伴侣级联筛选翻译后膜插入内质网的蛋白质

Sgt2是一种使Get4和Get5与TA蛋白质接近的支架蛋白

先前的研究表明，Get4和Get5相互结合并与其他几种蛋白质结合(Ito等人，2001年;Krogan等人，2006年;Liou和Wang，2005年;Liou等人，2007年;Chang等人，2010年)。这增加了与Get4/5紧密结合的一个或多个蛋白质与Sec22实现coIP的可能性。我们现在将进行系统的生物化学分析，确定Get4-Sec22和Get5-Sec22的形成依赖于Sgt2（富含谷氨酰胺的小四肽重复控制蛋白2），Sgt2是一种具有以下拓扑结构的支架蛋白：一个结合Get4和Get5的N末端结构域，一个中心四肽重复序列（TPR）结合热休克蛋白（Hsps）的结构域和结合TA蛋白的C末端结构域。

亲和纯化和质谱分析表明，Get4和Get5以及Hsp104、Hsp70s、Sgt2和Ybr137w以复合物形式存在(图S2A)。我们在我们的制剂中检测到相对较少的Get3衍生肽，这表明Get3不是这种复合物的组成部分。为了排除质谱法检测Get3因技术原因而变得模糊的可能性，我们在Δ获得3遗传背景，但我们观察到复合物的分子组成没有明显变化(图2A)。该方法的几个扩展使我们能够定义复合体的子单元组织。首先，在没有中士2的情况下，Get5只与Get4绑定(图2A)。其次，在没有Get5的情况下，Get4没有绑定到任何其他复杂组件(图2A)。第三，在缺乏Get4的情况下，Get5与中士2的明显联系减弱了（因此Hsps和Ybr137w；见下文）(图2A和S2B型)由于这些条件下的部分Get5蛋白水解(图S2B和S2C)。第四，Sgt2的TPR结构域中的两个点突变（R171A和R175A）消除了Hsp和Ybr137w与复合物其余部分的结合(图S2D和S3A)基于结构同源性建模(Chivian和Baker，2006年) (图S2E)，我们预计会破坏与Hsps酸性C末端尾部的临界静电相互作用(Scheufler等人，2000年) (图S3B)。最后，在没有Ybr137w的情况下，Get5仍然绑定到所有其他复杂组件(图2A)。总之，Get4和Get5是多蛋白复合物的一部分，其中Get5介导Get4和Sgt2之间的结合，而Sgt2的TPR结构域介导Hsp104、Hsp70s和Ybr137w与其余复合物的结合(图2B).

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图2

Sgt2是一种结合Get4/5、热休克蛋白和TA蛋白的支架蛋白

（A） 用抗FLAG树脂免疫沉淀（IP）所示FLAG标记菌株的细胞质裂解物。洗涤后，用3×FLAG肽洗脱树脂。洗脱的蛋白质通过SDS-PAGE进行解析，并通过考马斯蓝染色进行可视化。通过质谱分析确定蛋白质身份(图S2A)。请注意，来自Δ获得4由于部分蛋白水解，很难看到制剂(图S2B).

（B） 显示亲和纯化的Get4/5FLAG细胞溶质复合物的亚单位组织的示意图。Ybr137w的C末端尾部存在多个酸性残基，这表明它与Hsp104和Hsp70一样，直接与Sgt2的TPR结构域相互作用。该示意图并不打算指定复合体中每个组件的副本号。

（C和D）在所示提取物中的Sec22或Sec22ΔTMD的体外翻译（IVT）后，进行抗FLAG免疫沉淀（IP）和3×FLAG肽洗脱。制备样品，并通过放射自显影和免疫印迹（IB）进行分析，如图1.

（E） 用抗FLAG树脂免疫沉淀（IP）所示FLAG标记菌株的细胞质裂解物。洗涤后，用3×FLAG肽洗脱树脂。通过SDS-PAGE解析洗脱的蛋白质，并通过考马斯蓝染色进行可视化。通过质谱分析确定蛋白质身份。*表示衍生自Sgt2的蛋白质片段的位置。

接下来，我们问Sec22是否可以与Get4和Get5结合，当它们不再与复合物的其余部分结合时，但我们在D中没有观察到可检测到的Get5-Sec22形成sgt2型提取物(图2C)。由于大多数细胞Get4/5与中士2处于复合物中(图S3C)，我们假设生成Get5-Sec22需要Sgt2，因为Sec22实际上与原始Get4和Get5免疫沉淀物中复合物的其他成分之一结合（参见图1C)。为了测试这一点，我们首先确定我们可以以TMD依赖的方式检测第2军士第22节的形成(图2D)。重要的是，中士2-Sec22坚持Δ获得3，Δ获得5、和Δ获得3/5提取物(图2D)。为了确定Sgt2与Hsps和Ybr137w结合是否是Sec22 coIP与Sgt2所必需的，我们监测了Sgt2-Sec22在SGT2型_{R171A、R175A}标记Δ获取5摘录。令人惊讶的是，即使军士2在这些条件下不再绑定到Get4、Get5、Hsps和Ybr137w(图2E)，第2军士长第22节仍然有效(图2D).

如果生成Sgt2-Sec22不需要Hsps，那么Sgt2如何识别Sec22的疏水TMD？远距离Sgt2同源物的序列比对表明，中心TPR结构域两侧是较不保守的N端和C端结构域(Dutta和Tan，2008年)。有趣的是，我们注意到Sgt2同源物的C末端结构域富含蛋氨酸残基(图3A)，这是一个与SRP域共享的特征，可识别疏水性信号序列(Keenan等人，1998年;Clérico等人，2009年;Janda等人，2010年)。因此，我们通过监测表达Sgt2截短片段的提取物中Sgt2-Sec22的形成，询问Sgt2的C末端结构域是否是Sec22结合所必需的(图S3D)。我们观察到，C末端结构域（Sgt2ΔC）的缺失消除了Sec22结合，而前58个氨基酸（Sgt1ΔN）的缺失虽然对Get4/5结合至关重要（见下一节），但并不需要Sgt2-Sec22的形成(图3B)。最后，为了确定在没有任何其他酵母蛋白的情况下，是否可以对Sec22进行Sgt2识别，我们在细菌Sgt2中与SumoTMD共表达。这种融合策略通常用于增强细菌中过度表达的蛋白质的溶解度(Butt等人，2005年)并且不干扰TMD插入微粒体(图S3E)。与我们的酵母coIP研究完全一致，Sgt2和Sgt2ΔN与细菌中的SumoTMD形成复合物，而Sgt2ΔC没有(图3C).

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图3

Sgt2富含蛋氨酸的C末端结构域与TA蛋白的疏水跨膜结构域结合

（A） Sgt2的三个蛋白质结构域的示意图。括号内的区域表示所示第2级截短的跨度。下面显示的是Sgt2同源物的C末端结构域的Clustal W2氨基酸序列比对酿酒酵母({“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“NP_014649.1”，“term_id”：“6324580”}}NP_014649.1号),智人({“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“NP_003012.1”，“term_id”：“4506921”}}NP_003012.1号),秀丽隐杆线虫({“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“NP_494893.1”，“term_id”：“17535447”}}NP_494893.1号)、和黑腹果蝇({“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“NP_609842.1”，“term_id”：“24584835”}}NP_609842.1号)。ESScript 2.0用于突出显示相同（白色，用红色框住）、保守（红色，用白色框住）和蛋氨酸残留（蓝色阴影）。请注意酿酒酵母Sgt2（残基208到346）为7.2%，而其他三个Sgt2 C末端结构域的平均值为7.7%。SRP同源物M结构域中蛋氨酸的平均百分比（参见Keenan等人，1998年)为2.3%。

（B） Sec22在指示提取物中的体外翻译（IVT），然后进行抗FLAG免疫沉淀（IP）和3×FLAG肽洗脱。10%的IP输入（T）和20%的3×FLAG肽洗脱（E）通过SDS-PAGE进行解析，并通过放射自显影和免疫印迹（IB）进行分析。

（C） 所示的细胞溶胶裂解物（T）大肠杆菌菌株用Ni-NTA树脂免疫沉淀（IP）。清洗后，用咪唑（E）洗脱树脂。洗脱的蛋白质通过SDS-PAGE进行解析，并通过免疫印迹（IB）进行可视化，如图所示。

为了测试Sgt2是否能够区分ER和线粒体TMD靶向决定簇，我们利用了以下观察结果：在线粒体TA蛋白Fis1的TMD的特定位置替换四个亮氨酸（4L），导致其在体内将Fis1错误定位到ER(Beilharz等人，2003年)。与此一致，（4L）Fis1以Get1/2依赖方式插入微粒体的效率是Fis1的十倍(图4A)从而使其插入效率与第22节相当。Fis1膜靶向性的这种变化反映在Fis1-coIP与Sgt2的效率增加了10倍，从而使其与Sgt2-Sec22形成的效率相当(图4B)。不出所料，中士2-（4L）Fis1坚持SGT2FLAGΔ获取5和SGT2_{R171A、R175A}旗帜Δ获取5种提取物(图4C)，认为Sgt2正在识别（4L）Fis1 TMD。出乎意料的是，TPR突变完全阻断了Sgt2-Fis1的形成(图4D)这表明Fis1 TMD通过与Hsps结合间接与Sgt2相关。重要的是，在这些条件下，Sgt2-F11的形成仍然依赖于TMD(图4D)。总之，我们的发现确立了Sgt2富含蛋氨酸的C末端结构域选择性地识别与ER结合的TA蛋白子集的疏水性靶向决定簇。

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图4

中士2选择性识别分泌途径中TA蛋白的靶向决定因素

（A） 在WT提取物中Fis1或（4L）Fis1的体外翻译（IVT）后，用WT或Δ获得1/2微粒体在室温下放置30分钟。使用带有N-聚糖受体位点的C-末端Opsin标签来监测插入（参见图1E)。样品通过SDS-PAGE进行解析，并通过放射自显影术进行分析（显示为典型分析）。显示了Fis1/（4L）Fis1和糖基化Fis1/。图示为插入的Fis1和（4L）Fis1百分比的平均值和标准偏差（三个独立实验）。以红色突出显示的还有（4L）Fis1跨膜结构域（TMD）序列中的四个亮氨酸取代。

（B） 所示TA蛋白在体外转化为可比的最终浓度SGT2FLAGΔ获取3/5提取（数据未显示）。在抗FLAG免疫沉淀和3×FLAG肽洗脱后，用SDS-PAGE解析总（T）和洗脱（E）样品，并用放射自显影法（显示为典型分析）和抗FLAG的免疫印迹法（数据未显示）进行分析。图中显示了每个TA蛋白与Sgt2共免疫沉淀（coIP）效率的平均值和标准偏差（三个独立实验）。

（C和D）在指示提取物中指示TA蛋白的体外翻译（IVT）后，进行抗FLAG免疫沉淀（IP）和3×FLAG肽洗脱。样品通过放射自显影和免疫印迹（IB）进行制备和分析，如图1.

用纯化组分重建从Sgt2到Get3的TA蛋白切换

为了确定Sgt2在TA蛋白生物发生中的确切作用，我们首先确定Dsgt2型提取物在Sec22插入微粒体方面存在缺陷，这是得到删除摘录(图S4A)。相反，Sec22在D组的插入不受影响ybr137w型(图S5B)和SGT2型_{R171A、R175A}摘录（未显示数据）。接下来，我们培养纯化自Δ获得3/5用微粒体提取，但未观察到Sec22插入(图5A)。在相同条件下，添加重组Get3仅导致微量插入Sec22(图5A)。引人注目的是，微粒体与Sgt2-Sec22孵育，预制重组Get4-Get5复合物(图S1C)和Get3导致有效的Get1/2依赖Sec22插入(图5A)。接下来，我们测试了Get3-Sec22的形成是否是通过从Sgt2到Get3的主动Sec22转移机制发生的。因此，我们将结合到抗FLAG树脂上的Sgt2FLAG-Sec22与Get3、Get4和Get5分别、成对或全部三种组合培养，并监测Sec22洗脱。值得注意的是，我们观察到在Get3、Get4和Get5的联合存在下，Sec22从Sgt2中几乎定量洗脱(图5B)。所有其他含有Get3的孵育仅导致边缘Sec22洗脱(图5B)这与使用Sgt2-Sec22和Get3培养的微粒体中Sec22插入的低水平（但高于背景水平）一致。含有Get4和/或不含Get3的Get5的剩余洗脱物与背景无法区分(图5B)。另外三行证据强烈证明，用Get3/4/5洗脱的Sec22与Get3是膜靶向复合物。首先，洗脱后用Get3定量免疫沉淀Sec22(图S4C)然后可以以Get1/2依赖的方式有效地插入微粒体(图S4D)。其次，Sec22洗脱被Get3预测的TMD结合位点中的三点突变（Get3LFI:L187E、F190E和I212E）废除(Mateja等人，2009年;Bozkurt等人，2009年;山形等，2010年) (图5C)。第三，（4L）Fis1的洗脱效率与Sec22中观察到的效率相当，而Fis1在相同条件下洗脱不明显(图5D)。最后，我们询问在这些条件下，生成Get3-Sec22是否需要Sgt2-associated Hsps和Ybr137w，但从Sgt2中观察到Sec22洗脱没有明显减少_{R171A、R175A}(图S4E)。这些数据清楚地表明，我们的体外重建系统是一个很好的工具，可用于剖析Get4/5促进的TA蛋白从Sgt2转移到Get3的机制。

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图5

从Sgt2到Get3的TA蛋白交接物的体外重组

（A） Sec22的体外翻译（IVT）SGT2FLAGΔ获取3/5提取液，然后进行抗FLAG免疫沉淀（IP）和3×FLAG肽洗脱。分离洗脱液，并在室温下用Get蛋白（Get3为35 ng/μl，Get4-Get5为70 ng/μl）或模拟处理培养20 min。然后在室温下用GET1/2号机组或Δ获得1/2微粒体，如图所示。为了尽量减少细胞溶质Sgt2、Get3和Get5对微粒体的潜在污染，GET1/2号机组微粒体是由Δsgt2&；增量获得3/5应变。显示Sec22和糖基化Sec22（gSec22）的位置（参见图1E).

（B） Sec22的体外翻译（IVT）SGT2FLAGΔ获取3/5提取后进行抗FLAG免疫沉淀（IP），并在室温或模拟处理下用指示的Get蛋白洗脱20分钟（均为64 ng/μl），如随附示意图所示。离心后，收集洗脱液，清洗树脂，然后再次洗脱，但这一次使用凝胶负载缓冲液（洗脱后的树脂）。洗脱物通过SDS-PAGE进行解析，并通过放射自显影进行分析。这些数据分别在左侧和右侧框中，表示它们来自不同日期进行的实验。

（C和D）所示TA蛋白的体外翻译（IVT）SGT2FLAGΔ值3/5提取液随后进行抗FLAG免疫沉淀（IP），并在室温下用指示的Get蛋白洗脱20分钟。如（B）中所述，制备样品并通过放射自显影法进行分析。

重组蛋白的表达与纯化

除非另有说明，否则通过IPTG诱导BL21 DE3中基于pET的细菌表达大肠杆菌单元格，详见补充实验程序以及随后的净化步骤的描述。

酿酒酵母菌株的构建

本研究中使用的所有酵母菌株的结构和基因型在补充实验程序和在中列出表S1其中。

大型本机FLAG IP

酵母细胞生长到晚期（OD₆₀₀~1.6）被溶解，通过球磨冷冻（Retch PM 100），并按照前面所述进行抗FLAG亲和纯化(Jonikas等人，2009年).

获取3 FLAG下拉

重组Get3FLAGHis（6.5μg）与35μl抗FLAG-M2亲和凝胶浆料（Sigma）在结合缓冲液（50 mM HEPES-KOH[pH 6.8]，10 mM Mg[OAc]）中预先平衡培养₂，150 mM NaCl，2 mM DTT，10%甘油，3 mM ATP）搅拌30分钟。然后用200μl冰镇结合缓冲液将树脂清洗三次，然后用4倍摩尔过量的输入蛋白质培养，如图所示图6B（最终体积为75μl的结合缓冲液），在4°C下保持30分钟。在三次结合缓冲液洗涤后，用1 mg/ml 3×FLAG肽（Sigma）洗脱结合蛋白，通过SDS-PAGE进行解析，并使用带有ImageQuant TL（GE）软件的Typhoon成像系统通过SYPRO Ruby（Invitrogen）染色进行可视化。

免疫印迹法

在半干转移（Bio-Rad；Hercules，CA）到硝化纤维素膜上并阻断（LI-COR；Lincoln，NE）后，免疫印迹与一级抗体在TBST（50 mM Tris-HCl[pH7.4]，150 mM NaCl，0.1%吐温20）中与5%牛奶孵育，如下：抗FLAG小鼠M2单克隆抗体（Sigma），1:2000稀释；抗希氏鼠单克隆抗体（QIAGEN），1:500；抗Opsin鼠单克隆抗体（Sigma），1:1000；兔抗己糖激酶（美国生物制品公司；马萨诸塞州Swampscott），1:2000。在TBST中洗涤后，免疫印迹进一步与荧光标记的二级抗体在TBST和5%牛奶中孵育，如下所示：Cy5山羊抗鼠IgG（Invitrogen），1:10000；Alexa Fluor山羊抗兔IgG（Invitrogen），1:10000。在广泛的TBST清洗和PBS清洗后，使用ImageQuant TL（GE）软件在台风成像系统上进行了西部探测。

体外转录、翻译和微粒体插入

如前所述，使用mMESSAGE mMACHINE T7试剂盒（Ambion；德克萨斯州奥斯汀）从适当的PCR产物中体外转录封端的mRNA(Schuldiner等人，2008年).

如上所述制备酵母体外翻译（IVT）提取物和具有易位能力的ER衍生膜（微粒体）(Schuldiner等人，2008年)。一个显著的例外是，低速旋转后，IVT的裂解物在Sw55 Ti转子中以49000 rpm离心30分钟。

如前所述进行IVT和插入(Schuldiner等人，2008年)。使用带有ImageQuant TL软件（GE）的台风成像系统，通过荧光成像仪分析确定插入效率。

我们感谢W.Lane和哈佛微测序设施的质谱分析；M.Tung用于产生Get3 TMD结合突变体；Z.Newby为重组Get4和Get5表达提供实验帮助；E.O'Shea允许我们广泛使用她的设备；M.Rust、J.Markson、A.Rizvi、N.Bradshaw、A.Whynot、B.Burton、A.Drummond、L.Colwell和K.Foster进行了有益的讨论；B.斯特恩（B.Stern）、E.奥谢（E.O'Shea）和丹尼实验室（Denic lab）成员，负责批判性阅读手稿；和B.富山在图形方面的慷慨帮助。V.D.感谢J.Weissman和A.Murray的鼓励和激励性讨论。哈佛大学支持这项工作。