅是由于荧光标记蛋白在同一位置表达的可能性。用YFP激发荧光光光漂白30分钟后，CFP-Bcl-2+YFP-IP3R和CFP-YFP骆驼细胞的CFP通道荧光强度都增加，但阴性对照组没有增加(图1A). 通过逐像素计算从漂白后图像中减去漂白前图像，可以清楚地显示CFP供体去淬效果(图1A，CFP后漂白剂减去CFP预漂白剂）。YFP漂白后，YFP-IP3R+CFP-Bcl-2细胞的CFP信号平均增加28%±1%，CFP-YFP-cameleon细胞的CFP信号平均增加37%±0.6%(图1C). 阴性对照组CFP荧光没有明显增加。

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Bcl-2-IP3R相互作用的FRET检测

在表达CFP-Bcl-2+YFP-IP3R和CFP-YFP cameeon的COS-7细胞中，通过YFP漂白后CFP荧光增强检测到FRET，但不控制荧光标记蛋白的组合。

（A） YFP光漂白前后CFP荧光强度的代表性图像（左栏和中栏）。灰度值图像（右栏）是通过从漂白后图像中逐像素减去CFP预漂白图像得到的，相对强度差异用灰度表示。比例尺，5μm。

（B） Bcl-2和IP3R上CFP和YFP的C端子位置图。

（C） 在三个单独的实验中，从CFP和YFP共定位区域中随机选择多个感兴趣区域（每对样品>60）。利用Volocity软件根据CFP排放量的增加计算FRET效率。符号表示平均值±SEM。*p<0.01。

为了测量活细胞中的FRET，相同的荧光蛋白对在HEK293细胞中瞬时表达(图S2). 在活的HEK293细胞中，FRET发生在CFP-YFP骆驼细胞和CFP-Bcl-2+YFP-IP3R细胞中，但不发生在对照细胞中(图S2). 尽管这些结果的数量低于接受体光漂白方法获得的结果(活塞和克雷默斯，2007年)，表明FRET发生，提供证据表明Bcl-2-IP3R相互作用不仅存在于固定细胞中，也存在于活细胞中。

总之，考虑到FRET的技术局限性（见讨论），在固定细胞和活细胞中对FRET的测量表明，Bcl-2与完整细胞中的IP3R相互作用，验证了从细胞提取物中共同免疫沉淀这些蛋白所预测的相互作用。

内源性Bcl-2与IP3R相互作用并抑制TCR介导的Ca2+高程

Jurkat细胞用于测试内源性Bcl-2是否与IP3R相互作用并调节TCR介导的钙2+高程。Jurkat细胞中内源性Bcl-2的水平远低于WEHI7.2细胞[Bcl-2（+）WEHI7.2电池]中外源性表达的Bcl-2(图2A). 然而，Jurkat细胞中的Bcl-2也与IP3Rs共免疫沉淀(图2B)和siRNA介导的Bcl-2基因敲除(图2C)增强抗CD3诱导的钙2+标高(图2D和2E)表明Jurkat细胞Bcl-2对IP3介导的Ca的调节作用2+高程。此外，siRNA介导的Jurkat细胞中Bcl-2的敲除并没有改变thapsigargin诱导的Ca2+标高(图2F和2G)，表明降低内源性Bcl-2水平不会影响ER Ca2+浓度，这一发现与早期ER-Ca的间接和直接测量一致2+在Bcl-2中，WEHI7.2细胞过度表达（见讨论）。

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内源性Bcl-2抑制抗CD3诱导的钙2+Jurkat单元中的高程

（A） 通过免疫印迹法检测野生型WEHI7.2、Jurkat和Bcl-2（+）WEHI7.2细胞中的Bcl-2水平。

（B） Jurkat提取物中Bcl-2与IP3R的免疫共沉淀；使用抗Bcl-2抗体进行免疫印迹分析。

（C） 用非靶向对照siRNA（siNT）或Bcl-2 siRNA（siBcl-2）转染24和48小时后，Jurkat提取物中Bcl-2的免疫印迹。

（D） 数字成像轨迹（每个样本平均160个细胞）监测钙2+细胞外钙存在下20μg/ml抗CD3诱导的升高2+.

（E） 峰值Ca2+20μg/ml抗CD3在细胞外Ca存在下诱导的升高2+（平均值±SEM，三个实验）。

（F） 峰值Ca2+100 nM thapsigargin诱导的升高，在缺乏细胞外钙的情况下进行荧光测量2+（平均值±SEM，三个实验）。

（G） 胞浆Ca下面积2+340 nM/380 nM比值曲线（F）（平均值±SEM，三个实验）。

总之，Jurkat T细胞内源性Bcl-2与IP3R相互作用并调节IP3介导的Ca2+升高缓解了先前报道的TCR诱导的钙抑制的担忧2+Bcl-2升高可能与克隆选择或与外源表达相关的高Bcl-2水平有关。此外，这些发现使我们能够在接下来的实验中研究外源性和内源性表达的Bcl-2。

Bcl-2与IP3R的调节和耦合域相互作用

三种IP3R亚型在不同细胞类型的功能特性、表达模式和亚细胞定位方面存在差异(Bezprozvanny，2005年;Vermassen等人，2004年). 每个IP3R单体都有一个细胞质区域，该细胞质区域包含一个IP3结合域、一个靠近N末端的抑制和耦合域以及IP3结合和通道域之间的内部调节和耦合域，而C末端IP3R尾部包含一个门控域(图3A) (Taylor等人，2004年;Uchida等人，2003年).

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Bcl-2-IP3R交互映射

（A） 类型1 IP3R域图。

（B和C）GST-IP3R片段下拉，使用来自Bcl-2（+）WEHI7.2或Jurkat细胞的细胞溶质提取物作为Bcl-2来源。（上面板）考马斯蓝染色凝胶，显示输入GST-IP3R片段；（底部面板）免疫印迹法检测Bcl-2。代表使用Bcl-2（+）WEHI7.2提取物的五个实验和使用Jurkat提取物的两个实验的结果表明，Bcl-2主要与结构域3相互作用。

（D） 在三种不同的缓冲液中制备Bcl-2（+）WEHI7.2细胞的细胞提取物，这三种缓冲液主要因洗涤剂类型和浓度而异。在GST-IP3R下拉和清洗步骤中使用了相同的缓冲液，但在缓冲液2中和缓冲液3中添加了1%的BSA，并且在结合步骤中将NaCl浓度增加到300 mM，以提高结合特异性。此外，清洗步骤用缓冲液1重复三次，但用缓冲液2和3重复七到八次。（上面板）GST-IP3R片段的考马斯蓝染色，重复两次，结果相同。

（E） GST下拉，如（B）所示，使用GSTIP3R子域片段3a、3b、3a1和3a2。（上面板）记录IP3R片段输入水平的抗-GST免疫印迹。（下图）抗Bcl-2免疫印迹，证明亚结构域3a1是Bcl-2在IP3R上的主要结合区。这个实验重复了两次，结果相同。

（F） 表明His-tagged Bcl-2纯度的银染凝胶。

（G） GST下拉，带有纯化的His-tagged Bcl-2。（上面板）输入经SDS-PAGE解析并用考马斯蓝染色的GST-IP3R片段。（底部面板）Bcl-2免疫印迹显示纯化的30kDa His-Bcl-2直接与GST-IP3R结构域3相互作用，重复三次，结果相同。

为了确定Bcl-2在IP3R上的相互作用位置，我们使用了一系列GST-IP3R融合构建物，这些构建物对应于5个覆盖第一个N末端2216氨基酸的片段和1个对应于小鼠IP3R 1型最后160个氨基酸的片段(图3A) (Lee等人，2006年). 这些片段位于细胞质中，与有限的蛋白质水解产生的“天然”结构域一致(Yoshikawa等人，1999年). 跨膜结构域不包括在内。纯化后，片段作为单个显著带迁移，与预期分子量相对应(图3B和3C)，尽管检测到一些轻微的降解产物。

第一组GST下拉实验利用Bcl-2（+）WEHI7.2细胞和Jurkat细胞的提取物作为Bcl-2的两个独立来源。细胞提取物与预先结合到谷胱甘肽sepharose树脂的GST-IP3R片段孵育，GST-IP3片段的负载量相等（上面板，图3B和3C). 下拉后，通过免疫印迹法检测与IP3R结构域结合的Bcl-2（下面板，图3B和3C)表明每个细胞源的Bcl-2主要与IP3R域3相互作用。这些实验总共重复了五次，结果相同。值得注意的是，在细胞提取物与GST-IP3R片段在谷胱甘肽琼脂糖树脂上孵育后，对树脂进行了大量清洗（见实验程序）。

Bcl-X的相互作用L（左）之前曾报道过IP3R 1的域6(怀特等人，2005年)，但只测试了三个IP3R片段：一个N末端片段（aa 1–600）；C末端片段（aa 2512–2750）；以及一个较大的片段，Δ1–600，包含调控和耦合域以及C末端。因此，在这些映射的基础上研究Bcl-X的潜在相互作用L（左）/调控和耦合域内的Bcl-2未进行正式测试。此外，GST下拉实验采用的严格条件低于本研究中的严格条件。因此，我们比较了三种不同缓冲条件下Bcl-2与结构域3和6的相互作用，包括上述实验中使用的相同缓冲/清洗条件（缓冲2）、怀特等人（2005）（缓冲剂1）和使用CHAPS洗涤剂而不是其他两种缓冲剂中使用的非离子洗涤剂的缓冲剂（缓冲剂3）(图3D). 考虑到早期报告中非离子洗涤剂影响Bcl-2家族成员的相互作用，纳入了后一项控制(徐和友乐，1997). 在较低的严格条件下（缓冲液1，0.05%Triton，三次洗涤），结构域6可能与Bcl-2相互作用；然而，在所有三种缓冲条件下，域3与Bcl-2的相互作用比域6的相互作用更为显著。因此，Bcl-2可能与这两个IP3R区域相互作用，但由于与域3相互作用的显著性，我们选择进一步分析域3、子域3a（aa 1347–1496）和3b（aa 1499–1649）的较小片段，以进一步缩小Bcl-2结合区域。这些片段对应于先前发表的调节和偶联结构域的较小片段(Sienart等人，1997年) (图3A). 我们发现Bcl-2与80个氨基酸亚结构域3a1（aa 1347–1426）的相互作用最强(图3E). 因此，该亚结构域被用于开发抑制肽，使用该肽的实验进一步证实了亚结构域3a1对Bcl-2和IP3R之间的相互作用的贡献（如下）。

为了确定Bcl-2是否与IP3R直接相关，使用纯化的His-tagged全长Bcl-2进行GST下拉实验(图3F). 这种蛋白质保留了结合Bim和Bax的能力(图S3)如之前针对GST-Bcl-2的报告所述(Bassik等人，2004年). 我们的发现在三个单独的实验中得到证实，表明纯化的His-tagged Bcl-2也与GST-IP3R结构域3片段相互作用(图3G). 因此，Bcl-2在体外直接与IP3R相互作用。

在初步实验中，我们发现从Bcl-2中删除BH4结构域会阻止Bcl-2与IP3R的相互作用（数据未显示）。因此，我们筛选了BH4结构域中的一系列双齿类突变，发现突变的氨基酸6和7消除了Bcl-2-IP3R相互作用(图S4A和S4B)并取消了Bcl-2对抗CD3诱导的钙升高的抑制作用(图S4C). 这些数据表明，Bcl-2-IP3R相互作用对于Bcl-2对钙的抑制作用是必要的，以下证据进一步证实了这一结论，这些证据使用了一种抑制Bcl-2-IP 3R相互反应的抑制肽。

一种IP3R肽抑制Bcl-2-IP3R相互作用

由于IP3R结合区域缩小到80个氨基酸亚结构域3a1（aa 1347–1426），我们根据不同IP3R亚型之间该区域的同源性设计了两个20氨基酸肽（肽1，aa 1365–1384；肽2，aa 1389–1408）(图4A). 此外，优先考虑具有β-转角和/或α-螺旋结构的区域，而不是随机线圈或非结构序列，预计其中一个或两个肽可以抑制Bcl-2-IP3R相互作用。此外，由于域3a1的C末端区域的可访问性较低且二级结构不可预测，因此未选择该区域（Invitrogen PeptideSelect Design Tool）。肽2的扰乱序列也被合成并用作对照(图4A). 利用Bcl-2（+）WEHI7.2提取物作为Bcl-2的来源，在GST下拉实验中初步测试了肽对Bcl-2-IP3R相互作用的影响(图4B). 肽（200μM和1 mM）与Bcl-2（+）WEHI7.2细胞提取物和谷胱甘肽sepharose上的GSTIP3R结构域3孵育。200μM或1 mM肽2显著降低了结合Bcl-2的量，而对照肽没有降低。在1 mM时，肽1部分抑制了相互作用，但不如肽2有效。在使用Bcl-2（+）WEHI7.2细胞的共免疫沉淀试验中，也检测到肽2对Bcl-2-IP3R相互作用的抑制作用(图4C和4D)和Jurkat细胞(图4E). 肽2（400μM）持续抑制Bcl-2-IP3R相互作用，而对照肽和肽1不抑制相互作用(图4C-4E). 这些结果在多次实验中得到了证实。作为特异性的对照，肽2干扰Bcl-2-IP3R相互作用，但不干扰Bcl-2与BH3-only蛋白Bim的相互作用(图4F和4G).

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IP3R肽抑制Bcl-2-IP3R相互作用但不抑制Bim-Bcl-2相互作用

（A） 肽1和2的序列，对应于IP3R亚结构域3a1内的区域，以及代表肽2的混乱序列的控制肽。（B） 在GST下拉分析中，肽2抑制Bcl-2和GST-IP3R结构域3之间的相互作用。将Bcl-2（+）WEHI7.2细胞提取物与200μM或1 mM肽预孵育20 min，然后添加带有GST-IP3R结构域3片段的谷胱甘肽sepharose树脂。（C和E）IP3R在400μM肽存在下从Bcl-2（+）WEHI7.2细胞（C）或Jurkat细胞（E）的提取物中免疫沉淀。肽2，而不是肽1或对照肽，抑制Bcl-2-IP3R共免疫沉淀。（D） 三个GST下拉实验中Bcl-2免疫印迹信号强度的总结与（C）相同（平均值±SEM）。（F） 在400μM多肽存在下，从Bcl-2（+）WEHI7.2细胞提取物中免疫沉淀Bcl-2，并通过抗Bim免疫印迹检测Bim的共免疫沉淀。控制肽和肽2均不干扰Bcl-2-Bim相互作用。（G） 三个实验中的Bim免疫印迹信号强度总结与（F）相同（平均值±SEM）。

肽2逆转Bcl-2对IP3R通道开放的抑制作用

在稳态条件下，分析了肽2和纯化的Bcl-2对平面脂质双层中IP3R通道活性的影响。在存在2μM IP3和250 nM Ca的情况下，单个IP3R 1型通道活性被可视化为一系列离散的正电流波动2+在中顺式隔室（通道的细胞质侧）(图5A). 在IP3R通道的细胞质表面添加0.1μM纯化的Bcl-2后，观察到单通道活性显著降低(图5A和5B)，并且添加10μM肽2逆转了Bcl-2对通道活性的抑制作用(图5A). 通过多次重复实验计算了不同条件下的平均打开概率(图5C). 添加Bcl-2将IP3R开启概率降低了11.5倍，达到0.018。肽2逆转了Bcl-2的抑制作用，将开放概率增加到0.16，而对照肽没有逆转Bcl-2对通道活性的抑制作用(图5C). 这些结果表明，在纯化的体外系统中，肽2逆转了Bcl-2对IP3R通道开放的抑制作用，表明肽2直接作用于Bcl-2-IP3R相互作用以逆转Bcl-2的通道开放抑制作用。

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肽2逆转Bcl-2对IP3R通道开放的抑制作用

（A） 具有250 nM Ca的平面脂质双层在0 mV下的IP3R 1型单通道记录2+和2μM IP3顺式（细胞溶质）室（标记为零电流水平）。底部面板中显示了扩展时间刻度的电流记录道。纯化的Bcl-2（0.1μM），添加到顺式隔间，通道活动受阻。随后添加肽2（10μM）逆转了Bcl-2对通道活性的抑制。

（B） 所示为单通道记录，记录添加Bcl-2后不到3分钟内检测到通道活性显著降低。

（C） 测量Bcl-2和肽对IP3R通道开放概率影响的多项实验（平均值±SEM）总结。n=检查的单个通道数量。符号表示平均值±SEM。*p<0.05。

肽2逆转Bcl-2对TCR诱导钙的抑制作用2+高程

接下来我们研究了肽2是否也能逆转Bcl-2对钙的抑制作用2+通过前面描述的Bcl-2（+）和（−）WEHI7.2克隆中的IP3R释放(Chen等人，2004年)，新衍生的WEHI7.2外源性表达Bcl-2和Jurkat细胞的混合群体。初步实验确定了肽释放和抗CD3浓度的最佳条件。肽在脂质双层中的传递率为100%，而肽2对细胞的渗透性要小得多，这说明肽在细胞中的作用较小。因此，使用战车递送试剂将较高浓度的肽（60μM）递送至细胞。细胞质钙2+在抗CD3治疗期间，通过数字成像在单细胞水平上连续测量浓度。代表Ca2+Bcl-2（+）WEHI7.2细胞的痕迹如所示图6A和平均Ca2+七个实验中抗CD3诱导的升高总结如下图6B观察到的滞后期变化至少部分归因于淋巴细胞仅与盖玻片松散粘附，因此在抗体添加期间不可能进行快速缓冲液交换。肽2增强抗CD3诱导的Ca2+Bcl-2（+）WEHI7.2细胞升高40%。对照肽和肽1不能增强抗CD3诱导的Ca2+高程。在Bcl-2（−）细胞中，肽2对钙没有显著影响2+(图6B). 同样，肽2显著增强了抗CD3诱导的Ca2+Jurkat细胞升高，而对照肽和肽1没有升高(图6C和6D). 肽2对钙无影响2+在没有查里奥试剂的情况下添加到细胞中时升高。此外，肽2没有增强抗CD3诱导的钙2+Jurkat细胞中内源性Bcl-2水平被siRNA敲低，从而进一步证实了肽2对Ca的影响2+取决于其中断Bcl-2-IP3R相互作用的能力(图S5). 此外，肽2不影响细胞内钙2+在没有抗CD3刺激的情况下的水平（数据未显示）。Jurkat细胞中的低Bcl-2水平和Bcl-2（−）WEHI7.2细胞中几乎检测不到的内源性Bcl-2与钙的高振幅和长持续时间相一致2+与Bcl-2（+）WEHI7.2细胞相比，这些细胞的反应（比较图6A和6B到图6C和6D). 因此，肽2调节抗CD3诱导的钙2+Bcl-2（+）WEHI7.2细胞和Jurkat细胞中的升高，与肽2破坏Bcl-2-IP3R相互作用的能力一致。

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肽2逆转Bcl-2对抗CD3诱导钙的抑制作用2+高程

（A） 代表性Ca2+记录抗CD3（箭头，添加时间）诱导Ca的示踪（每个为−65细胞的平均值）2+Bcl-2（+）WEHI7.2细胞升高。Chariot试剂促进了肽（60μM）的摄取。

（B） 抗CD3诱导的Ca峰值2+用（A）中的肽处理的Bcl-2（−）和Bcl-2。

（C） 代表性Ca2+Jurkat细胞中的痕迹（平均每个细胞85个）。处理条件与（A）中相同，只是添加了一个涉及添加肽2而不添加Chariot试剂的对照。

（D） 抗CD3诱导Ca峰值2+如（C）中用肽处理的Jurkat细胞中的升高（平均值±SEM，七个实验，每个实验每个样品平均81个细胞）。

为了排除肽2可能干扰上游TCR激活途径的可能性，细胞发酵剂IP3酯（D-myo InsP三六丁酰氧基甲酯）用于绕过TCR激活和抗CD3诱导的IP3生成。肽2增强IP3酯类诱导的钙2+Jurkat细胞升高(图S6A和S6B)表明肽2在IP3R水平发挥作用，而不是干扰TCR信号通路的上游成分。

肽2直接作用于Bcl-2-IP3R相互作用的结论不仅得到了上述实验的支持(图5)其中肽2在体外逆转了Bcl-2介导的IP3R通道开放抑制，但也通过单向作用45钙2+通量实验(图S6D和S6E)可以非常准确地量化钙2+通过位于内质网的IP3R释放。这些实验需要牢固的粘附细胞，因此需要小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），其内源性Bcl-2水平略低于Jurkat细胞(图S6C)，名员工。IP3诱导率45钙2+流出量是在有thapsigargin存在的情况下测量的，Thapsijargin可以完全阻止ER-Ca2+重新摄取。肽2（而非对照肽）显著增加了45钙2+流出，流出(图S6D和S6E)确认肽2在ER水平发挥作用，逆转Bcl-2对IP3R活性的抑制。

肽2增强TCR诱导的细胞凋亡

TCR诱导的细胞凋亡由钙介导2+通过IP3R从内质网释放，如上所述，Bcl-2通过抑制IP3介导的Ca抑制TCR诱导的凋亡2+释放(Zhong等人，2006年). 由于肽2逆转Bcl-2对钙的抑制作用2+我们接下来研究肽2是否也减弱Bcl-2对抗CD3诱导的凋亡的抑制作用。用Chariot试剂将肽导入Bcl-2（+）WEHI7.2细胞。3小时后，用抗CD3抗体处理细胞，24小时后测量凋亡细胞的百分比。在Bcl-2（−）WEHI7.2细胞中，抗CD3诱导了−18%的凋亡细胞，而Bcl-2过度表达的Bcl-2(图7B). 肽2使抗CD3诱导的Bcl-2（+）WEHI7.2细胞凋亡增加2倍，而对照肽没有显著作用。

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肽2增强Bcl-2阳性细胞中抗CD3诱导的细胞凋亡

（A） 5μg/ml抗CD3治疗Jurkat细胞24小时后典型的凋亡核形态（箭头，Hoechst 33342染色）。比例尺，10μm。

（B） 将Bcl-2（−）和Bcl-2。

（C） Jurkat细胞预先孵育±60μM肽±Chariot试剂，然后与5μg/ml抗CD3孵育24小时。符号表示五个实验中具有凋亡细胞核的细胞百分比（平均值±SEM）（每份盖玻片计240个细胞）。

肽2还减弱了Bcl-2对抗CD3诱导Jurkat细胞凋亡的抑制作用。在初步研究中（数据未显示），我们测试了几种抗CD3浓度。更高浓度的抗CD3诱导高水平的细胞凋亡，这可能掩盖肽的作用。因此，我们使用5μg/ml抗CD3，足以诱导20%-30%的细胞凋亡。肽2将抗CD3诱导的细胞凋亡提高到40%-45%，而对照肽、肽1或肽2在不含Chariot试剂的情况下对抗CD3诱发的细胞凋亡没有影响(图7A和7C). 与肽2在抗CD3诱导的细胞凋亡中的作用相反，肽2没有增强Fas诱导的Ca2+-Jurkat细胞的独立凋亡(图S5B).

总之，与肽2对Bcl-2-IP3R相互作用和抗CD3诱导的Ca的影响一致2+肽2升高可增强抗CD3诱导的Jurkat细胞和Bcl-2（+）WEHI7.2细胞凋亡。在考虑这些发现时，重要的是要记住，Bcl-2也通过与BH3-only蛋白质结合来抑制凋亡，并且肽2的作用选择性地中断Bcl-2-IP3R相互作用，而不是Bcl-2与BH3-onely蛋白质的相互作用（参见图4F). 因此，预计肽2只能部分逆转Bcl-2的抗凋亡活性。

讨论

在这里，我们使用FRET测量记录了完整细胞内Bcl-2-IP3R的相互作用，并绘制了IP3R上Bcl-2相互作用的位置，从而开发了一种抑制肽，用于确定Bcl-2-IP 3R相互作用在调节Ca中的重要性2+信号。该肽被称为肽2，对应于IP3R亚结构域3a1中的20个氨基酸序列，该序列在所有三种IP3R异构体中都显示出高度同源性。用于绘制Bcl-2结合区域的GST-IP3R结构域表示折叠良好的结构成分，保留了大量IP3诱导的Ca2+只要它们保持组装状态，体外释放活性(Uchida等人，2003年;Yoshikawa等人，1999年). 因此，在我们的实验中确定的Bcl-2和子域3a1之间的相互作用可能与自然情况下发生的相互作用相对应。在使用Bcl-2（+）WEHI7.2细胞和内源性表达Bcl-2的Jurkat细胞进行的GST下拉和共免疫沉淀实验中，肽2抑制这种相互作用的能力证实了该IP3R亚结构域对Bcl-2与IP3R的相互作用至关重要。此外，肽2在Jurkat细胞中的这种作用与同样在这里提出的证据一致，即内源性表达的Bcl-2与内源性表达IP3R相互作用。这些发现缓解了Bcl-2-IP3R相互作用可能依赖于高水平Bcl-2过度表达的担忧。

域3a1是Bcl-2相互作用的区域，位于IP3R的调节和耦合域，将配体结合信号从N端IP3结合域转移到C端通道域。此域还用于保持未激活的IP3R通道关闭(Bezprozvanny，2005年;Nakayama等人，2004年;Szlufcik等人，2006年)并包含许多IP3R活动监管机构的目标站点(Patterson等人，2004年;Foskett等人，2007年). 此外，最近的电子显微镜发现表明，IP3R类型1调节和耦合域开关IP3R状态中的构象变化介于“风车”状和“方形”状结构之间，这可能分别代表“开放”和“封闭”通道(Hamada等人，2003年;Serysheva等人，2003年;Taylor等人，2004年). 因此，有趣的是可以推测，该区域Bcl-2的结合可能调节这种构象变化，从而调节IP3R通道的开放。

肽2作为Bcl-2-IP3R相互作用抑制剂的发展为研究Bcl-2抑制Ca的基本机制提供了一个有用的工具2+在分子水平上从内质网释放。为此，我们在多种实验策略中使用了肽2，以消除Bcl-2与IP3R的相互作用有助于Bcl-2抑制IP3介导的ER-Ca的任何疑问2+释放。首先，肽2在体外逆转了Bcl-2对IP3R通道开放的抑制作用。其次，当使用Chariot试剂将肽2引入细胞时，逆转Bcl-2对TCR介导的Ca2+Bcl-2（+）WEHI7.2细胞和Jurkat细胞均升高。这些发现表明Bcl-2抑制促凋亡钙2+至少部分通过与IP3R的交互发出信号。第三，特别注意控制肽2可能在细胞中以IP3R本身以外的其他水平发挥作用的外部可能性（例如，IP3R上游的TCR信号通路）。为此，我们证明肽2拮抗了两种单向45钙2+渗透细胞内质网流出和IP3酯化钙2+完整细胞中的升高。因此，本研究结果提供了强有力的证据，证明Bcl-2-IP3R相互作用是Bcl-2抑制IP3-介导的Ca的过程的重要组成部分2+从ER中释放。

该过程的一个拟议组成部分是Bcl-2在调节ER-Ca中的作用，但尚未完全达成一致2+注意力，最近评论中讨论的一个话题(Distelhorst and Shore，2004年;Giacomello等人，2007年;Pinton和Rizzuto，2006年;Rong和Distelhorst，2008年). 在我们早期的工作中(Chen等人，2004年)在本研究中，以及其他实验室的研究结果（见引言），Bcl-2导致ER-Ca下降2+未检测到浓度。然而，之前报道的检测到Bcl-2引起的Ca下降2+其他人的浓度和我们目前关于Bcl-2与IP3R相互作用的研究结果不一定相互排斥。事实上，最近的报告提出了Bcl-2-IP3R相互作用在调节ER-Ca中的作用2+浓度(Oakes等人，2005年)表明Bcl-2降低ER-Ca的能力2+浓度取决于Bcl-2磷酸化状态(Bassik等人，2004年)三种IP3R亚型中哪一种表达(Li等人，2007年). 总的来说，当前工作的主要重点不是重新检查Bcl-2对ER-Ca的潜在影响2+浓度，但在Bcl-2-IP3R上，并设计一种肽抑制剂来逆转Bcl-2对钙释放和凋亡的抑制作用。这些发现证明了Bcl-2是否降低ER-Ca2+浓度。

当肽2被引入完整的细胞中时，它可以逆转Bcl-2对TCR或细胞渗透性IP3酯类诱导的Ca的抑制作用2+升高表明先前通过细胞提取物中的共免疫沉淀检测到的Bcl-2-IP3R相互作用确实发生在完整的细胞内。FRET测量进一步证实了这一结论。已知Bcl-2定位于内质网和线粒体，但IP3Rs主要定位于内层网，Bcl-2对IP3介导的Ca的抑制作用2+在Bcl-2选择性靶向内质网的细胞中观察到升高(Chen等人，2004年). 此处报告的FRET测量记录了Bcl-2与ER上IP3R的相互作用，尽管FRET技术具有挑战性，并且存在公认的缺陷和局限性(活塞和克雷默斯，2007年). 因此，在这项工作中，我们采用了两种不同的、独立的FRET测量方法，即固定细胞中的受体光漂白和活细胞中的直接FRET测量，作为确定Bcl-2是否与细胞中的IP3R相互作用的互补方法。此外，由于这两种方法的已知局限性，还包括了一套严格的控制措施。检测FRET最直接的方法是对受体进行光漂白并监测施主发射的变化。对于这种方法，实际FRET信号和FRET效率可能被高估，这取决于使用的条件（例如固定）(Rizzo等人，2006年). 因此，目前受体光漂白实验中FRET效率的量化仅适用于确定FRET的存在与否(Karpova等人，2003年). 许多阴性对照降低了假阳性FRET的可能性。虽然比率成像活细胞FRET是最简单的FRET方法，但必须考虑由于光谱泄漏而产生的潜在伪影。我们在活细胞FRET测量中使用的校正比率法已经建立，以减去荧光蛋白之间的串扰（参见附录埃里克森等人，2001年). 虽然实际FRET值取决于与供体蛋白相互作用的受体蛋白的确切数量，但在这里使用的两种方法中，供体和受体浓度没有必要相等(埃里克森等人，2001年;活塞和克雷默斯，2007年). 然而，根据实验条件，CFP-Bcl-2和YFP-IP3R的浓度没有显著变化。我们的数据表明，供体和受体对相互作用的距离和方向足够近，从而允许FRET。考虑到这些预防措施，两种FRET技术都提供了积极证据，证明Bcl-2确实与细胞内的IP3R相互作用。

总的来说，这里的研究结果表明，Bcl-2在两个方面发挥作用，即阻断BH3-only蛋白活性和阻断促凋亡钙2+信号。最近开发的Bcl-2拮抗剂靶向Bcl-2-BH3-only蛋白质相互作用，而肽2选择性干扰Bcl-2-IP3R相互作用。也许在未来，可以开发出后一种相互作用的小分子抑制剂，以模拟肽2的活性，并补充靶向Bcl-2与仅BH3蛋白质相互作用的小型化合物的治疗活性。

实验程序

试剂

Fura-2 AM和Hoechst 33342来自Invitrogen。仓鼠抗鼠CD3eε链单克隆抗体和鼠抗仓鼠IgG1来自BD Biosciences。小鼠抗人CD3e IgG购自eBioscience。D-myo-IP3酯由圣安德鲁斯大学S.J.Conway合成(Conway等人，2006年).

质粒

IP3R片段在其N端与GST融合并克隆到pGEX-6p2载体中(Lee等人，2006年;Sienart等人，1997年). 其他质粒及其来源如下：pECFP-Bcl-2，J.Yuan；CFP-YFP cameleon，R.Tsien；Bcl-2突变体，T.Parslow；ER-CFP（SRbeta-mCerulean）、F.耿和D.Andrews。

细胞培养和转染

如前所述，培养COS-7细胞和WEHI7.2细胞（野生型WEHI7.2、Bcl-2-过度表达WEHI7.2[Bcl-2（+）WEHI7.2]和转染空载体[Bcl-2-（−）WEHI7.2]的WEHI7.2(Chen等人，2004年). Jurkat细胞在添加10%胎牛血清的RPMI1640中培养。用罗氏公司的FuGENE 6在COS-7细胞中进行转染。先前报道了Bcl-2在WEHI7.2细胞中的转染和克隆(Chen等人，2004年).

烦恼

将编码CFP和YFP标记蛋白组合的质粒瞬时转染到COS-7细胞或HEK293细胞。对于受体光漂白FRET，转染24小时后将COS-7细胞固定在4%多聚甲醛中10分钟。每个FRET对样品通过受体光漂白和改进的三立方FRET方法进行测量（参见补充数据).

蛋白质表达与GST下拉

GST-IP3R片段按所述进行表达和纯化(Lee等人，2006年;Sienart等人，1997年). 用RIPA缓冲液（50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1%NP-40、0.5%脱氧胆酸钠、1 mM-NaF、1 mM/Na）对WEHI7.2细胞进行裂解三人事军官4和蛋白酶抑制剂鸡尾酒[Roche]）。含有300μg总蛋白的上清液（250μl）用25μl sepharose珠（Amersham Biosciences）预先过滤1小时，然后造粒以去除珠。将10至20微克的每个GST-IP3R片段连接到一批25μl的新鲜琼脂糖珠上，并在4°C下与预分离的细胞上清液孵育1小时。下拉分析中使用的每个GST-IP3R片段的数量调整到类似的水平。为了减少非特异性结合，将1%BSA添加到下拉反应中，在结合步骤中将NaCl浓度调整为300 mM。珠离心，用RIPA缓冲液彻底清洗7至8次，用谷胱甘肽洗脱缓冲液洗脱，并准备进行western印迹。

在某些实验中，比较了三种不同浓度的缓冲和洗涤条件。上述缓冲/清洗条件称为缓冲液2，除用1%CHAPS替换1%NP40外，相同的缓冲/清洗被称为缓冲区3。缓冲区1缓冲/清洗条件，之前用于怀特等人（2005）由PBS、2%甘油、0.05%Triton和蛋白酶抑制剂混合物组成。在不添加BSA或其他NaCl的情况下，使用该缓冲液制备细胞裂解物、珠结合和三次洗涤。

将带有His标签的全长Bcl-2克隆到pPROEX-1载体中，并在大肠杆菌M15细胞。使用Ni-NTA自旋（QIAGEN）纯化His-Bcl-2蛋白，方法如上所述(Lam等人，1998年). 进一步透析洗脱的Bcl-2蛋白以去除微量CHAPS和咪唑，然后用SDS-PAGE进行表征，然后进行银染和western印迹。

免疫沉淀和Western印迹

免疫共沉淀法已在前面描述(Chen等人，2004年). 使用了以下抗体：抗人Bcl-2（BD Biosciences）、抗鼠Bcl-2型（Santa Cruz Biotechnology）、抗IP3R 1型（Calbiochem）、抗Bim（Sigma）、抗Bax（BD PharMinen）、抗GST（Amersham Biosciences）和抗肌动蛋白（Sigma-）。在肽抑制免疫沉淀实验中，108用500μl裂解缓冲液对细胞进行裂解。在免疫沉淀之前，将细胞裂解物的上清液与肽在4°C下孵育30分钟。

肽合成与输送

经质谱和HPLC验证，合成肽的纯度大于95%。根据制造商的说明，每种肽都通过Chariot（活性Motif）试剂输送到细胞中。将肽与Chariot试剂混合，在25°C下培养30分钟，然后添加到10的悬浮液中6OPTI-MEM（Invitrogen）中肽浓度为60μM的细胞。孵育30分钟后，将另一种1.6 ml培养基加入培养皿中，将肽终浓度稀释至−20μM。细胞在5%CO中再培养2-3小时2Ca前37°C2+测量值。

IP3R通道活性的平面脂质双层分析

如前所述，制备用于双层实验的微粒体(Bare等人，2005年). 双层实验的详细方法在补充数据.

钙2+成像和荧光测量

轻轻地将抗小鼠CD3、抗人CD3抗体（20μg/ml）或IP3酯（25μM）添加到缓冲层覆盖的聚-L-赖氨酸涂层盖玻片中，盖玻片上粘附细胞并装载Fura-2 AM2+成像和钙2+前面详细描述了荧光测量法(Chen等人，2004年;Zhong等人，2006年).

RNA干扰

Jurkat细胞在BioRad基因脉冲发生器中以最终浓度为1 mM的非靶向智能池或来自Dharmacon的人类Bcl-2智能池进行电穿孔。然后在转染后0、24、48和72小时以及3×105在每个时间点，细胞被镀到聚赖氨酸涂层盖玻片上，以测量钙2+。细胞每24小时分裂一次，以确保最佳生长条件。

抗CD3诱导的细胞凋亡

用5μg/ml抗人CD3处理Jurkat细胞和20μg/ml仓鼠抗鼠CD3加抗仓鼠IgG处理WEHI7.2细胞24小时后，用10μg/ml Hoechst 33342对细胞染色10分钟，用40倍荧光显微镜检测典型的凋亡核形态(Zhong等人，2006年).

统计分析

数据汇总为平均值±SEM，并使用重复测量的双尾Student t检验进行比较。平均值之间的差异在95%水平上具有统计学意义（p<0.05）。

补充材料

1

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致谢

我们感谢钱学森（Roger Tsien）、袁俊英（Junying Yuan）、崔斯特拉姆·帕斯洛（Tristram Parslow）、费耕（Fei Geng）、大卫·安德鲁斯（David Andrews）和斯图亚特·康威（Stuart J.Conway）提供的质粒和试剂。我们感谢Susann Brady-Kalnay、Anthony Berdis、George Dubyak和William Schilling的有益讨论。我们还感谢癌症中心成像核心Minh Lam的共焦显微镜检查。这项工作得到了NIH拨款CA085804和CA42755（C.W.D.）、HL80101和MH53367（G.A.M.）、研究基金会研究计划G.0604.07（给H.D.S.和J.B.P.）以及皇家学会奖学金（给H.L.R.）的支持。G.B.是研究基金会的博士后研究员。

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