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单元格代表。作者手稿；PMC 2013年5月16日提供。
以最终编辑形式发布为：
Cell Rep.2013年2月21日；3(2): 401–410.
2013年1月31日在线发布。 数字对象标识：2016年10月10日/j.celrep.2013.01.007
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NIHMSID公司：NIHMS435056标准
PMID：23375376

肝源性系统因子驱动b细胞增生在胰岛素抵抗状态

阿卜杜勒法塔赫·奥瓦马里,1 丹·卡瓦莫里,1,6 Ercument Dirice公司,1 刘崇伟（Chong Wee Liew）,1,7 詹妮弗·沙德拉赫,1,三，4 姜虎,1 Hitoshi Katsuta先生,2 詹妮弗·霍利斯特·洛克,2 钱伟军,5 艾米·J·瓦格斯,1,三，4和罗希特·库尔卡尼1,*
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补充资料

总结

综合器官串扰调节能量稳态的关键方面，其失调可能是肥胖和糖尿病等代谢紊乱的基础。为了验证肝脏和胰岛之间的串扰调节β细胞生长以应对胰岛素抵抗的假设，我们使用了肝脏特异性胰岛素受体敲除（LIRKO）小鼠，这是一种独特的胰岛显著增生模型。通过补充体内联体和移植试验，以及体外胰岛培养方法，我们证明体液、非神经、非细胞自主因子可诱导LIRKO小鼠的β细胞增殖。此外，我们报告称，在体外实验中，肝细胞衍生因子刺激小鼠和人类β细胞增殖，与环境葡萄糖和胰岛素水平无关。这些数据表明肝脏是胰岛素抵抗状态下β细胞生长因子的关键来源。

简介

糖尿病在发达国家和发展中国家都已达到流行程度，治疗因高血糖失控而出现并发症的患者的费用是世界上的主要经济负担。改善糖尿病治疗的一个有希望但尚未实现的目标是识别促进β细胞再生的新因子，长期目标是增加1型或2型糖尿病患者的功能性β细胞质量。功能性β细胞质量降低是该病和肥胖相关糖尿病的主要特征(Muoio和Newgard，2008年). 虽然β细胞的自身免疫性破坏是1型糖尿病中β细胞丢失的主要原因，但β细胞无法补偿周围胰岛素抵抗会导致2型糖尿病中无法控制的高血糖。

几十年的研究表明，为了鼓励旨在提高β细胞质量的治疗策略，β细胞具有补偿生理（妊娠）和病理（肥胖）胰岛素抵抗的能力(奥格尔维，1933年;Van Assche等人，1978年). 尽管已有文献证明，人类和啮齿类动物的β细胞生长都是通过预先存在的β细胞的自我复制实现的(Dor等人，2004年;Meier等人，2008年;Teta等人，2007年)尽管处于低水平，但介导这一过程的假定生长因子的来源，尤其是在胰岛素抵抗的情况下，仍然未知。在可能的β细胞质量系统调节因子中，肠源性肠促胰岛素如胰高血糖素样肽-1（GLP-1）、葡萄糖依赖性胰岛素样多肽（GIP）(Renner等人，2010年;Saxena等人，2010年)，脂肪细胞衍生的脂肪因子，包括瘦素(Morioka等人，2007年)和脂联素(Holland等人，2011年)、肌源性肌细胞因子，如IL-6(Ellingsgaard等人，2008年;铃木等人，2011年)巨噬细胞衍生的细胞因子，包括IL-1β、IFNγ和TNF-α(Wang等人，2010年)，骨源性骨钙素(Ferron等人，2008年)、甲状腺衍生T3/T4激素(Jörns等人，2010年;Verga Falzacappa等人，2010年)血小板衍生生长因子（PDGF）(Chen等人，2011年)、血清素(Kim等人，2010年)和FGF21(Wente等人，2006年)都有牵连。然而，在胰岛素抵抗的LIRKO小鼠模型中，外周血中这些已知因子缺乏显著且一致的变化，这些变化可以完全解释β细胞增殖(表S1)促使我们探索一种来源于胰岛素抵抗肝脏的未知因子的存在。为了验证肝脏和胰岛之间通过系统体液因子进行沟通的串扰能够介导LIRKO小鼠代偿性β细胞再生的假设，我们使用了体内（联体共生、移植）和体外（原代胰岛β细胞增殖试验）建立模型以确定血传和肝细胞生成的可溶性因子对β细胞增殖的影响。

结果和讨论

糖尿病研究中的协同努力旨在识别能特异性促进β细胞再生而不会在其他组织中造成细胞不良增殖的分子。为了确定表现出内分泌胰腺显著增生的LIRKO小鼠胰腺外组织的增殖是否增加，我们在3个月大的LIRKO小鼠腹腔内注射溴脱氧尿苷（BrdU；100 mg/kg体重），并评估β细胞、α细胞、，以及肝脏、脂肪和骨骼肌等代谢器官以及肺、肾和脾等非代谢组织中的细胞。我们观察到，与同窝对照组相比，LIRKO小鼠的β细胞质量增加了2倍（LIRKO1.32±0.2 vs对照组0.68±0.08 mg；p<0.05；n=6），这是由于增强β细胞增殖表现为LIRKO中BrdU掺入量增加2.5倍（LIRKO1%±0.08%，对照组0.4%±0.07%BrdU+β细胞；p<0.001；n=6），Ki67染色（LIRKO 1.34%±0.1%，对照组0.51%±0.08%Ki67+β细胞，p<0.000；n=5）。TUNEL染色未显示各组间凋亡β细胞数量的显著差异。我们还观察到α细胞增殖无差异（LIRKO 0.24%±0.09%与对照组0.29%±0.1%BrdU+α细胞；n=6）(图1A–1F)或多个非β细胞组织中的细胞增殖，包括内脏脂肪、皮下脂肪、肌肉、肾脏、肝脏或脾脏。尽管我们确实观察到肺细胞增殖有所增加（LIRKO 0.7%±0.02%与对照组0.43%±0.08%BrdU+细胞；n=6；p<0.05）(图1G和1H)，对12个月大的LIRKOs组织切片的组织学分析显示没有肿瘤样表型(图S1；表S2)，并且LIRKO的寿命与同窝出生的对照组相似。这些数据表明，LIRKO小鼠对胰岛素抵抗表现出强大的β细胞特异性增殖。

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LIRKO小鼠的选择性b细胞增殖

在处死动物前5小时，将3至4个月大的LIRKO和对照小鼠腹腔内注射BrdU（100 mg/kg体重），并按指示解剖、固定和染色组织。

（A） 如图所示，对胰腺切片进行胰岛素/BrdU/DAPI、胰岛素/Ki67/DAPI、胰岛素/TUNEL或胰高血糖素/BrdU/DAPI免疫染色。

（B） β细胞质量定量。

（C和D）BrdU+胰岛素+和Ki67+胰岛素+细胞的定量：对照组和LIRKO胰腺中每只动物的胰岛素+细胞数分别为2000到5000个。

（E） TUNEL+胰岛素+细胞的定量：对照组和LIRKO胰腺中的胰岛素+细胞数分别为2000到5000个/只。

（F） BrdU+胰高血糖素+细胞的定量：对照组和LIRKO胰腺中的胰岛素+细胞数分别为2000到5000个/只。

（G） 所示组织中BrdU+细胞核的定量：在肝脏、肾脏、脾脏和肺中每只小鼠计数4000–5000个细胞，在内脏（Visc.）和皮下（Sc.）脂肪组织和骨骼肌（Sk）中每只鼠计数1500个细胞。

（H） BrdU染色的组织切片中增殖细胞的典型图像。

数据代表平均值±SEM。*p≤0.05和***p≤0.001（每组n=6）。另请参见图S1和表S2.

循环非神经元非自主因子驱动LIRKO小鼠β细胞复制

为了直接解决LIRKO小鼠的β细胞增殖是否由系统性因素介导，我们首先使用了一个共生模型(邦斯特和迈耶，1933年). 对5至6周龄雄性小鼠在肩部和臀部束带处进行手术连接，并在连接后2周内通过Evans Blue Dye注射证实吻合成功（数据未显示）。动物保持联体16周，随后通过BrdU掺入评估β细胞复制(图2A). 生成了三个手术模型：control/control、control/LIRKO和LIRKO/LIRKO。所有对羟基苯甲酸酯组生长正常，体重每周增加，对羟基苯乙酸酯伴侣的血糖在正常范围内，各组之间没有显著差异(图S2A–S2C). 在16周的联体共生后，LIRKO和对照组显示出相似的空腹血糖水平和循环胰岛素水平，与非阿拉伯对照组和与对照组联体的对照组相比，加入LIRKOs的对照组的血糖水平和胰岛素水平更高(图S3A–S3D). 正如预期的那样，BrdU掺入显示对照组小鼠的β细胞有丝分裂较低，LIRKO动物的β细胞分裂显著增加（对照组为0.03%±0.005%，LIRGO为0.14%±0.02%；p<0.005；n=5-6）。我们还注意到对照组的β细胞增殖水平较低(图2F和S4系列)与单个控件相比(图1C和1D). 我们认为这可能是联体手术本身的次要问题，需要进一步调查。相同基因型对合物的胰腺β细胞中BrdU掺入相似：对照组/对照组低（~0.03%BrdU+β细胞；n=5-6）；LIRKO/LIRKO含量较高（~0.19%BrdU+β细胞；n=5-6）。有趣的是，加入LIRKO小鼠的对照组小鼠的胰腺β细胞中BrdU掺入显著增加（对照组/LIRKO对映体中的对照组为0.09%±0.01%，对照组/对照组为[0.03%±0.004%和0.03%±0.008%]BrdU+β细胞；p<0.01；n=5-6）(图2B-2F). 后一个观察结果通过磷酸化H istone H3（pHH3）的免疫染色得到证实(图S4). 这些数据表明LIRKO小鼠体内存在促进β细胞复制的细胞非自主循环因子。先前的研究表明神经通路以细胞自主方式调节β细胞增殖(Imai等人，2008年). 为了评估这种神经效应对LIRKO模型中β细胞增殖的可能影响，我们进行了移植研究以评估β细胞复制。从对照组或LIRKO小鼠新鲜分离的125个大小匹配的胰岛被移植到对照组或LIRKO受体的肾包膜下。为了最大限度地减少系统误差，每只受体小鼠（对照或LIRKO）分别在左肾和右肾下移植两个胰岛移植物，一个来自对照，另一个来自LIRKO供体(图2G). 移植后16周，采集胰岛移植物，切片并分析β细胞BrdU掺入情况。正如预期的那样，移植到对照动物体内的对照胰岛表现出最小的β细胞增殖（0.017%±0.017%BrdU+β细胞）。有趣的是，当移植到LIRKO受体时，相同的供体来源的对照胰岛的β细胞复制增加了约8倍（0.139%±0.03%BrdU+β细胞；p<0.05；n=3-5）。值得注意的是，移植到LIRKO受体中的LIRKO-胰岛表现出强劲的β细胞复制，这让人想起未经处理的LIRKO小鼠胰腺中的β细胞增殖增加，而当将LIRKO-胰岛移植到对照动物中时，这种反应变钝(图2H). 总之，这两种互补的实验策略提供了证据，证明循环的非神经和非细胞自主因子有助于扩大β细胞质量以应对胰岛素抵抗。

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循环非神经元非自主因子驱动LIRKO小鼠b细胞复制

（A） 联体实验示意图。另请参见图S2、S3和S4.

（B–E）在处死动物前5小时，将BrdU（100 mg/kg体重）腹腔内注射给单胎和副胎模型，解剖胰腺并进行胰岛素、BrdU和DAPI免疫染色。

（F） BrdU+胰岛素+细胞的定量：分析三个由80µm分离的切片，并在每个组中计算2000到10000个细胞（每个对映体组中的n=5–6）。

（G） 移植实验示意图。

（H） 胰岛移植物中BrdU+胰岛素+细胞的定量研究表明：分析并统计了3到6个胰岛移细胞切片，每组细胞数在2000到10000之间（每组3到5个）。

数据表示平均值±SEM。*p≤0.05。

LIRKO血清诱导体内选择性b细胞复制

接下来，我们试图评估在LIRKO模型中，血源性分子与细胞在诱导β细胞增殖中的相对重要性。在第1天、第3天和第5天，分别向5至6周龄雄性小鼠腹腔注射6个月龄对照组或LIRKO小鼠的新鲜分离血清，每天两次（每次150微升）。受体在第2、4和6天每天注射一次BrdU（100 mg/kg体重）。在第6天采集胰腺以评估β和α细胞复制(图3A). 注射了LIRKO血清的对照小鼠的内源性β细胞（而非α细胞）复制比注射了对照血清的同窝鼠（对照组）增加了约2倍(图3B–3E). 我们发现TUNEL+β细胞的数量没有显著差异(图3F和3G)LIRKO和对照注射组之间。对胰腺外组织（包括肝脏、皮下脂肪、肌肉、肾脏、脾脏和肺）中BrdU掺入的评估表明，各组之间的增殖没有显著差异，而内脏脂肪则略有减少(图3H). 这项体内研究证实，在LIRKO模型中，血清中稳定的循环分子选择性地促进β细胞增殖。

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LIRKO血清诱导体内选择性β细胞复制

在第1天、第3天和第5天，向5至6周大的小鼠腹膜内注射来自6个月大对照或LIRKO小鼠的150µl血清，每天两次。在第2天、第4天和第6天腹腔注射BrdU（100 mg/kg体重）。在最后一次注射BrdU前5小时处死动物，解剖组织进行免疫染色研究。

（A） 实验设计示意图。

（B和C）BrdU+胰岛素+细胞的代表性图像和定量：分析两个由80µm分隔的切片，每个动物至少计数4000个胰岛素+细胞。

（D和E）BrdU+胰高血糖素+细胞的代表性图像和量化：在每只动物中对400–600个胰高血糖激素+细胞进行计数。

（F和G）TUNEL+胰岛素+细胞的代表性图像和量化：每个动物中至少有2000个胰岛素+细胞。

（H） 指示组织中BrdU+核的代表性图像和定量：对于每只动物，在肝、肾、脾和肺的切片中计数4000–5000个细胞，在内脏（Visc.）和皮下（Sc.）脂肪组织和骨骼肌的切片中计算1500个细胞。

数据代表平均值±SEM。*p≤0.05（每组n=3）。

LIRKO血清增加小鼠和人胰岛β细胞的体外复制

为了进一步了解这种循环β细胞生长因子的作用模式，我们接下来建立了一种体外功能测定，以直接评估LIRKO或对照血清对分离小鼠胰岛β细胞复制的影响。我们在含有LIRKO或对照小鼠血清的培养基中培养胰岛，然后使用Ki67免疫染色和荧光显微镜评估β细胞增殖。在所有实验中，各组中随机选择的Ki67+β细胞均经共焦显微镜证实(图4A). 我们首先测试了6个月大的LIRKO血清刺激β细胞增殖的能力，发现1:10稀释的LIRGO小鼠血清在24小时和48小时时增加了原代胰岛的β细胞增殖(图S5). 3月龄小鼠的LIRKO血清也能促进小鼠胰岛β细胞增殖（与对照组相比，LIRKO1.58%±0.3%±0.1%Ki67+β细胞；p<0.05；n＝6）。此外，与用年龄匹配的对照血清孵育的胰岛相比，在12个月大的LIRKO血清中培养的小鼠胰岛显示出更多的复制β细胞（LIRKO（s）1.3%±0.5%，对照（s）0.7%±0.2%Ki67+β细胞；p=0.3；n=4–6）(图4B和4C); 这一增加失去了统计意义，可能是由于老龄对照组胰岛素抵抗升高，而胰岛素抵抗本身又促进了β细胞增殖(Kulkarni等人，2003年;Mori等人，2010年). TUNEL染色显示LIRKO培养的胰岛与对照组胰岛β细胞凋亡无显著差异(图4D). 初步数据表明，LIRKO血清在热灭活后刺激β细胞增殖的能力降低，这表明假定的循环因子可能是一种蛋白质（数据未显示）。为了检测LIRKO血清的增殖作用是否在物种间保持不变，我们接下来培养了9名健康和2名糖尿病供体的人类胰岛（供体特征见表S3)在12至18个月龄雄性LIRKO或对照小鼠的血清中。与对小鼠β细胞的作用类似，LIRKO小鼠的血清增强了人胰岛β细胞的增殖，尽管其水平低于Rieck等人（2012年）重要的是，LIRKO血清也能有效促进2型糖尿病患者胰岛β细胞的增殖(图4E–4G). 因此，LIRKO小鼠循环中存在的β细胞有丝分裂原对小鼠和人类胰岛（包括2型糖尿病患者的胰岛）具有保守活性。据报道，葡萄糖和胰岛素可促进β细胞生长(Assmann等人，2009年a,2009年b;Bonner-Weir等人，1989年)和是LIRKO模型的潜在候选者，该模型表现为葡萄糖不耐受和高胰岛素血症(Michael等人，2000年). 然而，我们的观察结果表明，葡萄糖不是LIRKO小鼠的主要因子，这有几个原因。首先，与LIRKOs联体16周的对照小鼠显示，尽管联体期间血糖水平正常（~120 mg/dl），但其增殖增加了7倍(图S2A和S2C). 第二，检测血清对β细胞增殖的影响（参见图4A)来自3个月龄血糖正常或12个月龄低血糖动物（数据未显示）。最后，为了进一步排除葡萄糖的作用，我们用LIRKO或对照小鼠的血清（血清：1:10稀释培养基）在实验中以5.5 mM葡萄糖的恒定浓度培养胰岛，并仅在前一组中观察到β细胞增殖增加。此外，两组胰岛培养开始和结束时培养基中的葡萄糖水平相似(图S6A). 我们认为胰岛素可能是允许的，但不太可能解释我们模型中β细胞高水平增殖的原因，因为稀释血清中的胰岛素水平(图S6B)用于体外研究（参见图4)与LIRKO小鼠循环中的水平相比显著降低（11.63±2.4 ng/ml【3个月龄LIRKOs】vs.2.59±1 ng/ml（培养基中的稀释血清）和17.8±4.4 ng/ml】vs.1.4±1.3 ng/ml(表S1;Michael等人，2000年). 总之，这些数据支持存在一种葡萄糖和胰岛素依赖的肝源性因子，该因子可促进β细胞团的扩张。

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LIRKO血清增加小鼠和人胰岛β细胞的体外复制

用对照组或LIRKO血清刺激5至6周龄小鼠胰岛48小时。胰岛嵌入琼脂糖中并用于免疫染色研究。检测培养基中的葡萄糖和胰岛素。WT，野生型。

（A） 实验方案示意图。另请参见图S5和S6.

（B） 用来自3个月龄（上面板）和12个月龄动物（下面板）的血清刺激的小鼠胰岛的代表性图像。

（C） （B）中Ki67+胰岛素+细胞的定量：分析两组由80µm分离的三个连续切片。每个实验组中至少有4000–5000个细胞被计数（每组5个）。

（D） （B）中TUNEL+胰岛素+细胞的定量：每组至少计数3000–4000个细胞（每组n=5）。

（E和F）对照组和LIRKO血清刺激24小时的健康和2型糖尿病供体胰岛的代表性图像。另见表S3.

（G） （E）和（F）中Ki67+胰岛素+细胞的定量：分析三组由80µm分离的三个连续切片。每组中至少有3000-4000个细胞被计数。另请参见表S3.

数据表示平均值±SEM。*p≤0.05。（见实验程序中的血清刺激和人类胰岛研究部分。）

肝细胞衍生因子刺激小鼠和人胰岛β细胞体外复制

肝脏和胰腺的共同胚胎起源(扎雷特，2008)与胰岛素抵抗局限于肌肉时实际上缺乏代偿反应相比，肝脏中对组织特异性胰岛素抵抗具有强大的β细胞增殖反应(Brüning等人，1998年)，脂肪(Blüher等人，2002年)，或大脑(Brüning等人，2000年)促使我们假设肝脏是β细胞生长因子（s）的来源，以应对胰岛素抵抗等代谢损伤。为了验证这一假设，我们从3个月或12个月大的LIRKO或对照动物的肝外植体培养物（LECM）中收集条件培养基，并评估其对小鼠胰岛β细胞增殖的影响(图5A). 与来自年龄匹配的对照组的LECM培养细胞相比，来自3个月或12个月大LIRKO小鼠的LECM中培养的胰岛中Ki67阳性β细胞显著升高(图5B). 有趣的是，在来源于3个月大和12个月大动物的对照LECM中培养的小鼠胰岛显示出相似的增殖水平，但与3个月大的对照LECM相比，含有12个月大LIRKO-LECM的培养物中的增殖水平高出2倍(图5C). LIRKO-LECM的这种年龄依赖性效应与LIRKO小鼠β细胞增殖的年龄依赖性增加相一致(Okada等人，2007年). 同样，从健康人对照组和2型糖尿病患者胰岛中获得的β细胞（供者特征见表S3)与来自相同供体的胰岛相比，在LIRKO动物的LECM中培养的胰岛增殖增加(图5D和5E).

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肝细胞衍生因子刺激小鼠和人胰岛β细胞体外复制

用从对照组或LIRKO小鼠获得的LECM或HCM刺激5至6周龄小鼠胰岛24小时。将胰岛嵌入琼脂糖中，然后进行免疫染色分析。检测培养基中的葡萄糖和胰岛素。

（A） 实验方案示意图。另请参见图S6.

（B） 用LECM刺激的小鼠胰岛的代表性图像来自3个月大的动物（上面板）和12个月大动物（下面板）。

（C） Ki67+胰岛素+细胞（上面板）和TUNEL+胰岛素+电池（下面板）的定量：每个实验组至少计数3000-5000个细胞（每组5个）。

（D） 健康人类供体胰岛（上面板）和2型糖尿病供体胰脏（下面板）的代表性图像，使用来自对照组和LIRKO小鼠的LECM治疗24小时。另请参见表S3.

（E） （D）中Ki67+胰岛素+细胞的定量：在每种情况下（对照LECM与LIRKO LECM），对照胰岛中的细胞数在3000到4000个之间，在每个实验组中，2型糖尿病胰岛中至少有2000个细胞。另请参见表S3.

（F） 来自6个月龄对照组的HCM刺激小鼠胰岛的代表性图像，与LIRKO小鼠或成纤维细胞调节介质（FCM）相比。

（G） Ki67+胰岛素+细胞（上面板）和TUNEL+胰岛素+电池（下面板）的定量：每个实验组（对照HCM和LIRKO HCM）的细胞数在4000到5000之间（每组5个）。

（H） 对照组或LIRKO HCM刺激的2型糖尿病供体胰岛的典型图像。另请参见表S3.

（一） （H）中Ki67+胰岛素+细胞的定量：在每个实验条件下至少计算2000个细胞。另请参见表S3.

数据表示平均值±SEM。*p≤0.05。（见实验程序中的LECM刺激、HCM刺激和人类胰岛研究部分。）

肝脏包含多种细胞类型，包括肝细胞、枯否细胞和内皮细胞(Si-Tayeb等人，2010年). 为了确定LIRKO血清中的生长因子活性是肝细胞还是非肝细胞的产物，我们在体外β细胞增殖试验中使用了从对照或LIRGO小鼠分离的原代肝细胞（HCM）培养物中获得的条件培养基。与对照HCM刺激的胰岛相比，在LIRKO HCM中培养的原代小鼠胰岛的β细胞增殖显著增加（对照HCM为0.13%±0.03%，而LIRKO-HCM为0.64%±0.12%；p<0.05；n=5）。两种条件下TUNEL+β细胞的数量相似(图5F和5G). 此外，当从2型糖尿病患者获得人类胰岛时，LIRKO HCM的增殖作用也很明显（供者特征见表S3)与对照HCM相比，暴露于LIRKO HCM(图5H和5I). 因此，胰岛素抵抗的肝细胞产生一种β细胞生长促进因子，可促进小鼠和人类β细胞的增殖。

虽然已经有许多影响β细胞生长的信号通路被记录(Kulkarni等人，2012年)据我们所知，直接触发β细胞复制以应对胰岛素抵抗的特异性血源性分子尚未报道。LIRKO血清中一种或多种生长因子没有持续增加(表S1)支持额外的未鉴定因素对于促进LIRKO模型中观察到的全部增殖程度是必要的这一观点。总之，我们提供证据表明，一种保守的系统性肝细胞衍生生长因子促进小鼠和人类胰岛中的β细胞增殖，支持胰岛素抵抗适应性β细胞生长反应中的肝-胰腺轴。

实验程序

动物

小鼠被安置在无病设施中，并在波士顿Joslin糖尿病中心动物护理设施和马萨诸塞州Waltham Brandeis大学Foster生物医学研究实验室进行12小时的光/暗循环。所有进行的研究和使用的方案都得到了Joslin糖尿病中心和Brandeis大学动物护理和使用委员会的批准，并符合NIH指南。LIRKO小鼠通过交叉白蛋白产生-Cre公司到红外flox/flox公司在混合遗传背景下，在C57/Bl6背景下回交15代以上。LIRKO小鼠（白蛋白-Cre公司+/−,红外flox/flox公司)和他们的室友Lox控件（白蛋白-Cre公司−/−,红外flox/flox公司)按照之前的描述进行基因分型Okada等人（2007年）使用自动血糖监测仪（Glucometer Elite；Bayer）监测血糖，并通过ELISA（Crystal Chem）检测血浆胰岛素。

共生

如前所述进行了寄生虫手术Eggan等人（2006）术后2周通过Evans Blue透射测定交叉循环(Pietramaggiori等人，2009年). 每周监测一次副肢动物的体重和血糖。在16周的联体期后，处死动物，收集胰腺进行形态计量分析。

胰岛分离和移植

使用导管内胶原酶技术从9个月大的小鼠中分离出胰岛(Kulkarni等人，1999年). 胰岛是手工挑选的，浓缩在一个小球中，并在移植之前一直保存在冰上(Flier等人，2001年). 在小鼠腹腔注射（15µl/g体重）2,2,2-三溴乙醇和第三种-戊醇，用PBS（pH 7.4）按1:50稀释。在5个月大的雄性小鼠中，切开肾囊，在每个肾的上极附近植入胰岛。将胶囊烧灼后，让小鼠在加热垫上恢复。

生长因子和激素分析

基于ELISA的分析用于测量生长因子和激素，包括IGF-1（目录#MG100；R&D Systems）、HGF（目录#ab100686；Abcam）、EGF（目录#IB39411；IBL-America）、PDGFAA（目录#DAA00B；R&DSystems），PDGFBB（目录#MBB00；R&DSystems）、VEGF（Millipore）、FGF21（目录#EZRMFGF21-26K；Millipore）、胃泌素（目录#E91224mu；USCN生命科学）、脂联素（目录号EZMADP-60K；Millipore）、Ostepontin（目录号MOST00；研发系统）和Osteocalcin（目录编号EIA4010；国际）。使用基于多重分析的方法测量内分泌激素（目录#MENDO-75；Millipore）、肠道激素（目录#MGT-78K；Millipore）、脂肪因子（目录#MADPK-71K；Milliepore）和细胞因子/趋化因子（目录#MPXMCYTO-70K.lxt；Milliopre）。

血清刺激

将凝固的血液在4°C下以8000 rpm离心两次15分钟，然后在−80°C下保存，直到使用。通过释放酶和嗜热菌蛋白酶消化（Roche）从5周龄雄性小鼠中分离胰岛，手工挑选，并在含有7mM葡萄糖和10%FBS（v/v）的RPMI 1640中培养16小时。将总共150个大小匹配的小鼠胰岛在含有3mM葡萄糖的0.1%BSA（v/v）的RPMI 1640中饥饿3小时，然后用含有5.5mM葡萄糖的RPMI 1640处理，每12小时补充一次从3或12个月大的LIRKO和对照小鼠获得的10%（v/v）血清。20到48小时后，人工挑选胰岛，用4%多聚甲醛固定，包埋在琼脂糖/石蜡中，并切片进行免疫组织化学研究。为了评估β细胞的复制，在Ki67、TUNEL和胰岛素免疫染色后通过荧光显微镜分析切片。

LECM刺激

肝脏外植体条件培养基的制备来自Nicolau等人（2009年）用Avertin（240 mg/kg腹腔注射）麻醉小鼠，并从LIRKO或对照小鼠上解剖100 mg肝外植体。外植体在冷PBS中清洗两次，在37°C的PBS中培养30分钟，然后在含有5.5 mM葡萄糖的无血清Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）中培养。培养3天后，收集LECM，离心，并在−80°C下保存至使用。胰岛最初在含有3mM葡萄糖和0.1%BSA的DMEM中饥饿3小时，然后用含有10%LECM的DMEM/5.5 mM葡萄糖培养基刺激24小时。Ki67、TUNEL和胰岛素免疫染色后用荧光显微镜分析胰岛β细胞增殖和凋亡。

HCM刺激

通过门静脉灌注胶原酶消化从6个月大的LIRKO和对照小鼠中分离肝细胞(Sun等人，2005年). 小鼠用阿维汀麻醉（240 mg/kg腹腔注射），门静脉用JELCO 22G 31英寸导管插管（Smiths Medical）。用EGTA溶液灌注肝脏（5.4 mmol/l KCl，0.44 mmol/l KH2人事军官4，140 mmol/l氯化钠，0.34 mmol/l氯化钠2高性能操作4和0.5 mmol/l EGTA（pH 7.4）），并用含有0.075%I型胶原酶的DMEM消化。在肝细胞清洗培养基（Invitrogen）中清洗肝细胞两次。将分离的小鼠肝细胞接种在胶原涂层的6孔板（BD BioCoat）中，密度为106含有25 mM葡萄糖和10%FBS（v/v）的DMEM中的细胞/孔。16小时后，在含有5.5 mM葡萄糖的无血清DMEM中培养肝细胞24小时。收集HCM，离心并保持在−80°C。胰岛最初在含有3 mM葡萄糖和0.1%BSA的DMEM中饥饿3小时，然后在含有50%HCM的DMEM/5.5 mM葡萄糖培养基中培养24小时。Ki67、TUNEL和胰岛素免疫染色后用荧光显微镜分析胰岛β细胞增殖和凋亡。

人类岛屿研究

人类胰岛是从综合胰岛分配计划中获得的。使用的所有研究和方案均由Joslin糖尿病中心人类研究委员会批准（CHS#5-05）。抵达后，胰岛在迈阿密1A号媒体（Cellgro）培养过夜。然后将胰岛在最终清洗/培养基（Cellgro）中饥饿3小时，然后用血清（稀释至10%v/v）、LECM（稀释至10%v/v，或HCM（稀释至50%v/v。）刺激24小时。

免疫染色研究

使用抗Ki67（BD）、抗胰岛素（Abcam）或抗胰高血糖素（Sigma-Aldrich）抗体通过免疫染色分析胰腺和胰岛。

增殖β细胞计数

在所有实验中，细胞计数都是由单个观察者以盲法手动进行的。用免疫荧光显微镜检测BrdU+或Ki67+β细胞。显示细胞核DAPI染色的胰岛素+细胞被认为是β细胞。显示DAPI+和Ki67+（或BrdU+）核共定位染色的胰岛素+细胞被视为增殖性β细胞。在所有实验中，通过共焦显微镜在随机选择的细胞中证实了双阳性细胞（Ins+/BrdU+或Ins+/Ki67+）。

BrdU注射研究

在动物处死前5小时腹膜内注射BrdU（100mg/kg体重）用于胰腺的免疫染色。体内血清给药实验中的BrdU注射分三次进行，如图2A.

统计分析

所有数据均以平均值±SEM表示，并使用非配对双尾Student t检验进行分析。小于0.05的p值被认为是显著的。

补充材料

01

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致谢

我们感谢C.Ronald Kahn分享LIRKO模型。我们感谢Gordon Weir实验室在移植实验中的协助，感谢T.Roderick Bronson在组织学方面的协助，以及Amarnath Kurpad、Marta Robledo、Samantha Haring、Rachael Martinez和Ben Hambro的技术协助。这项工作得到NIH RO1 DK 067536（至R.N.K.）的支持；糖尿病法语协会、糖尿病协会和美国糖尿病协会（致A.E.O）；R01 DK 074795（转W.-J.Q.）；以及Burroughs Wellcome基金、NIH 5 P30 DK36836-20和NIH 1 DP2 OD004345（发给A.J.W.）。A.J.W.是霍华德·休斯医学研究所的早期职业科学家。这项研究的一部分得到了哈佛干细胞研究所种子基金会（R.N.K.）和青少年糖尿病研究基金会/赛诺菲-安万特战略联盟（17-2011-644）（R.N.K.）的资助。

脚注

补充信息

补充信息包括六个图和三个表，可在以下网站上找到http://dx.doi.org/10.1016/j.celrep.2013.01.007.

许可证信息

这是一篇根据知识共享署名-非商业性-无衍生作品许可证的条款分发的开放存取文章，该许可证允许在任何媒体上进行非商业性使用、分发和复制，前提是原始作者和来源得到了认可。

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