神经科学杂志。 2012年11月28日； 32(48): 17306–17320.
GFRα1在主要嗅觉系统发育和功能中的关键作用 , 1, 2 , 2 和 1, 三 卡罗琳·马克斯 1 瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡研究所神经科学系，17177，
2 马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家神经疾病和中风研究所发育神经可塑性研究室，邮编：20892
莱昂纳多·贝卢西奥 2 马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家神经疾病和中风研究所发育神经可塑性研究室，邮编：20892
卡洛斯·伊瓦涅斯 1 瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡研究所神经科学系，17177，
三 新加坡国立大学生理学系生命科学研究所，新加坡117456
1 瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡研究所神经科学系，17177，
2 马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家神经疾病和中风研究所发育神经可塑性研究室，邮编：20892
三 新加坡国立大学生理学系生命科学研究所，新加坡117456
通讯作者。 贡献者 作者贡献：C.M.和C.F.I.设计的研究； C.M.进行研究； C.M.、L.B.和C.F.I.分析数据； C.M.、L.B.和C.F.I.撰写了这篇论文。
收到日期：2012年3月28日； 2012年9月15日修订； 2012年9月20日验收。
版权 ©2012作者0270-6474/12/3217306-15$15.00/0
摘要 胶质细胞系衍生神经营养因子（GDNF）及其受体GFRα1在嗅上皮（OE）和嗅球（OB）中显著表达，但其对嗅觉系统发育的重要性尚不清楚。 我们研究了GFRα1缺乏对小鼠嗅觉系统发育和功能的影响。 在OE中，GFRα1在基础前体细胞、未成熟嗅觉感觉神经元（OSN）和嗅鞘细胞（OEC）中表达，但不包括在成熟OSN中。 新生儿OE 格拉1 敲除小鼠更瘦，含有更少的OSN，但有更多的分裂前体，这表明神经发生不足。 未成熟OSN轴突束增大，相关OECs增加，表明OECs和OSN轴突迁移受损。 在OB中，GFRα1表达于未成熟的OSN轴突和神经层OEC，以及二尖瓣和簇状细胞，但不包括GABA能中间神经元。 在新生儿敲除中，神经层显著减少，轴突和嗅鞘细胞减少。 球部较小，肾小球较少且无组织，二尖瓣细胞明显减少。 在缺乏酪氨酸羟化酶、钙结合蛋白和钙视网膜蛋白的新生小鼠中，表达酪氨酸羟化酶的中间神经元数量也减少 格拉1 出生时 Gdnf公司 敲除小鼠表现出相似的表型。 在成人杂合子中也发现了类似的缺陷 格拉1 +/− 此外，在嗅觉功能的行为测试中，突变体的反应减弱。 我们得出结论，GFRα1对主要嗅觉系统的发育和功能至关重要，有助于所有主要类别神经元和胶质细胞的发育和分配。
材料和方法
动物 杂合的 Gfr公司 α 1 +/− ( Enomoto等人，1998年 )以及 Gdnf公司 +/− ( Pichel等人，1996年 )突变小鼠分别在混合C57/129和CD1基因背景下繁殖，以获得窝仔进行分析。 在同一实验中使用的野生型对照鼠和突变鼠，无论是敲除鼠还是杂合子成年鼠，总是来自同一窝。 对于胚胎小鼠，定时怀孕的雌性小鼠（阴道堵塞的天数等于胚胎第0.5天）被宫颈脱位杀死。 将胚胎和新生幼犬迅速斩首，并将其置于0.1%的多聚甲醛（PFA）中 米 PBS在4°C下2小时（所有GFRα1免疫组织化学）或过夜（所有其他免疫组织化学的）。 出生后第0天（P0）以上的小鼠用戊巴比妥麻醉，并经心灌注0.1 米 PBS后行4%PFA，解剖并固定2小时或过夜。 然后将所有样品在PBS中清洗，在4°C的30%蔗糖中冷冻，包埋在OCT化合物中，在干冰和100%乙醇的溶液中快速冷冻，最后使用徕卡低温恒温器在冠状面20μm处将其连续切片到Superfrost Plus（Thermo Fischer Scientific）载玻片上，风干并在−20°C下保存，直至使用。 此外，来自GAD67-GFP、GAD65-GFP小鼠的组织( Tamamaki等人，2003年 )和OMP-GFP( 波特等人，2001年 )在相同条件下用于GFRα1共表达分析（Jackson实验室）。 斯德哥尔摩的Norra djurförsöksetiska nämnd批准了动物实验方案，并符合卡罗林斯卡研究所的道德准则。
现场 杂交 将P0和2周龄的新鲜组织快速解剖并在OCT包埋介质中快速冷冻，使用徕卡冷冻器将20μm冠状切片收集到Superfrost Plus载玻片上，并在4%PFA中固定20分钟。 现场 用地高辛（DIG）标记的RNA探针对小鼠进行杂交 格拉1 , Gdnf公司 ，以及 间隙 -如前所述的43个cDNA C末端区域( Verhaagen等人，1990年 ; Pozas和Ibáñez，2005年 ). 将载玻片在65°C下杂交过夜。 用碱性磷酸酶结合抗DIG抗体（Roche）在4°C下检测信号，然后用NBT/BCIP（Promega）溶液在室温下检测信号。
免疫组织化学 将载玻片从−20°C下取出，风干，封闭1 h（0.1 米 PBS、5%正常驴血清和0.2%Triton X-100），在以下一级抗体（与封闭溶液相同）中室温孵育过夜：山羊抗GFRα1（1；200；R&D）、兔抗GAP-43（1；500；Novus Biological）、山羊抗OMP（1；5000；Wako Pure Chemicals）、兔抗裂半胱天冬酶-3（1；500:Cell Signaling Technology）、， 小鼠抗Reelin克隆G10（1；300；Millipore）、鸡抗T盒脑（Tbr1）（1:250；Millipore）、兔抗钙结合蛋白， 大鼠抗NCAM（1:500；BD-PharMinen）和豚鼠抗泡谷氨酸转运体2（VGlut2）（1:400；Millipore）。 在PBS中洗涤3次（10分钟）后，将载玻片与以下荧光二级抗体（与阻断剂相同的稀释剂）在室温下孵育2小时：驴抗山羊Alexa Fluor 488、568或647； 驴抗兔Alexa Fluor 488、555或647； 驴抗鼠Alexa Fluor 488、555或647（所有来自Invitrogen的Alexa Fluor次要产品均以1:500使用）； 驴抗鼠DyLight 549； 驴抗鸡DyLight 488； 和驴抗豚鼠DyLight 549（所有来自Jackson ImmunoResearch的DyLight-secondary在1:400时使用）。 最后，将载玻片在PBS中清洗三次（每次10分钟），在PBS（1:10000；Sigma）中清洗5 mg/ml的4′-6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI），在0.1 米 H中的Tris-EDTA 2 O，然后风干，盖上DAKO荧光安装介质。
溴脱氧尿苷脉冲注射 将溴脱氧尿苷（BrdU）（50 mg/kg体重）溶于0.9%NaCl和PBS中，在E19对定时交配的孕妇进行腹腔注射。 BrdU给药后2 h收集胚胎，并按照上述要求进行标准组织处理。 切片在37°C的2N HCl中培养20分钟，使DNA变性，然后在上述条件下使用大鼠抗BrdU一级抗体（1:500；Accurate Chemical&Scientific）和驴抗大鼠DyLight 549二级抗体（1:1400；Jackson ImmunoResearch）进行免疫组化染色。
成像和细胞计数 所有荧光图像均由卡尔蔡司LSM 710共焦显微镜和ZEN 2009软件捕获。 使用立式卡尔蔡司Axioskop显微镜、OrcaER数码相机（哈马松）和Openlab软件（PerkinElmer）拍摄了亮场图像。 对于所有细胞计数，从每组内每只动物的OE或OB的前部、中部和后部采集了9个代表性图像( n个 =所有组10）。 在OE中，沿隔膜取样单个光学截面（1μm）图像。 使用Volocity Image Analysis Software（PerkinElmer）手动计算每2 mm OMP和GAP43阳性细胞总数以及每4.5 mm BrdU和caspase-3总数，并按OE求和进行统计比较。 对于P0（Tbr1、Reelin、TH、CB和CR）时的所有OB细胞计数，低功率共焦 z（z） -收集覆盖每个节段整个OB的叠加图像（5μm厚，10倍放大，0.6倍缩放）。 使用Volocity对细胞进行类似的计数，并对每只动物和每组每个OB的九张图像进行汇总。 对于成人OB（Reelin、TH、CB、CR）内的所有细胞计数，共聚焦 z（z） -沿内侧表面采集叠层图像（20μm厚，10倍放大，0.7变焦，9 mm），对每个OB进行计数和汇总，以便每组10只动物进行比较。
肾小球大小和数量 九个代表性共焦焦（前、中、后） z（z） -在P0（野生型和无野生型）和7周龄（野生型与杂合子）的10只动物中，沿每个OB的内侧表面获取肾小球层（GL）的叠加图像（20μm厚，10倍放大，0.7倍放大，9 mm），以量化肾小球大小。 如前所述，使用三个标记物定义肾小球边界：OMP、VGlu2和DAPI( Treloar等人，2009年b ; 莫布里等人，2010年 ). 使用ZEN 2009 Light Edition中的Closed Polyline工具测量肾小球面积，以精确定义 x个 , 年 ，以及 z（z） 飞机。 对每个OB的肾小球大小值进行平均，并显示为平均值±SEM。通过手动计算九个代表性低功率衰竭患者的肾小球总数来计算肾小球数 z（z） -叠加每个OB的图像，并显示为平均值±SD。
行为测试
埋藏食物测试。 测试按照前面所述进行( Yang和Crawley，2009年 ). 成年雄性野生型和 格拉1 对同窝杂合小鼠（7-10周龄）进行测试( n个 =每个基因型20）。 在试验前连续三天，给小鼠均匀大小的美味食物刺激物（特迪·格拉汉姆；纳比斯科）作为气味熟悉剂。 试验前16小时剥夺小鼠的食物。 然后，将每只小鼠放入试验笼（46×23.5×20 cm）中，其中包含3 cm深的干净垫层，进行5分钟的驯化期。 然后将小鼠转移到一个干净的空笼子里。 食物刺激物被放置在床上用品下1厘米深的测试笼的任意角落，床上用品表面被磨平。 将小鼠放回试验笼中，记录2米外（最多15分钟）的潜伏期，直到小鼠发现埋藏的食物刺激物。 找到埋藏食物的延迟时间是指老鼠揭开埋藏食物并开始用前爪抓住食物吃的时间（以秒为单位）。 数值显示为平均潜伏期±SEM。
天生的嗅觉偏好和敏感性测试。 按照之前发布的内容进行测试( Kobayakawa等人，2007年 ; Witt等人，2009年 ). 成年雄性野生型和 格拉1 杂合同窝小鼠（7-10周龄）只接受一次测试( n个 =每种基因型和气味均为14）。 小鼠在干净的空笼子中单独适应实验环境30分钟，与测试笼子相同，然后转移到新的笼子中。 习惯又重复了三次。 然后将小鼠转移到试验笼（20×15×13 cm）中，并放入一张有水或试验气味的滤纸（2×2 cm）。 用数码摄像机记录老鼠的行为以进行分析。 在3分钟的测试期间，以秒为单位测量滤纸的调查时间。 通过在1 mm距离内接触滤纸进行鼻腔检查。 使用的气味浓度如下：蒸馏水（20μl）、花生酱（10%w/v，40μl），雌性小鼠尿液（20μl），香兰素（64μl） 米 ，20μl），丁香酚（128μl 米 ，20μl）、2-甲基丁酸（2-MB；8.7M，20μl）和三甲基噻唑啉（TMT；7.65M，20μl）。 所有加臭剂（Sigma）都溶解在蒸馏水中，花生酱除外，花生酱溶解在矿物油中。 数值显示为平均调查时间±SEM。
统计分析 所有图形和统计数据均在GraphPad Prism 5.0中执行。 一对学生的 t吨 假设双尾分布和两样本不等方差，进行检验以检验统计显著性。 所有图中的所有值和图形均显示为平均值±SD（除了GL区域和行为分析，其中双尾未配对学生的 t吨 进行了测试，平均值显示为平均值±SEM）； 每个星号表示具有统计显著性 第页 数值<0.05。
结果 在发展中的OE中表达GFRα1的细胞类型 通过免疫组织化学方法评估GFRα1在整个发育中的小鼠嗅觉系统中特定细胞类型的表达定位，并辅以 就地 杂交实验，如图所示。 选择特定时间点是因为它们在嗅觉系统发育时间线内的重要性( Treloar等人，2009年 ). GFRα1抗体的特异性通过比较野生型和 格拉1 敲除组织切片。 未观察到染色 格拉1 用本研究中使用的抗体敲除小鼠（数据未显示）。 用于 就地 杂交也通过相应的感觉探针没有染色来验证（数据未显示）。
OE是主要嗅觉系统的外围成分，是一种假复层神经上皮，由多种细胞类型组成，包括基底层的干细胞和前体细胞、中上层的未成熟和成熟嗅觉感觉神经元（OSN）以及最顶端层的支持或支持细胞( Treloar等人，2009年 ). 基础自我更新干细胞产生一批过渡扩增细胞，然后分裂产生中间前体，其后代分化为OSN( Nicolay等人，2006年 ; 默多克和罗斯卡姆，2007年 ). 未成熟和成熟OSN都表达NCAM，但可以通过GAP-43和嗅觉标记蛋白（OMP）的差异表达来区分( Farbman和Margolis，1980年 ; Verhaagen等人，1989年 ). 当OSN分化时，它们延伸轴突，穿过下面的OE基底膜（BL），并向OB形成的端脑吻侧导航。 在BL下方，胶质起源的异质迁移细胞群，即嗅鞘细胞（OEC），沿着OSN轴突迁移至OB。 OEC包裹OSN轴突，可以通过不同标记物的表达来识别，包括LN、整合素-α6和p75神经营养素受体( Chuah and West，2002年 ; Whitley等人，2005年 ). 到达OB的嗅神经层（ONL）后，未成熟OSN开始进入OB肾小球，因为它们关闭GAP-43表达，开始表达OMP，并分化为成熟感觉神经元( Farbman和Margolis，1980年 ; Miragall和Monti Graziadei，1982年 ; Verhaagen等人，1989年 ).
在小鼠OE中，GFRα1在整个上皮细胞的E12.5和E14.5处强烈表达，随后在出生时与基底部结合（P0），最终在2周大时局限于最基底部( A类 )它一直持续到成年。 通过免疫组化获得的GFRα1表达模式通过 就地 杂交 格拉1 P0和2周龄时的mRNA( B类 , D类 ). 在上皮细胞中，GFRα1与GAP-43共定位于未成熟OSN及其BL下轴突束，P0( C类 ). 与此一致， Gfra1信使核糖核酸 在未成熟OSN层中也检测到 GAP-43型 mRNA，以及由基底前体细胞组成的上皮细胞的最底部( D类 ). 在BL下，免疫组化显示GFRα1在与OSN轴突相关的OEC中表达，与LN共表达即可证明( E类 ). 有趣的是，GFRα1被排除在表达OMP的成熟OSN之外，这些OSN位于OE的更顶端区域( F类 ). 2周后及以后，GFRα1明显局限于OE的最基本层，不包括在这些阶段占据OE大多数的成熟、表达OMP的OSN( F类 ).
GFRα1在发育中的小鼠OE中的表达。 A类 ，通过免疫组织化学方法评估E12.5、E14.5、P0和2周时小鼠OE中GFRα1的表达概况。 比例尺：（E12.5）、100微米（E14.5）、50微米（P0）和50微米（2周）。 B类 ，的表达式 格拉1 mRNA在发育中的小鼠OE中的分析 就地 P0和2周时杂交。 比例尺：200微米（P0）、50微米（2周低功率）和50微米（两周高功率）。 方框显示了中的区域 D类 . C类 ，新生小鼠OE中GAP43阳性未成熟轴突和OSN中GFRα1的表达。 比例尺，50μm。 D类 ，的表达式 格拉1 新生儿OE基底细胞和GAP-43阳性未成熟OSN中的mRNA。 比例尺，50μm。 E类 ，GFRα1在新生OE的LN表达OEC中的表达。 比例尺，50μm。 F类 在P0和2周时，GFRα1没有与OMP阳性的成熟OSN共定位，仅限于OE的未成熟和基底细胞层。 比例尺：50μm（P0和2周）。
生长期OB中表达GFRα1的细胞类型 OB在小鼠中从E12.5发展为头端脑的外翻。 它包含两类谷氨酸能投射神经元，二尖瓣和簇状细胞，以及两类主要的抑制性中间神经元，颗粒细胞和肾小球周细胞。 投射神经元表达Reelin和Tbr1( Bulfone等人，1995年 , 1998 ; Hurtado-Chong等人，2009年 ). 二尖瓣细胞的顶端树突与肾小球内OSN传入的轴突结合，形成突触。 抑制性中间神经元形成一个异质性组，表达GAD65或GAD67，并且可以通过CB、CR或TH以互斥模式的表达来进一步区分( Parrish-Aungst等人，2007年 ).
在E12.5和E14.5，到达发育中OB的轴突束在包裹灯泡时表达高水平的GFRα1( A类 ). 通过P0，OB周围的ONL强烈标记GFRα1( A类 ). 侧脑室（LV）内的细胞也呈GFRα1阳性。 此期二尖瓣细胞层（MCL）和左室也可见GFRα1染色( A类 ). 2周龄时，GFRα1在MCL和外丛状层（EPL）的ONL和投射神经元中持续存在，在与嘴侧移行流（RMS）相关的细胞中稀疏表达； A类 ). 这一总体模式也得到了以下方面的证实 就地 杂交实验也揭示了 Gfra1型 ONL细胞中的mRNA表达，很可能是OECs( B类 ). 在新生儿OB的ONL中，GFRα1的表达主要与GAP-43在未成熟OSN轴突中共定位，但不包括在表达OMP的成熟OSN神经轴突中( C类 ). 与此一致，GFRα1和NCAM在ONL中部分重叠，因为NCAM标记未成熟和成熟OSN轴突。 在ONL的LN表达的OEC中也观察到GFRα1免疫反应( C类 )，符合我们的 就地 杂交研究。 此外，与Reelin和Tbr1共定位显示，发育中OB的投射神经元也表达GFRα1( D类 ).
GFRα1在发育中的小鼠OB中的表达。 A类 ，通过免疫组织化学方法评估E12.5、E14.5、P0和2周时小鼠OB中GFRα1的表达概况。 方框表示P0和2周右侧面板中的高倍图像。 比例尺：200微米（E12.5）、100微米（E14.5）、200微米（P0低功率）、50μm（P0高功率）、500μm（2周低功率）和100微米（2周高功率）。 B类 ，的表达式 格拉1 mRNA在发育中的小鼠OB中的分析 就地 P0和2周时杂交。 比例尺：200μm（P0）和100μm（2周）。 C类 新生OB ONL中GFRα1和GAP-43（未成熟OSN轴突）、OMP（成熟OSN轴索）、NCAM（所有OSN轴索）和LN（OEC）的双重标记。 在OMP-GFP转基因小鼠中检测到OMP，并通过GFP荧光显示OMP。 LN面板显示中线上相邻OB的两个ONL。 比例尺，50μm。 D类 、新生儿OB中GFRα1和Tbr1或Reelin的双重免疫荧光。 比例尺，50μm。 E类 ，新生儿OB中GFRα1和GABA能标记物之间缺乏共定位。 如图所示，通过免疫组织化学方法在GAD65-GFP和GAD67-GFP转基因小鼠的OB中检测到GFRα1（红色）。 通过GFP荧光显示GAD65和GAD67。 左，显示整个OB冠状切片。 中间，显示实线框的高倍放大。 右侧，显示虚线框的高度放大。 尺寸条； 100μm（左）、50μm（中）、20μm（右）。 F类 ，新生儿OB中GFRα1（红色）和中间神经元标记物TH、CB和CR（绿色）的双重免疫荧光。 TH未见重叠。然而，如箭头所示，少数CB和CR阳性中间神经元与GFRα1共定位。 比例尺，100μm。
在新生儿OB中GAD65-或GAD67-阳性GABA能中间神经元中均未检测到GFRα1表达( E类 ). 在肾小球和颗粒细胞层（GCL）以及包含LV开口的OB最中央部分可见分散的GFRα1阳性细胞。这些细胞均未与GAD65或GAD67共定位( E类 ). 表达TH的GABA能中间神经元亚群，几乎只表达GAD67阳性( Choi-Lundberg和Bohn，1995年 ; Parrish-Aungst等人，2007年 )，没有GFRα1表达( F类 ，左）。 此外，绝大多数CB和CR阳性的肾小球周围中间神经元也缺乏GFRα1( F类 ). 尽管其中一些细胞确实显示出与GFRα1共定位( F类 ，箭头），因为它们没有共存GAD-65或GAD-67（数据未显示），所以它们都不是GABA能的。 以前曾在小鼠OB中描述过CB和CR阳性细胞的非GAB能群体( De Marchis等人，2004年 ; Waclaw等人，2006年 ; Parrish-Aungst等人，2007年 )但其发展渊源和功能尚未阐明。
我们对主要嗅觉系统中表达GFRα1的细胞类型的发现与早先的一项研究形成了对比，该研究报告了成年大鼠整个OE中GFRαl的表达，主要在成熟OSN对应的层中，也在OB肾小球中( Maroldt等人，2005年 ). 然而，该报告的作者没有使用GAP-43或OMP进行共定位研究，以精确定位OE内的GFRα1信号，也没有使用任何OB标记。 此外，我们发现该研究中使用的抗GFRα1抗体产生的信号与 格拉1 敲除组织与野生型无法区分（数据未显示）。 另一方面，这里使用的抗体检测到了已知表达该受体的所有其他主要细胞群，包括中脑多巴胺能神经元、运动神经元、肠神经元和肾单位； 在所有情况下，标签在年被废除 格拉1 敲除组织（数据未显示）。
Gdnf公司 发育中嗅觉系统的表达 为了确定发育中小鼠嗅觉系统中GDNF的细胞来源，我们进行了 就地 新生儿和2周龄OE和OB的杂交研究。 Gdnf公司 在新生儿和2周龄OE的成熟和不成熟OSN层中均检测到mRNA表达( A类 ). BL下方表示 Gdnf公司 在分离的OEC中也可以检测到mRNA。 在新生儿OB中， Gdnf公司 mRNA表达在MCL、ONL和GLs和GCL的散在细胞中最为显著( B类 ). 2周大时，身体强壮 Gdnf公司 mRNA表达可在OB的大多数细胞成分中检测到，包括ONL的OEC、肾小球周围细胞、EPL和MCL的投射神经元以及颗粒细胞( B类 ). 丰富 Gdnf公司 RMS中也观察到mRNA表达，与之前的观察结果一致( Paratcha等人，2006年 ). 总之，这些数据表明，在发育中的小鼠嗅觉系统中，GDNF的大量表达与表达GFRα1受体的细胞和轴突非常接近，这表明存在旁分泌作用模式。
Gdnf公司 发育中嗅觉系统的mRNA表达。 A类 ，的表达式 Gdnf公司 mRNA在发育中的小鼠OE中的分析 就地 P0和2周时杂交。 箭头表示OEC表示 Gdnf公司 BL.iOSNs下方的mRNA，未成熟OSNs； mOSN，成熟的OSN。 比例尺：100微米（P0），100微米（2周）。 B类 ，的表达式 Gdnf公司 mRNA在发育中的小鼠OB中的分析 就地 P0和2周时杂交。 箭头表示OEC表示 Gdnf公司 ONL中的mRNA。 比例尺：100μm（P0）、200μm（2周低倍）和100μm。
缺乏GFRα1小鼠OE中OSN的丢失和紊乱 研究了GFRα1对嗅觉系统发育的重要性，该受体在小鼠中被全面敲除( Enomoto等人，1998年 ). 纯合子 格拉1 −/− 突变小鼠出生时死于肾发育不全和肠道神经系统缺陷( Cacalano等人，1998年 ; Enomoto等人，1998年 ). 因此，我们对嗅觉系统的分析主要是在新生儿纯合子突变体中进行的。 对于OB，我们的一些研究也扩展到了7周龄的杂合突变体（见下文）。
新生儿OE检查 格拉1 −/− 突变小鼠表现出几种形态异常，尤其是上皮细胞总体变薄和未成熟轴突束显著增大( A类 ). OMP免疫组化显示出生时突变OE中高达27%的成熟OSN丢失( A类 , D类 ). 成熟OSN的分布在 格拉1 −/− 突变体与野生型对照的比较( A类 ). 此外，成熟的OSN轴突束较小，突变体中有尖突，这两种都是轴突退化的迹象( A类 ，OMP面板中的箭头）。 GAP-43免疫组化显示突变OE中未成熟OSN损失33%( A类 , D类 ). 然而，与成熟OSN的轴突束相比，突变体的未成熟轴突束显著增大( A类 ，GAP-43面板中的星号）。 未成熟OSN轴突束的扩张伴随着BL下相关OEC的扩张( B类 ). OMP（成熟轴突）、NCAM（所有轴突）和LN（OECs）的三重标记清楚地显示了未成熟轴突束的特异性增大和OECs的相关增加 格拉1 −/− 出生时的突变体( B类 ).
缺乏GFRα1的小鼠OE中OSN的丢失和紊乱。 A类 、成熟（OMP，绿色）和未成熟（GAP43，红色）OSN及其野生型和 格拉1 −/− 出生时的突变OE。 箭头表示轴突束（AB）。 星号表示AB不成熟。 含有OEC的固有层（LP）用虚线标记。 比例尺：100μm（顶行）、50μm（底行-OMP和GAP-43）。 iOSN，不成熟的OSN； mOSN，成熟OSN。 B类 、OEC（LN，红色）、所有OSN（NCAM，绿色）在新生儿野生型和 格拉1 −/− 与所有细胞（DAPI，蓝色，顶行）或成熟OSN（OMP，蓝色，底行）相关的突变OE。 箭头所示为正常大小的成熟和不成熟轴突AB（OMP和NCAM共存）。 星号表示仅在未成熟轴突突变体中AB增大（NCAM和OMP无共表达）。 比例尺，50μm。 C类 、活化裂解caspase-3（箭头）和BrdU在新生儿野生型和 格拉1 −/− 突变OE。 DAPI反染色（蓝色）。 箭头指示增加最大的单元格类型。 比例尺：100μm。 D类 ，OMP阳性成熟OSN（mOSN）（左侧）细胞密度显著降低(* 第页 < 0.001, t吨 =28.6）新生儿 格拉1 −/− 突变体（529.7±31.3， n个 =10）与野生型（722.3±20.6， n个 =10）。 GAP-43阳性未成熟OSN（iOSN）（右）每个OE的细胞密度显著降低(* 第页 < 0.0001, t吨 =42.0）（P0） 格拉1 −/− 突变型（561.6±34.0， n个 =10）与野生型（840.6±35.0， n个 = 10). 数值为平均值±标准差。 E类 ，每个OE激活的caspase-3细胞总数（右）显示显著增加(* 第页 < 0.0001, t吨 =28.0）英寸 格拉1 −/− 击倒（457.6±51.3， n个 =10）与对照组（219.3±26.0， n个 = 10). BrdU合并细胞（左）显著增加(* 第页 < 0.0001, t吨 =61.6）（P0） Gfra1型 −/− 突变体（804.9±34.3， n个 =10）与野生型（439.8±20.9， n个 = 10). 数值为平均值±SD。 F类 、活化caspase-3与NCAM（顶部星号）、OMP（顶部箭头）和整合素-α6的共染色，整合素是新生儿野生型OE中OEC的替代标记物（底部星号）和 格拉1 −/− 突变体。 比例尺，50μm。 G公司 、BrdU与GAP43（顶部箭头）、OMP和LN（底部箭头）结合在新生儿野生型OE中的Colocalization，以及 格拉1 −/− 突变体。 比例尺，50μm。
活化caspase-3的免疫染色显示缺乏GFRα1的小鼠OE中的凋亡显著增加( C类 , E类 ). 在野生型OE的所有层中均发现少量凋亡细胞( C类 ). 相反，突变的OE显示出更多的凋亡细胞，特别是在OE的更基底层，包括未成熟的OSN和基底前体，以及固有层下面的细胞中( C类 ). 通过OMP（标记成熟OSN）、NCAM（标记成熟和不成熟OSNs）和整合素-α6（标记OECs）的双重免疫染色证实了这一点。 OEC的整合素-α6免疫反应与LN的免疫反应重叠( Whitley等人，2005年 )，由于激活的caspase-3和LN抗体的动物物种之间不相容，因此在这里使用。 该分析显示，未成熟OSN（即NCAM阳性，OMP阴性）、成熟OSN和OEC中激活的caspase-3增加( F类 ). 虽然未成熟OSN和OEC表达GFRα1，表明这些细胞中存在细胞自主效应，但成熟OSN不存在，因此该亚群中的细胞死亡可能是由于非细胞自主作用所致（见下文）。 为了评估野生型和突变型OE中增殖的基础前体细胞的状态，在E19对怀孕的雌性动物施用BrdU，2小时后提取幼鼠进行分析。 我们发现 格拉1 −/− 突变小鼠与野生型对照组相比，尤其是在基础前体细胞中( C类 , E类 ). OMP、GAP43和LN的双重免疫染色证实突变上皮中未成熟OSN和OEC的增殖增加，而成熟OSN的增殖没有增加( G公司 ，箭头）。 The increased number of proliferating basal cells in the OE of格拉1 −/− 突变小鼠可能反映出其分化为OSN的能力存在缺陷。 或者，或者说，这种增强的扩散可能反映了对OSN损失的补偿。 OEC中增加的BrdU掺入 Gfra1型 −/− 突变体( G公司 ，箭头）与他们在突变OE中增加的数量一致。
减少了ONL和OB中OEC的损失 格拉1 −/− 突变小鼠 与野生型同窝小鼠相比，缺乏GFRα1的新生小鼠表现出较小的OB（数据未显示）。 OMP、GAP-43和NCAM免疫染色显示，与野生型对照组相比，突变OB中的ONL较薄( A类 ). 在未成熟、GAP43阳性的OSN轴突中，ONL的减少更为明显( A类 )同时，表达LN的OEC显著减少( A类 ). 因此，虽然突变体OE中的未成熟轴突束和OEC增大或增加，但OB中的OEC减少，这表明GFRα1是合适的OEC迁移和未成熟OSN轴突靶向所必需的。 未成熟OSN轴突和OECs的减少与突变体ONL中活化的胱天蛋白酶-3的染色增加相关( B类 ). 在未成熟OSN的轴突中主要观察到活化的胱天蛋白酶-3( B类 )，此处称为NCAM + /OMP公司 − 由于激活的caspase-3和GAP43抗体的动物物种之间不相容。 这与我们的OE观察相一致，也与GFRα1在维持未成熟OSN轴突中的细胞自主作用相一致。 一些NCAM − /OMP公司 + 轴突也显示激活的caspase-3染色 格拉1 突变体( B类 )，表明成熟OSN轴突继发性（即非细胞自主性）缺失。 最后，在整合素上也观察到活化的caspase-3 + OEC公司( B类 )与GFRα1在OEC生存中的细胞自主作用一致。
嗅神经层减少和嗅鞘细胞丢失 格拉1 −/− 突变小鼠。 A类 、新生儿野生型ONL中OMP、GAP43、NCAM和LN的免疫组织化学 格拉1 −/− 突变OBs。ONL厚度用折线表示，在成熟（OMP）、未成熟（GAP-43）和所有OSN轴突（NCAM）中明显减少。 表达LN的OEC在 格拉1 −/− 突变体，厚度由两个OB的虚线表示。比例尺，100μm。 B类 在新生儿野生型ONL中活化caspase-3与NCAM、OMP和整合素-α6（OECs的替代标记物）的共染色 格拉1 −/− 突变OBs。比例尺，100μm。
新生儿纯合子和成人杂合子的肾小球缺陷 格拉1 突变体 新生儿纯合子OB中的肾小球 格拉1 −/− 通过免疫组织化学方法对突变小鼠和野生型小鼠进行了VGlu2的评估，该蛋白可特异性标记OSN轴突的肾小球突触前终末( A类 ). 的OB 格拉1 −/− 与野生型对照组相比，突变体含有较大但较少的肾小球( A类 ). 突变肾小球形状不规则且无组织，表明形成/成熟缺陷。 引人注目的是，来自成年（7周）杂合突变小鼠的OB也显示出肾小球异常( B类 ). 特别是，与野生型对照组相比，杂合子突变体的肾小球更小，明显更少( B类 ). 总之，这些数据表明GFRα1在嗅觉肾小球的发育和维持中具有关键的剂量依赖性功能。
新生儿纯合子和成人杂合子的肾小球缺陷 格拉1 突变体。 A类 、野生型Glomeruli和 格拉1 −/− 新生小鼠通过免疫组织化学观察VGlu2（红色）。 底部的OMP（绿色）和DAPI（蓝色）叠加用于定义GL边界。 比例尺，100μm。 直方图显示明显更大(* 第页 < 0.0003, t吨 =5.752）平均肾小球面积 格拉1 −/− 击倒（2640±333.7， n个 =570）与对照组（1427±128.6， n个 = 866). 数值显示为平均值±SEM。肾小球总数也减少(* 第页 < 0.0001, t吨 =37.5）每OB英寸 格拉1 −/− 出生时突变（210.9±22.2， n个 =10）与野生型（317.6±24.7， n个 = 10). 数值显示为平均值±SD）。 B类 7周龄野生型和 格拉1 +/− 杂合小鼠。 比例尺，100μm。 直方图显示明显较小(* 第页 < 0.0001, t吨 =6.933）平均肾小球面积 格拉1 +/− 杂合小鼠（5947±332.9， n个 =711）与对照组（6916±226.0， n个 = 933). 数值显示为平均值±SEM。肾小球总数也显著减少(* 第页 < 0.0001, t吨 =65.39）每OB英寸 格拉1 +/− 杂合小鼠（665.6±35.32， n个 =10）与野生型（937.1±44.82， n个 = 10). 数值显示为平均值±SD。
新生儿纯合子和成人杂合子OB投射神经元的异常分布和丢失 Gfra1型 突变体 研究了二尖瓣和簇状细胞的投射神经元 格拉1 通过使用针对Reelin和Tbr1的抗体进行免疫染色的突变和野生型小鼠。 出生时，纯合子 格拉1 与野生型对照组相比，突变体显示Reelin阳性和Tbr1阳性细胞更少( A类 ). 与野生型对照组相比，这些突变体的MCL和EPL都较薄( A类 ). Reelin和活化caspase-3的双重免疫染色未显示突变OB MCL中凋亡增强的迹象( B类 )提示突变株中二尖瓣细胞的缺乏可能是由于分化和/或迁移缺陷所致。 Reelin的免疫染色显示，簇状细胞发育较晚，并占据EPL中MCL上方的位置( C类 ). 7周龄时，杂合子 格拉1 与野生型对照组相比，突变体显示二尖瓣和簇状细胞数量减少( C类 )表明GFRα1在OB投射神经元的发育中具有剂量依赖性功能。
新生儿纯合子和成人杂合子OB中投射神经元的异常分布和丢失 格拉1 突变体。 A类 、新生儿野生型OB Reelin（红色）和Tbr1（绿色）的免疫组织化学 格拉1 −/− 老鼠。 显示ONL、GL、EPL和MCL。 比例尺，50μm。 直方图显示两个二尖瓣细胞密度都显著降低（左侧每个OB的Reelin阳性细胞* 第页 < 0.0001, t吨 =52.8）和谷氨酸细胞密度（每个OB右侧的Tbr1-阳性细胞* 第页 < 0.0001, t吨 =16.2）P0英寸 Gfr公司 α 1 −/− 突变体（Reelin:4237±230， n个 = 10; Tbr1:3674±260， n个 =10）与野生型（Reelin:5750±194， n个 = 10; Tbr1:5074±192， n个 = 10). 数值为平均值±SD。 B类 ，新生儿OB活化caspase-3染色 格拉1 突变小鼠在二尖瓣细胞层与Reelin不重叠。 比例尺，50μm。 C类 ，Reelin在7周龄野生型OB和 Gfra1型 +/− 杂合子小鼠。 比例尺，100μm。 直方图显示 格拉1 +/− 杂合二尖瓣细胞密度（左MCL中Reelin阳性细胞* 第页 < 0.0001, t吨 = 37.42; 450.9 ± 33.26, n个 =10）和簇状细胞密度（右侧EPL中Reelin阳性簇状细胞* 第页 < 0.0001, t吨 = 34.25; 864.0 ± 54.50, n个 =10）与野生型（二尖瓣细胞密度：554.4±37.76， n个 = 10; 簇状细胞密度：1181.0±76.25， n个 = 10). 数值为平均值±SD。
新生儿纯合子和成人杂合子OB中GABA能中间神经元的缺失 格拉1 突变体 新生儿纯合子和7周龄杂合子的OB 格拉1 突变体表现出肾小球周围和颗粒细胞中间神经元的显著缺失。 TH表达神经元的缺失最为明显（30~40%），其次是CB-表达神经元（27%缺失）和CR-表示神经元（17%缺失）( A类 , B类 ). P0和7周龄突变动物的相对中间神经元损失具有可比性，表明GFRα1以剂量依赖性的方式发挥作用，在出生后的整个发育过程中调节OB中间神经元的分配和/或维持。 野生型和突变型OB的肾小球周和颗粒细胞层中激活的caspase-3免疫反应非常稀少（数据未显示），这表明 格拉1 突变体可能是分化受损或从其起源地迁移的结果。 我们的表达研究（见上文）表明，GFRα1没有与GAD65或GAD67这两个主要的GABA能标记物共定位，并且在TH阳性中间神经元中不存在。 尽管极少数CB和CR表达细胞似乎对GFRα1呈阳性，但这些细胞均不表达GAD65或GAD67。 共表达GFRα1的CB和CR阳性细胞数量非常有限，不能解释突变OB中CB和CR细胞亚群中观察到的损失，这表明许多正常不表达GFRβ1的中间神经元在突变中丢失。 这种情况类似于在大脑皮层观察到的表达小白蛋白的中间神经元的丢失 Gfra1型 突变小鼠，其自身不表达该受体( Pozas和Ibáñez，2005年 ; Canty等人，2009年 ).
新生儿纯合子和成人杂合子OB中GABA能中间神经元的缺失 格拉1 突变体。 A类 、新生儿野生型OB中TH（上排）、CB（中排）和CR（下排）的免疫组织化学 格拉1 −/− 老鼠。 指示ONL、GL、EPL和MCL。 比例尺，100μm。 柱状图显示TH的显著损失(* 第页 < 0.0001, t吨 =36.79），CB(* 第页 < 0.0001, t吨 =33.19）和CR(* 第页 < 0.0001, t吨 =14.56）英寸 格拉1 −/− 突变体（TH:628.7±52.29，CB:1141±36.45，CR:1721±172.2， n个 所有组均为10），与对照组（TH:1010±70.43，CB:1550±43.02，CR:2056±207.8， n个 =所有组10）。 图像是结果的强大表示。 数值为平均值±SD。 B类 7周龄野生型OB和 格拉1 +/− 杂合小鼠。 比例尺，100μm。 直方图显示TH、CB和CR细胞密度的量化。 格拉1 +/− 杂合小鼠TH显著减少(* 第页 < 0.0001, t吨 = 21.05; 709.6±58.58），CB(* 第页 < 0.0001, t吨 = 38.81; 1207±80.44）和CR(* 第页 < 0.0001, t吨 = 11.39; 2081±354.1）中间神经元与野生型（TH:1052±70.19，CB:1647±79.15，CR:2498±446.8， n个 =所有组10）。 数值显示为平均值±标准偏差。比例尺，100μm。
缺乏GDNF的新生小鼠嗅觉系统的类似缺陷 验证GDNF的丢失是否会导致与 格拉1 突变体，我们对新生儿嗅觉系统中成熟和不成熟的OSN、ONL和OB GABA能中间神经元进行了有限的调查 Gdnf公司 敲除小鼠。 出生时， Gdnf公司 −/− 突变小鼠表现出较薄的OE，成熟和不成熟OSN均缺乏，GAP43增大 + 轴突束，所有表型由 格拉1 敲除小鼠( A类 ). 在产科，新生儿 Gdnf公司 −/− 小鼠的ONL显著降低，肾小球形状不规则( B类 ). 对GABA能中间神经元的进一步分析表明，缺乏GDNF的新生小鼠OB中TH-、CB-和CR表达细胞的数量减少( C类 )，也与我们在 Gfra1型 突变体。 有趣的是，OB中的中间神经元损失 Gdnf公司 −/− 和 格拉1 −/− 小鼠非常相似，表明GDNF可能是驱动OB中间神经元中GFRα1介导效应的主要配体。 总之，这些研究表明，这两个突变体出生时的嗅觉系统存在类似的缺陷。
缺乏GDNF的新生小鼠的嗅觉系统缺陷。 A类 、成熟（OMP，绿色）和未成熟（GAP43，红色）OSN及其野生型和 Gdnf公司 −/− 出生时的突变OE。 箭头表示成熟的轴突束。 星号表示轴突束不成熟。 固有层以虚线标记。 比例尺，50μm。 B类 ，新生儿野生型ONL中OMP（绿色，顶部）的免疫组织化学 Gdnf公司 −/− 突变OBs。ONL/GL厚度用虚线表示，在 Gdnf公司 −/− 突变体。 星号表示突变体中形状不规则的肾小球。 DAPI染色（蓝色，底部）显示新生儿OB层减少 Gdnf公司 −/− 突变小鼠。 箭头表示野生型圆形离散肾小球。 比例尺，100μm。 C类 、新生儿野生型OB中TH（上排）、CB（中排）和CR（下排）的免疫组织化学 Gdnf公司 −/− 老鼠。 显示ONL、GL、EPL和MCL。 直方图显示TH、CB和CR细胞密度的量化。 新生儿 Gdnf公司 −/− 突变小鼠TH显著减少(* 第页 < 0.0001, t吨 = 13.75; 940.0±97.96），CB(* 第页 < 0.0001, t吨 = 9.548; 1317±127.5）和CR(* 第页 < 0.0001, t吨 = 20.89; 2021±122.2）中间神经元与野生型（TH:1532±228.3，CB:1844±226.7，CR:2443±117.5， n个 =所有组为10）。 数值显示为平均值±标准偏差。比例尺，100μm。
嗅觉功能行为测试显示成人杂合子嗅觉反应受损 格拉1 突变体 成人杂合子嗅觉系统意外的神经解剖学缺陷 格拉1 突变体促使我们研究这些动物的嗅觉功能。 使用标准化嗅觉测试对气味的行为反应进行了调查。 在埋藏食物检测中，动物在经历了一段时间的食物限制后，会在笼子垫层中寻找一粒可口的食物( Yang和Crawley，2009年 ). 嗅觉障碍已被证明会显著损害该测定的性能，导致食物颗粒回收的潜伏期更长。 成人杂合子 格拉1 与野生型小鼠相比，突变体显示出更长的潜伏期( A类 )表明嗅觉反应减弱。 为了对嗅觉功能进行更具体的评估，对突变和野生型动物进行先天嗅觉偏好和敏感性联合测试。 在这项测试中，向一只老鼠展示一种在滤纸上发现的确定气味，并记录老鼠调查滤纸的时间。 不同组的小鼠被呈现出不同的气味，已知这些气味会引起天生的反应，即分别是吸引、中性和厌恶； 在测试期间，每只动物只接触一种气味( Kobayakawa等人，2007年 ; Witt等人，2009年 ). 水通常会导致～4 s的调查时间，这被视为中性响应阈值( B类 ). 与水相比，花生酱和异性尿液等诱人的气味会引起较长的调查时间，而2-MB（变质食物的刺激性气味）和TMT（狐狸尿液的成分）等厌恶性气味会导致较短的调查时间。 中性气味，如香草醛和丁香酚，不会引起小鼠天生的嗅觉反应，因此调查时间与水相当。 野生型雄性小鼠反应如预期，对花生酱和雌性小鼠尿液的调查时间更长； 水、香兰素和丁香酚的使用时间相似； 对于2-MB和TMT，时间更短( B类 ). 杂合的 格拉1 突变体对水和中性气味也表现出正常反应。 然而，与野生型小鼠相比，他们对诱人气味的研究时间显著缩短( B类 ). 重要的是，杂合突变体对小鼠尿液的反应在气味物质稀释5倍后降至中性水平，而野生型动物则继续表现出诱人的反应，稀释10倍( B类 ). 这些结果表明突变体的嗅觉敏感性降低。
杂合子嗅觉功能受损 格拉1 突变体。 A类 ，埋藏食物分析。 成年男性杂合子 格拉1 突变小鼠表现出显著的(* 第页 < 0.0001, t吨 =6.286）更长的延迟（56.10±8.51，秒）， n个 =20）与野生型对照组（169.8±15.95， n个 = 20). 数值显示为以秒±SEM为单位的平均延迟。 B类 天生的嗅觉偏好和敏感性测试。 直方图描述了野生型和 Gfr公司 α 1 杂合子小鼠研究了一种带有各种气味的气味滤纸，在3分钟的试验期间进行了测量。 以材料和方法（1:1）中给出的浓度测试所有加臭剂； 雌性小鼠尿液和TMT也以1:5和1:10的稀释度进行测试。 虚线表示中性响应水平（水）* 第页 每种气味<0.0001，与野生型相比； # 第页 <0.0001，与野生型水相比， n个 每种基因型和气味均为14。 数值显示为平均调查时间，单位为秒±SEM。
杂合子反应 格拉1 厌恶气味的突变体更复杂。 在高浓度下，2-MB和TMT的调查时间比水长，可与花生酱和雌性尿液的诱人气味相比，并且比野生型小鼠的调查时间长得多( B类 ). 虽然这一结果起初可能令人费解，但行为测试的数据应谨慎解释，因为众所周知，对气味的行为反应受其浓度的影响。 啮齿动物嗅觉识别的速度和准确性之间有一个众所周知的权衡( Abraham等人，2004年 ; Rinberg等人，2006年 ); 因此，杂合子可能 格拉1 由于嗅觉敏感性降低，突变体在先天偏好测试中需要更多的时间来识别厌恶气味的性质。 与这种可能性一致，经过5倍稀释后，突变体对TMT的反应与对水的反应变得无法区分，而野生型小鼠仍然同样反对这种气味物质的5倍和10倍稀释( B类 )表明突变体的检测阈值降低。 总之，这些结果表明成人杂合子的嗅觉反应受损 格拉1 突变体小鼠和强化GFRα1在嗅觉系统发育和功能中的重要作用。
讨论 在本研究中，我们使用特定的细胞标记物确定了GFRα1在主要嗅觉系统上皮和球中的精确细胞分布，并研究了GFRβ1在突变小鼠嗅觉系统发育中的重要性，在突变小鼠中，GFRαl表达缺失或减少。 我们的发现揭示了GFRα1在主要嗅觉系统几个主要细胞类型的发育中的关键作用，包括OSN、OEC、投射神经元和抑制性中间神经元。
与野生型对照组相比，缺乏GFRα1的小鼠的OE更薄，含有更少的OSN，并且显示裂解caspase-3的水平增加。 因此，GFRα1可能在未成熟OSN中自主发挥作用，调节其分化和存活。 由于干细胞分化和OSN神经发生缺陷，突变株中产生的OSN也可能较少。 与此一致，我们观察到缺乏GFRα1的小鼠OE基底部的BrdU标记增加。 突变体中基底细胞增殖的增加也可能反映了一种弥补OSN损失的尝试。 区分这些可能性需要选择性失活OE干细胞、未成熟OSN和OB靶点中的GFRα1表达。
突变体OE中表达GAP-43的未成熟OSN轴突束显著增大，相关OEC增加。 这与突变体OB中ONL厚度、GAP-43阳性轴突和OEC的明显减少形成对比，表明一部分未成熟OSN轴突和OEM未能迁移到OB，而是在缺少GFRα1的情况下在OE中停滞。 体外 研究表明GDNF信号可以促进OEC迁移( 曹等人，2006 ; Treloar等人，2009年b ; 莫布里等人，2010年 )OEC的迁移刺激OSN生长锥活动和轴突延伸( Treloar等人，2009年a ; Windus等人，2011年 ). 因此，OECs中GFRα1的缺失可能影响了它们的运动，导致OECs和未成熟轴突在OE中积聚，并相应减少OB。 OEC的异常过量可能导致其中一些细胞的凋亡，并解释了在突变OE BL以下的细胞中观察到的caspase-3激活增加的原因。 鉴于GFRα1也在未成熟的OSN轴突中表达，GDNF信号也可能直接影响OSN轴轴突的生长，而不受其对OEC的影响。 OEC和OSN轴突之间的关系很复杂，尚未在 体内 设置。 选择性消除未成熟OSN轴突或OEC中的GFRα1，可以区分其对这些细胞类型的直接影响，并阐明OEC和OSN轴轴突之间的关系 体内 .
虽然成熟的OMP阳性OSN不表达GFRα1，但其数量减少 格拉1 敲除小鼠与产生它们的未成熟OSN池的减少一致。 突变体中剩余的一些成熟OSN表现出更强的凋亡和轴突变性迹象，表明GFRα1的缺失具有非细胞自主效应。 这可能是OB中OSN靶点丢失的结果，尤其是二尖瓣细胞，这在突变体中似乎受到严重影响（见下文）。
GDNF信号是维持ONL所必需的，因为缺乏GFRα1的突变体显示OSN轴突和OEC减少，caspase-3激活增加。 在包括OSN轴突在内的不同类别CNS神经元的轴突和树突中检测到几种半胱氨酸蛋白酶，包括半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3( Verhaagen等人，1990年 ; Cowan等人，2001年 ; Cowan和Roskams，2004年 ). 早期研究表明，caspase-3参与了从突触到细胞体的逆行促凋亡信号，参与了OSN的形成( Cowan等人，2001年 ; Cowan和Roskams，2004年 ). 因此，在缺乏GFRα1的小鼠ONL中检测到的caspase-3活性增加与在突变OE中观察到的OSN减少一致。 最近，caspase独立于细胞体凋亡的作用开始显现。最近的几项研究表明，caspase-6参与轴突变性( Nikolaev等人，2009年 ; Park等人，2010年 ). 尽管caspase-3在轴突变性中的需求仍有争议( Nikolaev等人，2009年 ; Schoenmann等人，2010年 )最近，caspase-3活性的局部上调与突触的功能和结构改变有关( Li等人，2010年 ; D'Amelio等人，2011年 ). 这些和其他数据表明，缺乏GFRα1的小鼠ONL中caspase-3活性升高也可能反映出突变体中未成熟OSN轴突的更替率较高。
在OB肾小球的两个主要组成部分，即OSN轴突和二尖瓣细胞树突中观察到的缺陷，可能解释了 Gfra1型 突变体。 研究表明，GFRα1通过一种称为配体诱导细胞粘附的过程，在海马和大脑皮层发育中的神经元中显示出突触活性( Ledda等人，2007年 ). 除了缺乏OSN轴突和二尖瓣细胞外，GDNF信号也可能是初级突触形成/稳定所必需的，而初级突触的形成/稳定就发生在未成熟OSN向成熟OSN过渡的过程中( Carson等人，2005年 ).
在缺乏GFRα1的OB中表达CB、CR和TH的不同类别的抑制性中间神经元之间也观察到明显缺陷。 由于OSN和投射神经元的缺陷，GFRα1的缺失可能会自主影响嗅觉中间神经元的非细胞发育( De Carlos等人，1995年 ; 龚和希普利，1995年 ; Bulfone等人，1998年 ; Treloar等人，2009年a ). 另外，GFRα1可能对OB中间神经元前体的发育也很重要。 这些细胞在胚胎前脑的外侧神经节隆起、脑室下区和隔膜中生成，并通过侧脑室和一种称为RMS的细胞迁移途径向头侧迁移至OB( 拉斯金，1993年 , 1998 ; Lois和Alvarez-Buylla，1994年 ; Wichterle等人，2001年 ). GFRα1在RMS细胞中与NCAM共定位( Paratcha等人，2003年 )GDNF被证明以NCAM依赖的方式对这些细胞起化学吸引因子的作用( Paratcha等人，2006年 ). 因此，GFRα1可以在OB中间神经元前体亚群中自主发挥细胞功能，在其最终分配到OB之前调节其分化、迁移或存活。
新生儿中观察到的几种表型 格拉1 敲除小鼠，包括OE变薄，OSN缺乏，GAP43增大 + 在缺乏GDNF的新生幼崽中，轴突束、ONL减少、不规则形状的肾小球和所有主要类别的GABA能中间神经元数量减少。 两个突变体表型之间的相似性表明GDNF可能是驱动GFRα1介导的嗅觉系统发育效应的主要配体。
小鼠的嗅觉系统在出生后的第七周左右经历了显著的发育( Treloar等人，2009年a ). G基因无突变的小鼠纯合子 fra1公司 因肾发育不全和肠神经系统缺陷导致出生时死亡( Cacalano等人，1998年 ; Enomoto等人，1998年 ). 虽然杂合子突变体在出生后存活，但GFRα1尚未显示出剂量依赖性效应 体内 杂合子中没有发育异常 格拉1 突变体。 因此，我们惊讶地发现这些动物存在如此显著的缺陷，突显出嗅觉系统对GFRα1剂量的敏锐敏感性，以及该受体在其发育过程中的关键作用。 值得注意的是，在新生儿纯合突变体和成人杂合突变体中，中间神经元的丢失比例相当，这表明OB中间神经元在出生后阶段严重依赖GFRα1。 这与RMS前体对该神经元亚群的持续补充一致( Hinds，1968a年 , b条 ; 拜耳，1983年 ). 成人嗅觉系统的明显神经解剖学缺陷 格拉1 +/− 突变体与埋藏食物试验和先天嗅觉敏感性试验中的嗅觉敏感性降低相关。 与此处观察到的气味相似的异常先天反应也被描述为OSN消融的结果( Kobayakawa等人，2007年 )OSN中缺少Robo-2( Cho等人，2011年 ). 考虑到GFRα1在整个嗅觉系统中的广泛作用，不能排除 Gfra1型 突变体，特别是那些由厌恶气味引发的突变体，除了灵敏度降低外，可能是OB电路紊乱的结果。
总之，本研究表明GFRα1对主要嗅觉系统中所有主要类别神经元和胶质细胞的发育至关重要。 这为将来研究该受体在构成嗅觉系统的单个神经元和胶质细胞类型中的不同功能奠定了基础。 需要解决的重要问题包括GFRα1调控嗅觉系统发育的细胞自主和非细胞自主机制，它在前体细胞与成熟细胞中的作用，它对突触连接的影响，以及GFRαl共受体对此处描述的功能的不同贡献。
脚注
这项工作得到了瑞典研究委员会、欧盟第七框架计划（“Molpark”网络）、林奈发育生物学中心、再生医学战略研究计划（C.F.I.）和国家卫生研究院（NIH）（L.B.）的资助。 C.M.得到了KI/NIH联合博士项目和Molpark网络的支持。感谢Berit Engst、Annika Andersson、Linda Thors和Sabrina Zechel的帮助。
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