最近的大量数据表明，蛋白质，尤其是小的快速折叠（亚微秒）蛋白质(1–三)，具有一定程度的能量挫败感的序列足以减少其整体能量景观(4–8)类似于一个中等粗糙的漏斗(9). 景观粗糙度对应于由几何（拓扑）和能量陷阱引起的局部自由能极小值(10). 几何或拓扑圈闭与链状连接性和原生褶皱的形状有关，当正确的接触过早形成时就会发生(10). 由于能量粗糙度最小，过渡态系综（TSE）中观察到的结构异质性受到拓扑效应的强烈影响，拓扑效应在很大程度上可以从本征结构中推断出来(11–16). 这解释了为什么简单的能量无阻尼（类G o-like）模型(17)再现了TSE和/或大量真实蛋白质中间产物的整体几何特征的几乎所有实验结果，这些中间产物是二态或三态文件夹(13). 这些模型最近被推广到包括捕获效应的能力，例如疏水核心的去溶剂化(14).
利用这个理论框架，可以使用两个排序参数来描绘漏斗景观与微观去溶作用：Q，自然接触形成总量的一部分，以及伪Q，单一水分离自然接触形成总额的一部分(14). 后者是使用具有特征去溶剂化势垒的成对势的直接结果，这解释了在完全接触之前在两个相互作用的非极性基团之间排出单个水分子的熵成本(14,18–20). 虽然模拟中没有明确的水分子，但这种脱溶屏障的出现模拟了溶剂的颗粒特性。通过使用这个模型，我们最近预测SH3的折叠是由结构搜索坍塌和疏水核的去溶剂化控制的(14).
在实验上，φ值分析是探索TSE本质的最佳工具(21). 原则上，用于检测蛋白TSE的突变涉及到Ala或Gly的突变。这背后的原因是避免了新的相互作用，并且溶剂化变化相对最小(21)，可能是因为疏水残基部分埋藏在变性状态下，解释了逆疏水效应(22). 使用这些类型突变的几项研究提供了丰富的信息，这些信息与理论上预测的大量真实蛋白质TSE的全局几何特征非常一致(12). 一个更有趣的突变，Val→Thr，不会破坏蛋白质包装的核心，但会稳定未折叠状态，从而使蛋白质不稳定(23). 因此，在计算模拟中，通过用极性Thr替换核心疏水残基Val，这种接触的净稳定性将降低；虽然在本机结构中范德瓦尔斯相互作用对这两者来说都是相同的，但在展开系综中，Thr要稳定得多。
本文将α-spectrin SH3核心中几个Val→Thr突变折叠速率变化的理论预测与实验测量结果进行了比较。这些预测是在事先不知道测量速率的情况下做出的。从实际角度来看，α-spectrin SH3是一个可行的分析平台，因为：(我)它是一个简单的两状态文件夹(24)其TSE已被各种突变彻底研究(25,26). (ii（ii）)它在不同位置有大量疏水残基，尤其是在核心区域（九个疏水核心残基中有五个是缬氨酸，可以被苏氨酸等位取代）。(三)其大小易于在合理的壁时间尺度内进行折叠模拟（折叠成正交β-三明治球状蛋白的62倍多肽）(27).
尽管使用了上述简单的蛋白质模型，但理论和实验之间的定性一致性已经很好。这一最初的成功鼓励了对这些宏观现象背后的分子细节的进一步研究。
结果和讨论
借助Val→Thr突变探索TSE。因为我们对溶剂化引起的稳定性变化感兴趣，所以基于掩埋非极性残基突变为极性残余物（有利于未展开态）的策略很有吸引力(21). 由于这两种残基具有相似的体积，因此具有相似的核心填充结构，因此采用刚才描述的系统地将埋藏缬氨酸突变为等位苏氨酸的方法来研究疏水核心的动力学。
这些突变的残基（9、11、23、44、46、53、58，分布在不同的β链上）向内指向核心（Val-46除外）()并被假定在折叠状态下不会产生任何新的相互作用，可能位置58除外。在位置58，可能有一个新的氢键连接到Ala 55的CO基团上()无法检测到。在计算上，我们还可以通过交互作用的逻辑设计来模拟Val→Thr的突变，这些交互作用不会破坏原生褶皱，只会改变这种接触的净稳定性（参见支持文本，作为支持信息发布在PNAS网站上）。
α-spectrin SH3结构域（1BK2）的D48G突变体的结构。(A类)显示了该结构域的带状图和疏水核心的缬氨酸。(B类)与中的透视图相同A类除了缬氨酸突变为苏氨酸。
为了解释Val→Thr突变的动力学分析，包括Val→Ala突变的标准分析是有用的，该突变主要破坏同一蛋白质的天然折叠状态(21)，原因有二。首先，由于丙氨酸与缬氨酸的疏水性掩埋不同，在蛋白质中形成空腔的成本大于效果(34). 第二，众所周知，疏水残基在未折叠状态下通常不会完全暴露，这解释了逆疏水效应(22)从而最小化Val和Ala之间的溶剂化差异。
因此，这两种突变解决了不同的能量考虑，可以从实验角度提供补充信息，揭示与TSE相关的动力学细节。
V44T突变的X射线分析。数据解释中的一个重要假设是缬氨酸残基突变为苏氨酸残基时不会发生构象变化。为了确定是否是这种情况，我们选择了关键的V44位置，它位于疏水核和折叠核的中心。我们已经确定了V44T的晶体结构()分辨率为2.6？（有关方法和参数的详细信息，请参阅表2，作为支持信息发布在PNAS网站上。
V44T的晶体结构。(A类)V44TD48G和D48G的总体拓扑重叠。二级结构的颜色如下：对于V44TD48G，β链为浅蓝色；第三个10-螺旋，金（残基56-58）；匝数和随机线圈，白色。D48G的主干以橙色显示。位置44处的侧链呈彩色棒状：T44的OG2原子为红色；V44的CG2原子，橙色。(B类)傅里叶电子密度图中T44的特写中国国家科学院并显示为涡轮在1.0等高线水平。
用以下公式计算了D48G参考突变体和V44TD48G突变体之间主链原子的均方根偏差（rmsd）拉斯卡布(35)仅为0.28奥。除N或C末端外，第二个最偏离的点包括残基39–46（因此包括V44T突变，其rmsd值最高，为0.45？），其次是两个相邻的β-链，反映了适应Thr侧链的微小结构变化。
因此，除了与不同晶体结构的比较以及Thr侧链的紧密堆积所产生的差异外，两种结构的叠加基本上没有显示出构象变化。这验证了我们的假设，即Val→Thr突变不会干扰折叠状态。
折叠和展开事件的突变效应。基于D48G的所有突变体（V9、V23、V44、V46、V53和V58）的展开和重折叠反应的动力学参数如所示及其相应的数据.通过比较折叠(k个-F)和展开(k个-U)D48G基准的速率常数，我们计算了TSE自由能相对于展开（ΔΔ）的变化G公司-U)和折叠状态（ΔΔG公司-F)对于每个突变体（参见支持文本)，用于确定动力学和热力学参数以及动力学测量方法）。这些参数分别量化了折叠和展开屏障的变化。此外，展开自由能的差异（ΔΔG公司F-U型)也可以根据动力学参数进行计算。例如，米-F这些值与折叠态和TSE态之间溶剂可及性的差异有关，而米-U值与展开状态和TSE状态之间的差异有关。每对V/A和V/T突变体的V形图如所示根据这些动力学参数，φ-U通过诱变研究获得TSE中相互作用形成的知识(21).
V9位Val→Thr和Val→Ala突变体的雪佛龙曲线(A类)，V23(B类)，V44(C类)，V46(D类)，版本53(E类)和V58(F类). □，D48G背景；▴, Val→Ala突变；•，Val→Thr突变。
表1。
D48G-SH3的Val→Thr和Val→Ala突变体的动力学参数
| 蛋白质 | k个†–U*，秒-1个 | 米–U†，千卡·摩尔-1个·M（M）-1个 | k个–F,*秒-1个 | 米–F†，千卡·摩尔-1个·M（M）-1个 | ΔΔG–U§，千卡·摩尔-1个 | ΔΔG–F§千卡·摩尔-1个 | ΔΔGF–U型千卡·摩尔-1个 | Φ–U¶ |
|---|
| D48G型∥ | 63.63 ± 1.20 | –0.78 ± 0.01 | 0.010 ± 0.000 | 0.47 ± 0.00 | – | – | – | – |
| V9A型 | 51.59 ± 1.84 | –0.76 ± .01 | 0.009 ± 0.009 | 0.43±0.12 | – | – | – | – |
| V9T型 | 52.52 ± 3.08 | –0.73 ± 0.03 | 0.297 ± 0.054 | 0.45 ± 0.02 | –0.11±0.04 | 2.00 ± 0.11 | –2.12 ± 0.11 | 0.05 ± 0.05 |
| 三氧化二钒 | 16.45 ± 0.67 | –0.77 ± 0.02 | 0.055±0.008 | 0.46 ± 0.02 | –0.80 ± 0.03 | 1.01 ± 0.09 | –1.81 ± 0.09 | 0.44 ± 0.05 |
| 三氧化二钒 | 21.87 ± 0.63 | –0.78 ± 0.01 | 0.042 ± 0.006 | 0.45 ± 0.02 | –0.63 ± 0.02 | 0.85 ± 0.08 | –1.48 ± 0.09 | 0.43 ± 0.06 |
| V44A系列 | 2.75 ± 0.16 | –0.91 ± 0.04 | 0.117 ± 0.005 | 0.37 ± 0.01 | –1.86 ± 0.04 | 1.46 ± 0.02 | –3.32 ± 0.04 | 0.56 ± 0.02 |
| V44T系列 | 1.11±0.08 | –0.83 ± 0.05 | 0.065 ± 0.004 | 0.48 ± 0.01 | –2.40 ± 0.04 | 1.11 ± 0.04 | –3.51±0.06 | 0.68 ± 0.02 |
| V46A系列 | 11.41 ± 0.36 | –0.89 ± 0.01 | 0.008 ± 0.002 | 0.37 ± 0.04 | –1.02±0.02 | –0.13 ± 0.15 | –0.89 ± 0.15 | 1.15 ± 0.26 |
| V46T系列 | 8.98 ± 0.27 | –0.86 ± 0.01 | 0.002 ± 0.000 | 0.46 ± 0.02 | –1.16 ± 0.02 | –0.90 ± 0.00 | –0.20 ± 0.02 | 5.62 ± 0.58 |
| V53A型 | 8.53 ± 0.62 | –0.97 ± 0.04 | 0.054 ± 0.007 | 0.43 ± 0.02 | –1.19 ± 0.04 | 1.00 ± 0.08 | –2.19 ± 0.09 | 0.54 ± 0.05 |
| V53T型 | 2.79 ± 0.18 | –0.86 ± 0.04 | 0.079±0.006 | 0.47 ± 0.01 | –1.85 ± 0.04 | 1.22 ± 0.05 | –3.07 ± 0.06 | 0.60 ± 0.02 |
| V58A版本 | 40.05 ± 1.32 | –0.98 ± 0.02 | 0.404 ± 0.027 | 0.41 ± 0.01 | –0.27 ± 0.02 | 2.19 ± 0.04 | –2.47±0.05 | 0.11 ± 0.02 |
| V58T型 | 19.06 ± 0.72 | –0.76 ± 0.02 | 0.061 ± 0.007 | 0.49 ± 0.01 | –0.71 ± 0.03 | 1.07 ± 0.07 | –1.79 ± 0.07 | 0.40 ± 0.04 |
有趣的是，在分析米†-U和米-FVal→Ala和Val→Thr突变之间的值。对于Val→Ala突变米-F始终低于相应的Val→Thr，而米†-U值显示相反的情况（唯一的例外是米-F和米-U位置9和23处的值，其中两个突变体的行为方式相似）。对于Val→Thr突变，一般来说，两者都是米-U和米†-F与Val→Ala突变相比，该值与参考值更为相似。这些观察结果可能意味着TSE向Thr→Ala突变体的更紧密构象移动，也可能仅仅证明Thr和Ala溶剂化的差异。无论如何，这些变化都不足以使“蛋白质工程”分析无效。
比较Thr和Ala突变体的折叠动力学特别有趣，因为它们可以与本研究中的折叠模拟相联系（有关模拟结果，请参阅表3和图7，它们作为支持信息发布在PNAS网站上）。比较Thr突变体和Ala突变体的复性动力学，在位置44和53处观察到的速率显著降低，而其他位置（9、23和46）的表现类似。此外，当Thr突变发生在位置44和53时，展开事件的情况也正好相反。然而，我们无法比较位于58位的Thr和Ala突变体的结果，因为可以引入非天然氢键。
蛋白质工程分析。φ的解释-U值可以通过两个简单的情况显示：φ-U=1和φ-U= 0 (36–39). φ-U=1表示TSE已经形成相互作用，而φ-U=0表示其他情况。然而，很难解释中间φ-U要全面了解TSE，需要有几个记者对同一地区进行调查。在这方面，我们描述了一个自由能示意图()使用两种突变，如Val→Thr和Val→Ala突变。如前所述，将Val突变为Thr残基应在折叠状态中引入较小的能量扰动，而变性状态相对稳定。相反的情况适用于Ala突变体，根据标准方案，在折叠状态下不稳定应该更大(21)其中数据的解释很简单。
埋藏Val→Thr和Val→Ala突变的自由能分布。φ的两种极端情况-U=0和φ†-U=1有争议。Thr突变的效果源于稳定未折叠状态，Ala突变的效果则源于破坏折叠状态。
在讨论Val→Thr突变时需要更多的注意，前提是现在将扰动应用于展开状态。结合前面关于Val→Ala突变的论点，对φ的分析-U=1和φ†-U=0现在可以这样讨论：假设TSE的疏水核心中形成了一个空隙。核心被这个空腔引起膨胀，核心内部的相互作用减弱或消失，φ-UVal→Ala突变的值可以在1到0之间负责任地缩放。然而，在核心内没有发现水分子的相同假设下，Val→Thr突变不应像Val→Ala突变那样给TSE带来太多的扰动，因为Val和Thr是等容的，因此两者的接触量相似。因此，如果TSE处的膨胀芯确实是一个空洞或空腔（即膨胀干芯），则φ-UVal→Thr突变的值必须接近1（展开状态和TSE状态之间能量的唯一差异）。
另一方面，如果有水分子进入蛋白质的内部区域，导致疏水核心的膨胀和接触损失，我们可以预期Val和Thr之间会有不同的折叠行为。在这种情况下，Thr应该通过与埋藏的水分子形成氢键来稳定TSE。如果TSE的核心区域（即膨胀的湿核心）中存在水分子，则φ-UVal→Thr突变值将接近0。在极端情况下，当Thr侧链周围的溶剂化壳层类似于展开状态时，它将为0。此外，如果Thr仅部分溶解，则该值将介于0和1之间。回想一下，在前一段中，Val→Ala突变也可以呈现中间φ-U值，而不考虑膨胀核心区域内存在空腔（即干）或水分子（即湿）的假设。然而，由于这两种突变设计背后的哲学不同，它们的直接φ-U值没有义务收敛到相同的值。在，我们以图解的方式总结了上述论点。
对多重蛋白质工程产生的数据的综合解释现在非常清楚：(我)φ的组合†-UVal→Thr突变和中间φ的值为1-UVal→Ala突变的值表示内部有空隙的膨胀疏水核（即膨胀干核）。(ii（ii）)φ-U两个突变的值均为0意味着该位置完全暴露于溶剂中。(三)中间φ-U同一位置的两个突变值应解决一定量的溶剂化，这由Val→Thr突变中的部分稳定变性构象以及Val→Ala突变中的相互作用损失表示。
通过比较耦合φ-U中每个突变对的值（V/A，V/T），我们发现在第46位和第58位的丙氨酸和苏氨酸突变体中存在显著的差异。φ-UV46A和V46T突变体的值大于1。φ-U前者的值非常接近1（在实验误差范围内），这意味着该区域在TSE中完全折叠，而φ-U后者的值相当高，表明TSE中Thr侧链产生的非本征相互作用。对于V58，Thr的替代物向A55的主链引入了一种新的氢键，这为V58A和V58T突变在φ中的明显差异提供了解释-U值。虽然组成疏水核的缬氨酸在折叠状态下在空间上似乎无法区分，但它们具有φ的明显分布-U值，这意味着TSE中不同的局部溶剂化条件（不包括在TSE中形成非本征接触的V46T）。
对于φ-UAla突变体的值（蛋白质工程分析中的标准突变），我们发现44和53个位置的中间φ稍高-U价值观，这意味着它们在TSE中更加结构化。偏离中心的相邻23和58个位置的中间φ稍低-U值，表示更松散的区域。这与src的总体观点完全一致(40)和spectrin SH3 TSE(25). 比较φ-U探测TSE溶剂化的Thr突变体的值，我们发现位置9完全暴露在溶剂中[与之前显示该蛋白质区域未展开的数据很好地一致(25,26)]. 位置58很难解释，因为Thr侧链产生了额外的氢键，因此无法进行分析。类似的参数可以应用于位置46，这表示Thr在TSE中进行的非本机交互。有趣的是，通过对其余位置（9、23、44和53）的Ala和Thr突变进行分析，这些缬氨酸根据其在聚合物链中的相对位置不同地暴露于溶剂中，从而探测到溶剂化疏水核心。
模拟和理论分析。实验研究同时进行了各种SH3突变体的折叠模拟，这些突变体经历了选择性Val→Thr扰动，但没有任何知识（使用最小模型的模拟在PNAS网站上发布作为支持信息）。只有在这些模拟完成后，才能将它们与实验结果进行比较。标准LJ电位和去溶电位均用于检测核心突变的动力学后果。与WT相比，仅使用LJ电势的模拟没有显示出足够的变化，这表明需要一个能够描述水如何影响堆芯填料的模型。因此，当去溶电位用于描述核心残基-残基接触时，V44T和V53T的折叠速率显著降低，而其他Thr突变体的动力学速率基本保持不变。这些影响的定量描述如表3和图7所示，作为支持信息发布在PNAS网站上。与WT相比，特别是对于V44T而言，两种突变体的两种速率都显著较慢。此外，计算出的折叠时间只是完整结果的下限，因为对于这两个突变体，许多运行无法在最大允许折叠时间内折叠（V44T的运行不会折叠58%的时间，V53T的运行也不会折叠44%的时间）。该预测与实验观察结果非常吻合，如V44T和V53T的折叠速度比其他突变体慢得多。
V44T和V53T中可能的动力学陷阱背后的分子细节。令人鼓舞的是，实验结果已经支持了理论预测。现在可以提出更具挑战性和更详细的问题：这个溶剂化的疏水核在分子分辨率中看起来如何？这些缬氨酸在疏水核的动力学中起什么作用？我们能否从微观上理解为什么Val→Thr的点突变可以解释如此明显的宏观折叠行为？仔细观察模拟，现在可以对V44T和V53T突变体中固有的动力学陷阱的原因进行分子解释。模拟表明，虽然两个陷阱的折叠速度都有类似的急剧下降，但两个动力学陷阱的物理性质却截然不同().
Q（天然接触形成的分数）、伪Q（天然单水分离接触形成的百分比）的典型折叠轨迹，以及作为积分时间步长函数的接触能量，提供了控制V44T和V53T折叠的动力学陷阱的分子细节。V44T的折叠模拟如所示A类和B类，V53T的显示如所示C类和D类两种计算均以0.9进行T型（f），其中T型（f）是表3所示的折叠温度(支持文本). 在两个位置的快照中B类和D类（其中，接触能量是作为时间步长的函数绘制的），蓝色球体用于识别单个水分离接触（注意，没有蓝色球体的未展开残留物是完全溶解的）。我们将天然构象的残基涂成红色，以识别折叠区域和非结构残基的灰色。(B类)对于V44T，位置44为紫色，用于视觉引导，快照（a）显示了形成短程触点的典型展开配置。快照b显示了一个典型的动力学陷阱，在此位置去除有利的疏水接触会破坏β2、β3和β4区域新生的天然接触形成。这些β片磨损，到位置44的配对距离超过了单个水的大小（即完全溶解，在蓝盒子中突出显示）。因此，在褶皱早期，接触形成的分布向RT环移动；阻碍了结构拱坍塌的线形，形成了动力圈闭。快照c和d对应于结构搜索坍缩，其中丰富的水分子从β2-、β3-和β4-链中排出，以及发散转向。然后，将位置44整齐地包装在上述β板的中心。快照e和f描述了折叠的最后阶段，当末端β链与蛋白质的其余部分聚集在一起时，残留的水分子从疏水核心中排出。(D类)接下来我们讨论V53T突变体的折叠事件。位置53为绿色，以提供视觉指导。Snapshot a是一种典型的陷阱状态，它显示出一种坍塌但看似平坦的构象，短程接触主要形成于转弯和环路区域。青色框突出显示位置53，其暴露于完全溶剂化但未成形的疏水核。快照b显示了位置53完全溶解的典型展开状态。快照（c和d）表明结构搜索崩塌，其中位置53暴露于水合疏水核心（如蓝盒子所示），其中β4和RT环之间存在水分子。在折叠的最后阶段，疏水核发生脱溶；水分子从这个核心被排出，V53T折叠到它的自然状态（e）。模拟表明，这两个位置起着不同的拓扑作用，这解释了实验观察到的折叠速率下降的原因。
V44T突变体的折叠模拟()表明与V44相关的接触对于折叠早期由β2、β3和β4引发的结构坍塌至关重要（定义为). 对于V44T突变体，去除与位置44相关的有利疏水接触不仅破坏了折叠早期上述β片（即β2、β3和β4）的结构形成，而且还将接触形成的数量转移到RT环（定义在). （Val和Thr应具有相同的有利接触；然而，它们的疏水效应不同。应包含区分范德瓦尔斯相互作用和疏水效应的相同命名法。）因此，实验中的高φ值残留物的正确排列导致了随后的结构搜索崩塌，这使得能量陷阱的产生降低了折叠速率。在V53T突变体的折叠模拟中，与β4位置53相关的接触大多是长距离的，对于在折叠后期形成疏水核至关重要（位置53显示在). 去除这些有利的长程疏水性接触会使匝间和发夹内的局部接触稳定下来，从而形成动力学陷阱，降低WT的折叠速率。
SH3折叠机制下的折叠路线示意图。这项研究支持对折叠机制的一般解释，在折叠机制中，结构坍塌后疏水核脱溶。前者主要是形成短程接触(一)而后者则由相互作用β片的闭合控制(b–d段). 将缬氨酸替换为疏水核区域中的苏氨酸，一次一个，可以探测SH3折叠动力学是否与润滑的疏水核相关。这些有趣的缬氨酸由彩色球体表示：V44，紫色；V53，绿色；其他，粉红色。V44T和V53T中折叠速度的降低可以用这个简单的图表来解释：对于V44T，将有利触点移到位置44，这对于稳定β2、β3和β4之间的触点至关重要（如图中的黄色方框所示一)导致接触形成的分布向RT回路移动（如青色块所示）；观察到了动力学陷阱。对于V53T，位置53涉及许多远程接触，因此它在稳定堆芯和终端β板方面起着重要作用c（c）。在该位置去除有利的疏水接触会导致在后期出现动力学陷阱（比V44T），此时疏水核心的去溶剂化变得相关。
Thr突变体的动力学观察结果的成功预测支持了我们关于Val→Thr突变如何干扰折叠机制的简单想法。尽管所有五个感兴趣的山谷都位于核心()通过减少疏水相互作用扰动每个残基（同时保持范德华距离相同），它们可以导致不同的动力学行为。这种行为不仅仅是由于聚合物链的自回避导致的拓扑挫折的结果，还与溶剂化程度有关，这使这种突变与Val→Ala突变不同。如果对一些核心缬氨酸（V44和V53）施加扰动，这些核心缬氨酸在，折叠动力学发生了显著变化。否则，了解到其他核心缬氨酸（V9、V23和V58）（较少参与主要折叠路线）在同一类型突变上的动力学没有显著变化就不足为奇了。
考虑到折叠模拟中相同的自然配对相互作用，脱溶电位剖面比LJ更能代表疏水核动力学的原因在于脱溶势垒的显著特征，该特征为分离折叠和展开构型提供了明确的边界。当对系统的扰动对展开态系综的影响大于折叠态系综时，这一特性尤为重要。因此，即使标准LJ电位已成功用于描述Val→Ala突变的实验φ值分布(12)，不足以解决Val→Thr突变的折叠率分布，其中这种突变强调扰乱未折叠状态，同时保持核心堆积的结构在空间上不变。
