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癫痫。作者手稿；PMC 2013年5月12日提供。
以最终编辑形式发布为：
癫痫。2012年11月；53(11): 1887–1897.
2012年9月17日在线发布。 数字对象标识：10.1111/j.1528-1167.2012.0366.x
预防性维修识别码：项目经理3651831
美国国立卫生研究院：美国国立卫生研究院452842
PMID：22984896

在没有伴随病理的情况下，大鼠脑暴露于血清白蛋白在体内诱导的长期促黄疸作用

费德里卡·弗里吉里奥,* 安吉莉莎·弗雷斯卡,* 伊泰·魏斯伯格,† 萨拉·帕雷拉,* 阿隆·弗里德曼,† 安娜玛丽亚·维萨尼,*和弗朗切斯科·M·诺埃*
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关联数据

补充资料

总结

目的

血脑屏障功能障碍（BBB）是癫痫发作或致痫性脑损伤后常见的现象，实验诱导的BBB开放可促进幼稚动物和癫痫动物的癫痫发作。据报道，脑白蛋白外渗可通过诱导星形胶质细胞功能障碍来促进过度兴奋。为了提供体内证据，证明渗出的血清白蛋白在癫痫发作中的直接作用独立于病理背景，我们做了以下工作：（1）量化癫痫持续状态（SE）期间大鼠脑实质渗出的血浆白蛋白量；（2） 通过侧脑室注射白蛋白在幼年大鼠海马中产生类似浓度；（3） 测量这些大鼠的脑电图（EEG）活性、对红藻氨酸（KA）诱导的癫痫的敏感性以及海马后放电阈值（ADT）。

方法

采用western blot分析法测定SE后2和24小时大鼠海马和其他前脑区域的脑白蛋白浓度。分别用免疫组织化学和免疫荧光法研究血清白蛋白或异硫氰酸荧光素（FITC）-白蛋白在脑内的分布。给幼稚大鼠静脉注射大鼠白蛋白或FITC-白蛋白，以模拟SE后达到的大脑浓度，或使用右旋糖酐作为对照。免疫组织化学通过测量白细胞介素（IL）-1的神经胶质诱导来评估炎症β使用蛋白质印迹分析来测量海马中向内整流的钾通道亚基Kir4.1蛋白水平。海马内注射80 ng KA诱导大鼠癫痫发作，并在大鼠白蛋白或右旋糖酐给药后2或24小时通过脑电图分析进行量化。白蛋白注射3个月后，通过电刺激海马测定ADT。在这些大鼠中，连续监测脑电图2周，以寻找自发发作。

主要发现

SE后24小时海马血清白蛋白浓度为0.76±0.21μ米在其他前脑区域也检测到类似的浓度，而在小脑中没有发现变化。通过静脉注射500，幼年大鼠的海马白蛋白浓度也得到了类似的复制μ克/4μl大鼠白蛋白：白蛋白主要在注射后2 h的细胞外检测到，而在24 h时，在锥体神经元和少数分散的硫酸软骨素蛋白多糖（NG2）阳性细胞中可见，但在胶质纤维酸性蛋白（GFAP）阳性星形胶质细胞或CR-3补体受体（OX-42）中不可见-阳性小胶质细胞。幼年大鼠海马中白蛋白的存在与诱导的IL-1有关βGFAP阳性星形胶质细胞和伴随的组织Kir4.1下调。持续2小时的海马中的白蛋白可诱发峰值活动。当在白蛋白注射后2小时或24小时将KA置于海马内时，3小时EEG记录中的总发作间期峰值数量平均显著增加两倍。注射白蛋白三个月后，脑组织中未检测到白蛋白和炎症；此时，ADT降低了50%，但未观察到自发发作。

重要性

海马短暂暴露于白蛋白水平，与BBB显著击穿后的白蛋白水平相似，导致癫痫易感性增加，癫痫阈值长期降低，但不会诱发自发癫痫。这些效应可能由白蛋白诱导的星形胶质细胞功能障碍和相关的促炎分子诱导介导。

关键词：出院后，星形胶质细胞，血脑屏障，炎症，神经变性，癫痫

血脑屏障（BBB）通过调节血液循环分子和免疫细胞进入神经组织，为大脑提供至关重要的保护(Abbott等人，2010年). 各种中枢神经系统（CNS）损伤会导致BBB的生理和结构特性发生暂时性变化（参见兹洛科维奇，2008;Shlosberg等人，2010年;Nag等人，2011年). 尤其是，与炎症状态相关的血脑屏障完整性受损是脑损伤的常见特征，可导致癫痫的发展，也是抗药性癫痫组织的特征(Proescholdt等人，1999年;雅培，2000;Bartfai等人，2007年;Vezzani&Friedman，2012年). 实验证据表明，BBB分解和伴随的脑炎症在决定神经网络超兴奋性方面起着重要作用，最终导致癫痫发作(Friedman等人，2009年;Vezzani&Friedman，2012年;Vezzani等人，2012年). 参与这些作用的一个关键机制与血清白蛋白外渗到脑神经膜以及由此引起的内向整流钾的下调有关+通过激活转化生长因子β（TGF）在星形胶质细胞中的电流-β)受体（RII）信号。这种现象导致星形胶质细胞无法缓冲细胞外钾+(Ivens等人，2007年;Cacheaux等人，2009年;David等人，2009年). 因为癫痫中的BBB损伤与许多其他病理过程有关(Pitkanen&Lukasiuk，2011年)很难分离出溢出白蛋白本身在癫痫发生中的作用。为了解决这个问题，有必要从疾病背景出发，研究与病理相关的白蛋白浓度对大脑兴奋性的影响。以前的工作主要关注模拟白蛋白大量外渗所产生的影响，因为它可能发生在创伤性脑损伤后(Shlosberg等人，2010年). 在这方面，幼年大鼠皮层长期暴露于接近血清水平的白蛋白浓度，最终导致癫痫样活动的诱导(Ivens等人，2007年). 在我们的研究中，我们通过模拟癫痫持续状态（SE）后脑组织中的白蛋白浓度来评估白蛋白对大鼠大脑兴奋性的影响，癫痫持续状态是一种引起BBB显著分解的实验条件(van Vliet等人，2007年)并可能在动物和人类中演变为慢性癫痫(Pitkanen&Sutula，2002年). 我们的数据表明，在大鼠脑室内单次注射白蛋白后，白蛋白主要扩散到海马并转运到主要神经元。在这一脑区，在相关病理浓度下，白蛋白的实质外渗引起以下结果：（1）胶质纤维酸性蛋白（GFAP）阳性星形胶质细胞中Kir4.1通道的下调和脑炎症；（2） 短暂的神经元超兴奋表现为自发的癫痫样放电，并增强红藻氨酸（KA）诱导的癫痫样活动；（3）长期降低癫痫发作阈值，而不会引起细胞丢失或自发癫痫活动。

方法

实验动物

成年雄性Sprague-Dawley大鼠（225-250 g；Charles-River，Calco，Italy）被安置在恒温（23°C）和相对湿度（60±5%）下，可以自由获取食物和水，并有固定的12小时光/暗循环。涉及动物及其护理的程序按照符合国家（D.L.n.116，G.U.，Suppl.401992年2月18日）和国际法律和政策（EEC理事会指令86/609，OJ L 3581987年12月12日；美国实验动物护理和使用指南）的机构指南进行。国家研究委员会，1996年）。

实验组

在本研究中，我们使用了130只分为不同实验组的大鼠，如下所述。

为了评估SE诱导后大鼠脑内内源性血清白蛋白外渗的浓度和分布，我们用15只注射匹罗卡品后发生SE的大鼠和11只车用注射大鼠作为对照。为了通过Western blot评估注射的大鼠白蛋白的脑浓度和Kir4.1蛋白的水平，我们使用了20只注射白蛋白的大鼠和12只注射右旋糖酐的对照组。为了评估异硫氰酸荧光素（FITC）-白蛋白组织分布，我们使用了10只FITC-白蛋白注射大鼠。为了观察胶质细胞，检测白细胞介素（IL）-1β，并通过免疫组织化学方法测量神经元细胞密度，我们使用了8只注射白蛋白的大鼠和6只注射右旋糖酐的对照组。通过脑电图（EEG）记录研究白蛋白对大鼠脑兴奋性的影响，给大鼠注射大鼠白蛋白（n=16）或右旋糖酐（n=18）；然后2小时（每组n=8）或24小时（每组n=8）后，相同的大鼠接受海马内KA。另一组大鼠注射大鼠白蛋白（n=9）或右旋糖酐（n=7）；3个月后检测大鼠放电后的电诱导阈值。

癫痫持续状态的诱导

在注射甲基东莨菪碱（0.5 mg/kg.i.p.；Sigma-Aldrich）30分钟后，用盐酸毛果芸香碱（360 mg/kg缓冲盐水，意大利米兰Sigma-Aldrich）腹腔注射大鼠，以抵消外周胆碱能副作用(Turski等人，1983年). 两名研究人员对大鼠的行为发作进行了监测。注射毛果芸香碱约40分钟后，约80%的注射大鼠出现SE，包括复发性全身性运动性癫痫；SE发作90分钟后，给大鼠注射苯巴比妥（20mg/kg缓冲盐水，腹腔注射；Sigma-Aldrich），以停止痉挛性SE并降低死亡率。只有发育为SE至少90分钟的大鼠才用于后续分析。SE暴露大鼠随机分为两组：一组用western blot定量大鼠前脑区内源性白蛋白浓度（n=7）；另一组在SE后2和24小时通过免疫染色分析内源性白蛋白脑分布（每组4只）。盐水注射大鼠作为对照组（n=4-7）。

白蛋白水平是在SE的前24小时内测量的，因为如前所述，最大BBB开放发生在该时间窗口内(van Vliet等人，2007年).

重组大鼠白蛋白注射液

用马麻素（1%戊巴比妥+4%水合氯醛；3.5 ml/kg，i.p.）对大鼠进行深度麻醉，并将其置于立体定向Kopf装置中（David Kopf Instruments，Tujunga，CA，U.S.a.）。对于侧脑室内（i.c.v.）注射，大鼠白蛋白（Sigma-Aldrich）、牛FITC-（Aldrichμ克/4μl英寸50米米磷酸盐缓冲盐水（PBS）通过一根30号针头从硬脑膜表面以下4.0 mm伸入左半球第三侧脑室（从脑室角开始，mm：AP−0.8；L+1.5Paxinos&Watson，1986年). 该白蛋白剂量是根据之前的蛋白质传递实验计算的，表明通过静脉注射该蛋白质，以大约200倍的高浓度（未显示），可以获得给定蛋白质的理想神经膜浓度。这考虑了大约100倍的注入量稀释（4μl） 在大鼠脑脊液（CSF）中。因此，我们注入了1.9 m米白蛋白（500μ克/4μl） 得到约1μ米脑组织中（该浓度是通过SE后24小时内内源性血清白蛋白渗入大脑而获得的，见结果）。注射后2或24小时处死大鼠，以测量脑白蛋白水平和分布。

不同组的大鼠接受了类似的治疗，但也预先植入了注射套管和EEG电极，以便在治疗后对大脑活动和癫痫敏感性进行后续分析（见下文）。

电极和套管植入

对大鼠白蛋白或右旋糖酐注射大鼠进行脑电图记录。简单地说，将两个双极特氟隆绝缘深度电极（Ø0.127 mm，背腹尖间距0.5 mm）双侧植入海马隔极（从前角，mm：前后[AP]−3.3；L±2.4；硬脑膜下−3.0，Paxinos&Watson，1986年). 两个螺旋电极（PlasticOne Inc.，Roanoke，VA，U.S.A.）分别位于鼻窦和小脑上方，用作接地电极和参考电极。在左侧深度电极旁植入一个22号导管，用于海马内输注红藻氨酸（见下文）。将一根额外的套管放置在硬脑膜上，与海马套管同侧，用于大鼠白蛋白或右旋糖酐的静脉注射。电极连接到一个多针插座上，并用丙烯酸牙胶固定在颅骨上。在开始记录之前，让大鼠从手术中恢复7天。

癫痫易感性

海康酸（KA，80 ng/0.5μl；Tocris Bioscience，Bristol，U.K.）在50 m深处溶解米PBS（pH 7.4），并使用从引导套管底部突出3.0mm的30号针头在间隔海马齿状回的自由移动大鼠中单侧注射。据先前报道，在100%无死亡的大鼠中，该剂量的KA是诱导离散重复性EEG发作和海马体中持续约2.5小时的尖峰活动的最低剂量(Vezzani等人，1999年). 在每只大鼠中，记录至少30分钟的基线脑电图活动，然后注射大鼠白蛋白或右旋糖酐（见上文），再连续记录120分钟的脑电图活动。然后将注射右旋糖酐或白蛋白的大鼠随机分为两组，在注射白蛋白或右旋糖聚糖后2或24小时注射KA。记录注射KA前60分钟和注射KA后180分钟的脑电图。KA后三天，处死所有大鼠进行神经元细胞丢失定量，如下所述。

后放电阈值

在静脉注射白蛋白或右旋糖酐3个月后，将上述EEG电极植入另一组大鼠的海马。从手术后1周开始，连续监测大鼠2周（24小时/天，7天/周），以寻找自发的癫痫样活动，如EEG峰值活动或坦率发作事件的出现所定义的(Noe等人，2008年;Ravizza等人，2008年). 在记录期结束时，测试大鼠的海马电诱导后放电阈值（ADT）。用恒流刺激（1毫秒单极方波，50赫兹，持续2秒）对大鼠进行电刺激，并在左侧隔海马记录EEG。ADT的测定采用逐步递增法(弗里曼和贾维斯，1981年). 初始电流强度设置为20μA；然后电流增加了10μ最大值为200μA以1分钟为间隔，直到引发一个持续时间至少为3秒的AD。暴露于200μ电流强度可预测电极错位。AD诱导后24小时，处死大鼠进行脑白蛋白、胶质细胞活化和神经元丢失的免疫组织化学分析（见下文）。

脑电图记录和分析

如前所述，在自家笼子内自由活动的大鼠中记录脑电图(Noe等人，2010年)使用连接Comet AS-40 32/8放大器的TWin脑电图记录系统（采样率400 Hz，高通滤波器0.3 Hz，低通滤波器70 Hz，灵敏度2000 mV/cm；Grass-Telefactor，West Warwick，R.I.，U.S.a.）。使用TWin记录和审查软件处理数字化脑电图数据。使用Clampfit 9.0程序（Axon Instruments，Union City，CA，U.S.A.），通过计算白蛋白注射后前2 h和KA给药后3 h内的峰值总数，评估白蛋白注射对基础和KA诱导的海马EEG活动的影响。尖峰波定义为振幅至少比基线高2.5倍且持续时间<20毫秒的尖峰波，或持续时间<200毫秒的尖波和波形。图标发作由高频和高压同步棘波活动和/或多棘波复合体的离散发作定义(图4B，E). 通过总结EEG记录期间每次发作事件的持续时间来量化发作活动。两名独立调查人员对脑电图进行了目测检查，并估计了发作期或棘波活动。

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大鼠白蛋白对基线和KA诱导的海马脑电活动的影响。静脉注射右旋糖酐（CTR，A–C)或大鼠白蛋白（500μ克/4μl）(D–F型)或者单独(一个和D类分别）或KA后24小时（80 ng，海马内）(B、 C类和E、 F类分别）。面板一个描述了注射右旋糖酐后的脑电图活动，与注射前基线无差异。面板D类描述了白蛋白注射同侧的高振幅、高频峰值活动（约8 Hz）。该活动在注射后15分钟内发生，平均持续60分钟，并在2小时内恢复到基线水平（参见图5). 面板B类和E类描述预先注射右旋糖酐的大鼠注射KA后记录的典型发作(B类)或白蛋白(E类). 面板C类和F类描述预先注射右旋糖酐的大鼠在KA后第三个小时内的峰值活动(C类)或白蛋白(F类). 括号中报告了跟踪放大。

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数据S1中的方法：Western blot、免疫组织化学组织制备、免疫组化程序和IL-1定量β阳性细胞和神经元细胞丢失，并对数据进行统计分析。

结果

癫痫持续状态时脑外渗血清白蛋白的定量研究

我们的第一个目标是测定SE期间脑内溢出的血清白蛋白浓度。因此，我们在毛果芸香碱诱导SE 24小时后，通过半定量western blot分析测定了大鼠脑内不同区域的血清白蛋白水平。海马结构中的白蛋白浓度为0.76±0.21μ米（n=7，图1A). 内嗅皮层的白蛋白浓度相似（0.79±0.13μ米)丘脑复合体（0.68±0.07μ米); 杏仁核中的水平也有所增加（0.48±0.12μ米)而小脑没有变化(表S1，另请参阅van Vliet等人，2007年).

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癫痫持续状态（SE）诱导后大鼠海马水平和血清白蛋白的组织分布(A–C)与大鼠白蛋白注射液在幼年大鼠体内的比较(D–F型). 面板一个描绘了大鼠SE诱导后24小时在海马中获得的大鼠血清白蛋白水平（每组n=7）。面板B类和C类是低倍和高倍CA3区域的代表性图片，描绘了大鼠血清白蛋白在脑实质中的分布。SE后2 h，白蛋白信号主要为细胞外信号(B类)而在24小时时，在CA3锥体神经元中观察到白蛋白染色(C类). 面板D类显示大鼠海马在静脉注射500后2小时和24小时的白蛋白浓度μ克/4μl大鼠白蛋白（每组4只大鼠）。面板E、 F类描绘海马FITC-白蛋白的分布（500μ克/4μl、 i.c.v.）表示注射后2 h其细胞外积聚，以及注射后24 h其在CA3锥体神经元中的神经元内信号。以条形图表示的数据为平均值±标准误差*p<0.05**与CTR相比，p<0.01（小组中的车辆注射大鼠一个或小组中注射右旋糖酐的大鼠D类)通过两个独立组的Mann-Whitney U检验(一个)或者通过Kruskal-Wallis的单向方差分析，然后进行Dunn的多重比较检验(D类). 比例尺100μm（低倍），25μm（高倍）。

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在SE后2或24小时处死的不同组大鼠，用免疫组织化学方法分析大鼠白蛋白在海马的分布；2h时，SE后内源性白蛋白主要在细胞外观察到(图1B); 然而，在24小时时，在锥体CA3神经元内检测到明显的白蛋白染色(图1C)以及散在的CA1神经元和颗粒细胞（未显示）。SE后24小时，在神经元中检测到白蛋白，在内嗅皮层、丘脑复合体和杏仁核中也检测到白蛋白（未显示）。

脑室注射后脑白蛋白的定量

为了模拟SE后大脑内源性白蛋白水平，我们静脉注射大鼠白蛋白，并在2小时和24小时后处死大鼠。我们发现白蛋白剂量为500μ克/4μl海马水平为1.06±0.16μ米（n=4）和1.08±0.10μ米（n=4）分别在注射后2小时和24小时(图1D)，与SE后达到的水平相似(图1A). 静脉注射后24小时，我们的测量值为0.46±0.07μ米（n=4，与右旋糖酐对照组相比p<0.05）内嗅皮层中的白蛋白，因此表明海马外区域的白蛋白水平增加，尽管该浓度显著低于SE后的水平（0.79±0.13）（p<0.05）μ米,表S1). 此外，我们注射了易于检测的FITC-白蛋白（500μ克/4μl） 研究其静脉注射后的组织分布。类似于SE过程中海马内的内源性白蛋白外渗，2小时时FITC白蛋白主要在细胞外(图1E)与24小时相比（CA3锥体神经元内部，图1F，共定域图像图S1C). 也可以观察到分散的蛋白阳性CA1和颗粒细胞（未显示）以及少量硫酸软骨素蛋白聚糖（NG2）阳性细胞(图S1F). 我们也没有在GFAP阳性的星形胶质细胞中检测到白蛋白(图S1G-I)或OX-42阳性小胶质细胞(图S1J–L).

海马区的白蛋白介导炎症

我们评估了GFAP阳性胶质细胞和IL-1β大鼠白蛋白注射后海马的染色(图2). 面板A、E和I示意性地描述了IL-1的时间依赖性分布β-与右旋糖酐注射大鼠（A）相比，大鼠白蛋白注射后2 h（E）或24 h（I）海马区的阳性细胞。尽管注射右旋糖酐的大鼠实际上缺乏IL-1β海马体染色(图2B、C)，IL-1β白蛋白后分子层免疫反应显著增强(图2F、J、K)GFAP阳性星形胶质细胞（H，L，合并图像为O）。GFAP染色显示白蛋白注射后星形胶质细胞活化的形态学特征(图2H，L)与右旋糖酐注射大鼠相比（D）。白介素-1β免疫阳性细胞在白蛋白注射后24小时（J，K）显著多于2小时（F，G），如典型海马区（框为红色方框，M）的细胞计数（N中的条形图）所示。我们没有检测到白蛋白后OX-42阳性小胶质细胞的形态学变化(图S2B、C)与右旋糖酐（A组）注射相比。此外，未诱导IL-1β在小胶质细胞（数据未显示）或NG2阳性细胞中观察到(图S3A–C)在白蛋白之后。

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星形胶质细胞活化与IL-1β幼年大鼠注射大鼠白蛋白后的诱导。面板A、 E、I（第一列）描绘了IL-1分布区域的示意图β白蛋白注射后海马固有区的阳性细胞(E、 我)与注射右旋糖酐的大鼠相比(一个). 面板B、 C类描述IL-1β右旋糖酐注射大鼠（CTR）海马内的染色显示实质性缺乏(C类)或者几乎检测不到(B类)信号。面板F、 J型描述IL-1的增加β海马分子层（sm）胶质细胞内2h(F类)和24小时(J)大鼠白蛋白注射后（500μ克/4μl、 注入坐标见方法部分）。辐射层（sr，K（K）)和灵芝（sl，未显示，见面板我)24小时，但不是2小时(G、 E类)在白蛋白之后。面板D类显示了右旋糖酐注射海马中静息状态GFAP天冬氨酸细胞的高倍照片。面板H（H）和L（左）分别描述注射后2小时和24小时活化的GFAP阳性星形胶质细胞的形态学特征。面板O（运行）描述了IL-1的共定位βGFAP在白蛋白注射大鼠海马层分子中。比例尺50μ米(B、 C、F、G、J、K), 25μ米(O（运行）), 10μ米(D、 高、低). 面板N个描述了IL-1的总数β在面板中红色方框所示区域注射白蛋白与右旋糖酐（CTR）后，计数阳性细胞（平均值±标准误差，每组n=4-6只大鼠）M（M）通过Kruskal-Wallis单因素方差分析和Dunn多重比较检验，与CTR相比，p＜0.05。Ipsi和contra分别指注射心室同侧或对侧的海马体。

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白蛋白注射液对Kir4.1蛋白水平的影响

因为体内和体外暴露于白蛋白的星形胶质细胞通过TGF的激活显示Kir4.1 mRNA显著减少-βRII信号(Perillan等人，2002年;Ivens等人，2007年;David等人，2009年)，我们评估了大鼠白蛋白注射后海马Kir4.1蛋白水平作为星形胶质细胞功能障碍的功能读数(图3). 我们发现，与对照动物（每组6只）相比，在2小时和24小时时，Kir4.1水平分别降低了28.5±12.7%和33.6±9.4%（p<0.05）。

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大鼠白蛋白注射后海马Kir4.1通道蛋白的Western blot分析。条形图显示了不同实验组中Kir4.1带的密度测定分析，即静脉注射后2或24小时（500μ克/4μl、 静脉注射大鼠白蛋白，或注射右旋糖酐（CTR）后，在注射后2小时和24小时检测到类似的条带；因此，这些值合并在一起）。在变性和还原缓冲条件下，我们测量了与42kDa带相对应的单体蛋白质(B类). 在低分子量下未检测到其他谱带，这反映了蛋白质降解不足（未显示）。数据（平均值±标准误差，n=6）是相关波段的光密度（O.D.）值除以相应的α-肌动蛋白值（内标）(B类). *与CTR相比，Kruskal-Wallis单因素方差分析和Dunn多重比较检验p<0.05。

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白蛋白注射液对脑兴奋性的影响

对静脉注射大鼠白蛋白的大鼠的脑电图分析显示，在注射后15分钟内出现了高振幅、高频尖峰活动（约8赫兹），平均持续60分钟，并在2小时内恢复到基线活动水平(图4D与A;图5A红线，n=16）。白蛋白给药后2 h出现峰值（峰值总数为9.351±1.059，图5C). 16只大鼠中有1只在注射白蛋白30分钟后出现发作。右旋糖酐治疗大鼠（CTR）的脑电图活动与注射前基线相似(图5A，蓝线）。白蛋白和右旋糖酐处理的大鼠随机分为两组；然后2或24小时后，将KA注射于海马内，以评估其癫痫敏感性。在2h组中，白蛋白+KA治疗组大鼠的癫痫活动开始时间和癫痫发作次数与右旋糖酐+KA注射组大鼠无差异（未显示；n=8）。然而，在KA后3小时的脑电图记录中，白蛋白+KA组与右旋糖酐+KA治疗组（CTR+KA）相比，发作间期棘波总数显著增加（白蛋白+KA,42.495±8.076；右旋糖苷+KA,22.894±4.475棘波，p<0.05，图5D). 在记录的最后15分钟内，这种影响是可逆的(图5B，红色虚线）。在24小时组中，八只接受KA治疗的大鼠中有三只出现了几次不间断的长时间癫痫发作，同时伴有放电活动(图S4)在生理盐水+KA中从未发生过(Vezzani等人，1999年;Noe等人，2010年)或右旋糖酐+KA大鼠。白蛋白注射后2h，KA诱导的峰次数显著增加（白蛋白+KA，57.116±9.689，n=8，p<0.05；图5D)与右旋糖酐注射大鼠相比（见上文）。与2 h组不同的是，在记录期结束时（即KA后180 min；图5B，红色实线），以连续的多峰和波浪为特征(图4F). 右旋糖酐治疗大鼠中KA诱导的癫痫活动与生理盐水+KA治疗大鼠没有差异（未显示）。

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大鼠白蛋白注射后海马兴奋性和癫痫易感性的变化。(一个和C类)分别显示大鼠海马脑电活动的时间依赖性变化及其在静脉注射（500μ克/4μl） 白蛋白（红色，n=16）或右旋糖酐（CTR，蓝色，n=18）。(B类和D类)显示KA在大鼠白蛋白预处理前2h（点红线，n=8）或24h（实心红线，n=8）诱发的痫样放电活动的时间依赖性变化。面板中的蓝线B类描述了KA（CTR+KA）前2 h（n=8）或24 h（n=8）用右旋糖酐预处理的大鼠中KA诱发的痫样棘波活动。因为这两组CTR+KA大鼠没有差异，所以将它们合并在一起（n=16，蓝线B类和蓝色条D类). 面板中的箭头一个表示白蛋白或右旋糖酐注射的时间；面板中的箭头B类表示KA注入时间；基线指注射白蛋白前15分钟的脑电图活动。面板一个：*p<0.05**p<0.01白蛋白（红线）与CTR（蓝线）。面板B类,D类：°p<0.05白蛋白（红色虚线或条纹条）与CTR（蓝色实线或条），#p<0.01白蛋白（红色实线或条形）与CTR（蓝色实线或条状）；§180分钟时p<0.05（红色实线vs.红色虚线）。白蛋白本身诱发的累积棘波数（C，红色条）显著低于CTR+KA前2小时测量的棘波数。（p<0.05，Mann-WhitneyU型测试）。面板中的数据A、 B类采用双向方差分析和Bonferroni检验进行分析。面板中的数据D类通过Kruskal-Wallis单向方差分析和Dunn多重比较检验进行分析。

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红藻氨酸和白蛋白注射后的神经变性

在尼塞尔染色的海马脑片中注射右旋糖酐+KA或白蛋白+KA治疗大鼠3天后，评估其神经退行性变的程度(图S5). 在注射右旋糖酐+KA的大鼠中，我们观察到典型的神经退行性变局限于注射海马CA3锥体神经元（未显示，参见Vezzani等人，1999年). 该区域神经元细胞密度分析(图S5A)与车用注射大鼠（Naive）相比，注射右旋糖酐后2小时或24小时注射KA的大鼠（CTR+KA，每组n=4；p<0.05）的神经元减少26.2±5.0%。白蛋白注射后2小时或24小时注射KA的大鼠的细胞密度分别降低了41.6±6.9%和60.7±4.0%（每组n=5；与Naive相比p<0.01）。与右旋糖酐注射大鼠相比，白蛋白注射24小时后注射KA的大鼠的神经细胞丢失更为显著（CTR+KA，p<0.01）。

根据FJ-A信号评估，白蛋白注射本身并没有引起任何可检测到的神经细胞丢失，在白蛋白治疗后的大鼠（未显示）中，FJ-A的信号是阴性的，并且在白蛋白注射后2或24小时进行定量尼塞尔染色分析(图S5B).

白蛋白注射对后放电阈值的影响

一组大鼠注射大鼠白蛋白（n=9）或右旋糖酐（n=7），通过测量海马电刺激的局部ADT来研究对海马兴奋性的长期影响。注射大鼠白蛋白或右旋糖酐三个月后，连续2周的脑电图海马记录中未检测到自发痫样活动。在这些记录结束时，对相同的大鼠进行了ATD测试。一只注射右旋糖酐的大鼠和两只注射白蛋白的大鼠在200分钟内没有出现ADμA；这些大鼠被排除在研究之外，因为术后组织学评估显示电极错位（要么太侧向，要么太深）。注射白蛋白的大鼠ADT显著降低（平均22.9μA、 范围，20–30μA、 中位数，20μA、 n=7）与右旋糖酐（平均值51.7μA、 范围，20–90μA、 中位数，45μA；p<0.05，n=6）(图6). 两个实验组的AD持续时间相似（白蛋白，44.7±7.7 s；右旋糖酐，30.4±3.9 s）。注射白蛋白三个月后，我们没有在海马区检测到白蛋白信号，也没有通过免疫组化检测到细胞丢失或胶质细胞激活的证据（数据未显示）。

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大鼠白蛋白致痫阈值长期降低。方框图显示了右旋糖酐（CTR，n=6）或白蛋白注射（500）后3个月大鼠的海马后放电阈值μ克/4μl、 i.c.v.，n=7），通过电刺激海马隔极进行评估*与Mann-Whitney的CTR相比p<0.05U型测试。

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讨论

我们研究的主要结论是，海马组织暂时暴露于与SE后达到的白蛋白浓度相似的白蛋白浓度，足以激发大鼠的神经元兴奋性增加和癫痫发作敏感性增强。以下结果支持这一结论。

（1） 一团白蛋白在海马体中触发了快速发作和短暂的峰值活动，在注射后15至60分钟内达到峰值。这种对神经元兴奋性和同步性的快速影响发生在白蛋白主要在神经膜的细胞外空间检测到时。白蛋白的低摩尔浓度和对白蛋白的特异性（以及分子量不相似的右旋糖酐）表明，蛋白质积累引起的渗透压变化不是兴奋性改变的主要决定因素。至少有两种伴随机制可能有助于白蛋白引起的神经元兴奋性的急性增加：白蛋白的净负电荷和/或其与细胞外钙/镁的结合，这可能改变膜表面电荷，星形细胞Kir4.1通道的下调损害了细胞外K的缓冲+(Ivens等人，2007年;Friedman&Dingledine，2011年). （2） 虽然白蛋白引起的自发峰值活动增加是暂时的，但大脑兴奋性的变化持续存在。因此，在低剂量KA惊厥后，大鼠表现出更倾向于发展成癫痫样活动。值得注意的是，与大脑暴露于白蛋白2小时后注射KA相比，大脑暴露于蛋白24小时后注射的KA导致更长时间的癫痫样活动。海马兴奋性的这种持续性时间依赖性增加可能取决于细胞外（2小时）白蛋白与细胞内（24小时）白蛋白激活的不同信号通路，或可能反映了由白蛋白本身和/或诱发的尖峰活动（例如新蛋白的转录和翻译，Cacheaux等人，2009年). 与以前的新皮质研究一致(Cacheaux等人，2009年)前炎症细胞因子IL-1的诱导表明，海马中白蛋白外渗导致局部炎症βGFAP阳性星形胶质细胞中。值得注意的是，在白蛋白注射后2至24小时内，这种现象显著增加。因为海马IL-1β具有促排卵作用(Vezzani等人，2011年a,b条)，这可能有助于白蛋白对神经元兴奋性影响的进展和持续。同样，白蛋白注射引发的星形细胞Kir4.1通道持续下调可能有助于神经元兴奋性的长期增加(Ivens等人，2007年;Friedman&Dingledine，2011年). （3） 注射白蛋白3个月后，大鼠的癫痫发作阈值显著降低。当时，我们没有在大脑中检测到白蛋白；这支持了短暂的组织接触白蛋白可能会引起大脑兴奋性的长期增加。这种长期影响的机制目前尚不清楚。

我们的研究解决了一些尚未解决的问题。第一个问题与长期癫痫活动后的脑白蛋白浓度有关，首次在这里测量。这些测量结果使我们能够重现海马区BBB损伤诱导的白蛋白脑浓度，并评估其潜在后果。此外，将健康脑组织暴露于白蛋白可以将这种血清蛋白的作用与长时间癫痫发作期间发生的伴随病理事件（例如，细胞、分子和功能可塑性，以及神经元损伤；Pitkanen&Lukasiuk，2011年). 类似的方法描述如下Ivens等人（2007）世卫组织将牛血清白蛋白灌注到大鼠新皮质（0.1-0.4m）上30分钟米)5天后检测自发癫痫样活动，并通过Stewart等人（2010年）世卫组织在大鼠新皮层中注射相似浓度的大鼠血清6天，导致癫痫样活动的产生。在我们的研究中，白蛋白诱导的坦率癫痫发作活性的缺乏可能与海马中达到的相对较低的浓度（比血清水平低400倍）或单次推注（代表在反复发作期间发生的短暂血脑屏障开放，van Vliet等人，2007年)与其他研究中长期接触相比。主要接触白蛋白的大脑区域，即海马体与新皮质，也可以决定观察到的效果。这些差异突出表明，BBB改变对组织兴奋性的影响可能由几个因素决定，包括BBB开放的程度和持续时间以及主要涉及的大脑区域。在这方面，应该注意的是，在SE期间，对幼年大鼠进行静脉注射白蛋白也会导致参与癫痫回路的海马外脑区的白蛋白水平增加，尽管内嗅皮层的白蛋白浓度低于SE后的水平。

这组数据还表明，引起BBB分解的病理事件可能是脑内白蛋白引起的功能后果的主要决定因素之一。例如，创伤性脑损伤后，可能会设想大量且长时间的大脑接触白蛋白(Shlosberg等人，2010年)而当BBB泄漏主要在最后一次发作后24小时内修复时，在反复发作期间可能会发生更温和和短暂的暴露(van Vliet等人，2007年).

根据人类和实验性癫痫组织的证据(van Vliet等人，2007年)，我们发现海马神经元摄取白蛋白。值得注意的是，体内研究表明，血清白蛋白在SE晚期普遍存在于海马主要神经元内(弗里德曼，2011年). 虽然在癫痫组织中，蛋白阳性神经元呈嗜银性，表明处于痛苦状态，但在我们的模型中未观察到细胞损伤的迹象。我们的数据表明白蛋白本身并不具有神经毒性，这表明癫痫组织中蛋白阳性神经元的细胞损伤特征(Rigau等人，2007年;van Vliet等人，2007年)可能与白蛋白本身无关，但由潜在的神经病理学决定。在用白蛋白预处理24小时（但不是2小时）的大鼠中，KA后发现CA3神经元细胞丢失增加，这可能是由于这些大鼠的癫痫样活动延长所致。

GFAP阳性细胞中缺乏白蛋白染色，这与之前在星形胶质细胞中观察到的阳性染色不同(Ivens等人，2007年). 这种差异可能是由于与我们的研究相比，先前研究中使用的白蛋白浓度较高，灌注时间较长。GFAP阳性星形胶质细胞的白蛋白染色在癫痫体内模型和人类癫痫组织中也有报道(van Vliet等人，2007年;Raabe等人，2012年)提示癫痫发作或相关神经病理学可能需要胶质细胞的预激活，才能使胶质细胞摄取这种大分子。

迄今为止，白蛋白激活的主要机制是TGF的激活-β新皮质星形胶质细胞的RII信号传导(Cacheaux等人，2009年). 该信号通路导致星形胶质细胞的转录改变，包括Kir4.1通道的下调和各种炎症基因的上调(Cacheaux等人，2009年). 与这些报道一致，我们发现海马白蛋白诱导GFAP阳性星形胶质细胞的激活以及伴随的IL-1合成β以及Kir4.1组织水平的降低。这些发现支持TGF-βRII信号传导也被海马中的白蛋白激活。我们不能排除IL-1的诱导βGFAP阳性的星形胶质细胞也由最初的癫痫样活动决定(Vezzani等人，2011年a,b条)由白蛋白诱导。

尽管这种受体介导信号的白蛋白激活方式尚不清楚，但我们的数据表明，不需要星形细胞摄取白蛋白，因为我们没有在这些细胞中检测到白蛋白。因此，Cacheaux等人（2009年）报告称TGF-βRII阻滞剂可阻止白蛋白诱导的星形胶质细胞转录变化，并显示白蛋白和TGF-βRII免疫沉淀。这些发现表明，白蛋白效应是由跨膜受体蛋白介导的，而不是严格依赖于其自身的细胞摄取。

总之，当血清白蛋白以病理相关浓度暂时存在于海马时，我们的研究结果支持血清白蛋白的直接促杀作用，与长期癫痫发作后的作用相似。事实上，白蛋白在海马体中诱导了快速的神经元同步化，并决定了长期的兴奋性增加和癫痫阈值降低。我们的模型中缺乏自发癫痫发作，这表明白蛋白以及相关的炎性分子的星形胶质细胞生成不足以触发海马癫痫发作，尽管它能够显著增加大脑的兴奋性。癫痫发作可能需要致痫组织中发生的其他病理事件的协同作用(Pitkanen&Lukasiuk，2011年)或更长时间暴露于高白蛋白浓度，或在其他脑区出现病理性白蛋白浓度。

因此，先前的证据表明，颈动脉内甘露醇可诱导大量广泛的血脑屏障开放(van Vliet等人，2010年)，激发神经元活动同步(Fieschi等人，1980年)猪的短暂性癫痫发作(Marchi等人，2007年)以及癫痫大鼠自发癫痫活动增加(van Vliet等人，2007年).

我们的证据强调BBB分解和脑炎症是旨在提高癫痫发作阈值的抗癫痫策略的潜在靶点(弗里德曼，2011年;Ravizza等人，2011年)以及黄疸和癫痫发生的假定生物标志物(Vezzani&Friedman，2012年).

补充材料

数据S1。实验部分：材料和方法。

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致谢

这项工作得到了蒙兹诺基金会和尼彭特基金会（意大利伦巴第地区，机构协议编号14501A）（A.V.）的支持。作者感谢Christian Steinhauser对这些数据的有益讨论。

脚注

披露没有作者有任何利益冲突需要披露。所有作者都阅读了《华尔街日报》关于道德出版物所涉及问题的立场，并确认本报告符合这些准则。

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