扩张的GGGCC重复序列RNA与肌萎缩侧索硬化和额颞叶痴呆相关导致神经退行性变

摘要

肌萎缩侧索硬化症（ALS）和额颞叶痴呆症（FTD）是一种异质性疾病，具有许多临床、病理和遗传特征(1). ALS是一种致命的退行性疾病，主要影响运动神经元。主要特征是渐进性软弱；然而，认知障碍和行为改变，类似于FTD中所见的，是越来越被认识到的症状(2). FTD是一种进行性痴呆症，主要影响额叶、岛叶和前颞皮质的神经元，导致人格、行为和/或语言能力发生深刻变化。少数FTD患者也会发展为ALS(三). 病理学上，ALS和FTD最常见的特征是TAR DNA-结合蛋白（TDP-43）异常积聚(4,5).

遗传学上，将ALS或FTD分离的家族聚集在一起，通常作为常染色体显性性状，支持了每种疾病都有强大的遗传基础的观点。连锁分析和家族遗传研究发现，一些基因的突变，尤其是TAR DNA-结合蛋白(TARDBP公司)并在肉瘤中融合(保险丝)是ALS和FTD的罕见原因(6–9). 还发现许多家族将ALS、FTD或两者作为常染色体显性性状共同分离，并显示出与9p21基因座相关的证据(10).

最近，发现9p21基因座的连锁原因是基因外显子1a和1b之间的GGGGCC重复序列异常扩增C9或72(11–13). 引起疾病所必需的扩张GGGCC重复序列的确切大小尚不清楚。典型的检测方法，重复PCR，只是半定量的；然而，一个家系的Southern blot分析表明携带者有700–1600个重复(11). 引起疾病所需的实际大小可能要小得多，在健康对照组中，重复2次和8次似乎是最常见的大小(11). GGGGCC重复序列的扩增已被证明是ALS和FTD最常见的遗传原因，在欧洲和北美人群中，每种疾病的发病率为～5–7%(10)占家族性ALS的～40%和家族性FTD的20%。GGGGCC扩展具有年龄依赖性外显率，到80岁时几乎完全外显率(14). 生物化学方面，C9或72基本上没有特征，但似乎在正常对照组的大脑中广泛转录(11,12).

ALS和FTD的缓慢进行性和GGGCC扩张的非编码性与其他非编码核苷酸重复性疾病有着惊人的相似性，例如强直性肌营养不良、脆性X相关震颤/共济失调综合征（FXTAS）和脊髓小脑共济失调8、10和12。目前尚不清楚非编码重复序列是如何导致疾病的。一种可能性是，非编码重复序列通过破坏核和细胞质RNA加工发挥其毒性作用(15). 最近有报道称，非编码重复序列也可以被翻译成可能有毒的同聚蛋白(16). 需要进一步的工作来阐明这些过程对疾病发病机制的相对贡献。RNA-介导毒性的一种可能机制是通过转录扩增重复序列隔离正常RNA-结合蛋白（RBP），导致正常RNA代谢可用的RBP耗尽。这些RBP缺失的影响包括发育特异性转录物的丢失和坦率的剪接异常。

鉴于遗传证据表明一些RBP，即TARDBP公司和保险丝，可导致ALS或FTD，我们假设，通过隔离可与rGGGCC重复序列结合的特定RBP，通过改变RNA代谢，扩增的核糖GGGCc重复序列可导致神经退化。为了验证这个假设，我们开发了哺乳动物神经细胞和果蝇属可以表达3个（正常）或30个（扩展）rGGGCC重复序列的模型。重复次数由对照组的大小决定，最常见的是两次重复(11,17). 我们发现扩张的rGGGCC重复序列的表达足以引起神经退行性变。接下来，我们确定Purα是体外结合rGGGCC重复序列的主要RBP，并发现Purα和rGGGCCC重复序列在哺乳动物体内外以序列特异的方式相互作用果蝇模型。我们还发现Purα在哺乳动物神经细胞和果蝇属可以减轻rGGGCC介导的神经退行性变，这表明rGGGC重复结合蛋白可能通过与rGGCCC重复结合而从其正常功能中隔离。最后，我们发现Purα可以在表达扩大的rGGGCC重复序列的苍蝇眼睛和携带扩大的GGGGCC重复序列的人类小脑中形成内含物C9或72综上所述，这些发现表明扩大的rGGGCC重复序列足以引起神经退行性变，Purα可能在ALS/FTD的发病机制中发挥作用。

结果

扩张的rGGGCC重复序列的表达导致哺乳动物神经细胞的神经毒性果蝇。

为了确定扩增的rGGGCC重复序列是否会引起神经元毒性，我们首先克隆了正常的(n个=3）GGGGCC重复[（GGGCCC）_三]并进行了扩展(n个=30）GGGCCC重复[（GGGGCC）₃₀]转化为含有EFGP报告基因的哺乳动物表达载体(图1A类). GGGGCC重复序列插入转录起始位点和翻译起始位点之间的5′-UTR；在转录起始位点和GGGCC重复序列之间没有替代的ATG翻译起始位点。将这些构建物瞬时转染到Neuro-2a细胞中，并测定细胞活力。转染后48小时，转染构建物表达r（GGGCC）的细胞₃₀与单独转染EGFP或构建表达r（GGGGCC）的细胞相比，活性显著降低_三(P（P）< 0.0001;图1C类)，表明r（GGGGCC）₃₀足以导致神经细胞死亡。

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图1。

扩增rGGGCC重复序列的表达导致哺乳动物神经细胞和果蝇属. (A类)pCMV-（GGGGCC）示意图_n个-EGFP构造。将3个GGGGCC重复序列或30个GGGGCC重复序列插入EGFP编码区的上游，在所指示的转录和翻译起始位点之间。(B类)pUAST-（GGGCCC）示意图_n个-EGFP构造。在EGFP编码区上游指定的转录和翻译起始位点之间插入一个3 GGGCC重复序列或一个30 GGGCC-重复序列。(C类)转染pEGFP控制载体pCMV-（GGGGCC）的Neuro-2a细胞的细胞活性测定结果_三-EGFP或pCMV-（GGGGCC）₃₀-EGFP。CMV-（GGGGCC）转染细胞₃₀-EGFP显示生存率显著降低(P（P）<0.0001时，t吨试验）与转染pCMV-（GGGGCC）的细胞进行比较_三-EGFP或pEGFP控制。(D类)rGGGCC重复序列的表达扰乱果蝇属眼睛的光形态学(顶部)和扫描电子(底部)显微镜。所有苍蝇在羽化后2周出现。(左侧)仅表达EGFP的苍蝇。(居中)表达苍蝇（GGGCC）_三-EGFP。(赖特)表达苍蝇（GGGCC）₃₀-EGFP。

我们还检测了EGFP mRNA和蛋白的表达水平，发现在表达r（GGGCC）的细胞中EGFP（mRNA和蛋白质）的表达降低₃₀与那些表达r（GGGCC）的人相比_三或仅EGFP。这一发现表明，扩增的GGGGCC重复序列可能会干扰基因转录(图S1).

为了评估体内rGGGCC表达的效果，我们表达了r（GGGCC）_三或r（GGGCCC）₃₀在里面黑腹果蝇。为此，我们使用果蝇属转化载体pUAST-EGFP与正常人(n个=3）和扩展(n个=30）GGGCC重复序列类似于上述哺乳动物载体(图1B类). 通过上游激活序列（UAS）/GAL4系统实现了对转基因表达和组织特异性的控制(18). 仅使用pUAST-EGFP载体生产的转基因苍蝇作为对照。通过与不同GAL4驱动因子交叉线，将转基因表达定向到神经组织。单独表达不同水平EGFP的多个转基因系（GGGGCC）_三-EGFP或（GGGCC）₃₀-生成EGFP。在任何情况下，EGFP或（GGGCC）的表达都没有_三-EGFP表现出表型效应。相反，（GGGGCC）的表达₃₀-EGFP产生了有害后果。当使用Elav-GAL4靶向外周和中枢神经系统的所有发育细胞时，（GGGCC）的表达₃₀-EGFP在早期发育中造成致命性。此外，（GGGGCC）的表达₃₀-当使用Gmr-GAL4将表达导向视网膜时，EGFP严重破坏眼睛形态(图1D类). 这一发现被多个不同的（GGGCC）复制₃₀-EGFP转基因株表现出不同程度的细胞死亡、色素沉着丧失和小脑分裂，而没有任何EGFP-或（GGGCC）_三-表达EGFP的转基因株(图1D类). 综上所述，这些数据表明，扩增的rGGGCC重复序列可能在体内引起神经元毒性。

rGGGCC重复序列的表达导致眼和运动神经元进行性神经变性果蝇。

由于ALS和FTD都是年龄依赖性疾病，我们研究了rGGGCC重复序列在老年苍蝇眼中的表达效果。我们检测到表达r（GGGCC）的老年转基因果蝇眼睛形态的破坏增加₃₀使用Gmr-GAL4驱动程序重复(图2A类和B类)但表达EGFP或r（GGGCC）的果蝇的眼睛形态没有破坏_三重复使用Gmr-GAL4驱动程序，直到28天。

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图2。

rGGGCC重复序列的表达导致眼部和运动神经元的进行性神经变性果蝇属. (A类)表达（GGGCC）的苍蝇的光学显微镜₃₀-EGFP，I级眼球破裂定义为<25%小眼缺失(左边)，II级眼球破裂定义为25-50%小眼缺失伴小面积坏死(中心)，和III级眼破坏，定义为>50%的小眼缺失伴大面积坏死(正确的). 苍蝇眼睛的SEM图像如下所示。(B类)量化果蝇属第1天和第1、2、3和4周的眼部损伤。眼部缺陷分为三类：I、II和III(C类)第7天显示的使用OK371-GAL4驱动器在苍蝇运动神经元中表达rGGGGCC重复序列的效果(上部)和第28天(下部). 运动是相对于每个时间点在对照果蝇中观察到的运动给出的。每组测试30只苍蝇。在第7天没有观察到显著差异，但在第28天观察到明显的运动减少(P（P）= 0.0014,t吨试验）在表达rGGGCC的苍蝇中₃₀重复，但在表达rGGGCC的果蝇中没有_三重复。

鉴于ALS中受影响的主要神经元类型是运动神经元，我们使用UAS/GAL4系统，使用运动神经元特异性驱动器Ok371-GAL4来驱动运动神经元中转基因的表达。Ok371-GAL4单独与UAS-EGFP和UAS-（GGGCC）杂交_三-EGFP和UAS-（GGGCC）₃₀-我们以前使用的EGFP线。为了确定rGGGCC重复序列对运动神经元的影响，我们使用果蝇属活动监测（DAM）系统。在羽化后的第7天，我们发现rGGGCC没有差异_三-或rGGGCC₃₀-与对照组相比，表达苍蝇；然而，在羽化后28天，我们观察到(P（P）=0.0014）表达rGGGCC的果蝇的运动活动减少₃₀重复，但在那些表达rGGGCC的_三重复，与控件相比(图2C类).

rGGGCC重复RBP的识别。

我们认为，扩大GGGGCC重复介导的神经元毒性的一种机制是正常RBP的隔离。因此，我们期望一个或多个RBP绑定扩展的rGGGCC重复。为了验证这个想法，我们合成了生物素化r（GGGCC）₁₀重复RNA并将其与小鼠脊髓的全细胞裂解物孵育。用链亲和素包被的磁珠捕获结合r的蛋白质（GGGGCC）₁₀洗脱蛋白在4–20%梯度SDS/PAGE凝胶上分离。我们观察到两条特定的带随着脊髓裂解物数量的增加而增强，这表明一个或多个RBP结合rGGGCC重复序列(图3A类).

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图3。

rGGGCC RBP的识别。(A类)用小鼠脊髓裂解物进行GGGCC RNA-结合分析。生物素化r（GGGCC）₁₀将重复物与浓度增加的小鼠脊髓裂解物一起孵育。车道M指所有印迹中的分子量标记。通道1，仅600µg脊髓裂解物；通道2，300µM生物素与600µg脊髓裂解物孵育；车道3–8，300µM生物素化r（GGGCC）₁₀用30、60、150、300、450和600µg脊髓裂解物重复培养。(B类)rGGGCC重复RBP竞争试验与过量未标记r（GGGCC）₁₀重复。车道1，300µM生物素化r（GGGCC）₁₀仅重复；车道2，300µM生物素化r（GGGCC）₁₀重复和10×r（GGGCC）₁₀重复；车道3，300µM生物素化r（GGGCC）₁₀重复和100×r（GGGCC）₁₀重复。所有通道均用300µg脊髓裂解液培养。(C类)rGGGCC重复RBP竞争试验与过量未标记r（CGG）₁₀重复。车道1，300µM生物素化r（GGGCC）₁₀仅重复；车道2，300µM生物素化r（GGGCC）₁₀重复和10×r（CGG）₁₀重复；车道3，300µM生物素化r（GGGCC）₁₀重复和100×r（CGG）₁₀重复。所有通道均用300µg脊髓裂解液培养。(D类)MS识别RBP的工作流程示意图。

为了确定该蛋白对rGGGCC重复序列的特异性，我们使用未标记r（GGGCC）进行了竞争分析₁₀这削弱了我们捕获这些蛋白质的能力(图3B类). 未标记r（CGG）的加入与rGGGCC重复序列非常相似，并与FXTAS有关，部分减少了特异性RBP(图3C类)(19). 这一发现表明RBP对rGGGCC重复序列的亲和力高于rCGG重复序列；或者，与rGGGCC和rCGG重复序列的结合可能发生在不同的位点，或者可能涉及重叠但不同的蛋白质复合物。

为了鉴定与rGGGCC重复序列结合的特异性RBP，我们切除了特异性RBPs带，并用MS进行了分析(图3D类). 蛋白质序列最丰富的是Purα，其次是Purβ和Purγ(表S1和数据集S1). Purα、Purβ和用于结合反应的裂解物的PurγmRNA的定量RT-PCR（qRT-PCR）证实了Purα相对丰度的质谱定量(图S2). 因此，我们将注意力集中在Purα上。

Purα结合rGGGCC在体内外以剂量依赖性方式重复。

为了评估Purα与rGGGCC重复序列结合的特异性，我们表达了重组GST标记的小鼠和果蝇属Purα、GST标记的Purα和小鼠GST-hnRNP A2/B1。我们还包括了hnRNP A2/B1，因为它已被证明与rCGG重复序列结合并调节rCGG反复介导的神经退行性变，并且预计与rGGGCC结合(11,19,20). 我们使用各种重组蛋白和³²P标记r（GGGGCC）₁₀。我们发现老鼠和果蝇Purα可以以剂量依赖的方式与rGGGCC重复序列结合，但基本上与GST对照或hnRNP A2/B1没有结合(图4A类). 对于小鼠Purα，我们估计了解离常数K_d日，14.8 nM（95%置信区间，11.5–18.1 nM）和B_最大值每微克蛋白质1.44 fmol rGGGCC。对于果蝇属，我们估计了PurαK_d日为5.1 nM（95%置信区间，1.95–8.25 nM）和B_最大值每微克蛋白质4.67 fmol rGGGCC。这些发现表明，Purα和rGGGCC重复序列之间的相互作用在苍蝇和哺乳动物之间是特异的，并且相对保守。

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图4。

Purα在体内外以剂量依赖的方式结合rGGGCC重复序列。(A类)rGGGCC与小鼠和果蝇属Purα和小鼠hnRNP A2/B1。³²P标记r（GGGGCC）₁₀用浓度增加的重组Purα（小鼠）、Purα孵育(果蝇属)hnRNP A2/B1和GST。(B类)rGGGCC重复序列与Purα的体内相互作用。神经-2a细胞与FLAG标记的Purα和EGPF（GGGGCC）共转染_三-EGFP或（GGGCC）₃₀-构建EGFP，并用小鼠IgG或抗FLAG-M2抗体进行免疫沉淀。(上部)使用IgG对照和抗FLAG-M2抗体进行沉淀的蛋白质印迹。输入通道是一个仅表达FLAG-tagged Purα的Neuro-2a细胞。(下部)每个沉淀的EGFP RNA的qRT-PCR结果。(C类)Purα与来自小鼠或人脑裂解物的rGGGGCC结合。生物素化（GGGCCC）₁₀重复序列与脑裂解物孵育。通道1和通道5，30µg脑裂解物；通道2和通道6，300µg脑裂解物；通道3和7，300µg脑裂解物与300µM生物素孵育；通道4和8，300µg脑裂解物与300µM生物素化r（GGGCC）孵育₁₀重复。

为了确认体内Purα和rGGGCC重复序列之间的相互作用，我们使用小鼠Neuro-2a细胞进行了免疫沉淀实验。在这个实验中，我们共转染了哺乳动物EGFP，（GGGGCC）_三-EGFP和（GGGCC）₃₀-EGFP与表达FLAG标记小鼠Purα的哺乳动物表达载体一起构建到Neuro-2a细胞中。用抗FLAG-M2抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀。免疫预处理蛋白和RNA分别用抗FLAG-M2抗体的Western blot分析和EGFP特异性引物的qRT-PCR测定(图4B类). 通过相似数量的Purα免疫沉淀，我们发现含有扩增rGGGCC重复序列的EGFP mRNA显著富集，但不单独富集EGFP或（GGGCc）_三-EGFP。这些数据表明，Purα确实与体内rGGGCC重复表达mRNA相关。

为了检测人类中Purα和rGGGCC重复序列之间的相互作用是否保守，我们使用生物素化rGGGCC重复序列寡核苷酸进行了RBP下拉实验。在这个实验中，我们培养了生物素化r（GGGCC）₁₀用小鼠脑裂解物和控制人类额叶皮层。使用针对Purα和TDP-43的抗体对洗脱蛋白进行的Western blot分析表明，Purα（而非TDP-43）与rGGGCC重复序列相关，这表明Purα与rGGCC的重复序列之间存在特定的相互作用，在小鼠和人类之间是保守的。

PurαRescures rGGGCC重复诱导哺乳动物神经变性的过度表达果蝇属模型系统。

如果rGGGCC重复序列通过结合Purα至少部分地发挥其毒性，则Purα与r（GGGCc）共表达₃₀应该可以改善细胞死亡。为了验证这个想法，我们暂时联合转染了r（GGGCC）₃₀-EGFP与Purα或hnRNP A2/B1表达载体一起构建到Neuro-2a细胞中。转染后48小时，我们发现Purα能够挽救细胞活力，但hnRNP A2/B1没有发现这一点(图5A类). 我们还检测了Purα和rGGGCC重复介导的神经退行性变之间的遗传相互作用果蝇属.我们穿越了（GGGCC）₃₀使用我们之前在Gmr-GAL4驱动器存在下产生的无人机Purα飞行系重复转基因飞行(19)发现Purα的过度表达可以抑制rGGGCC介导的神经变性(图5B类).

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图5。

Purα的过表达抑制rGGGGCC重复介导的神经退行性变。(A类)Purα过度表达可减轻Neuro-2a细胞中rGGGCC重复介导的细胞死亡。使用GGGCC重复表达结构和Purα或hnRNP A2/B1表达载体共同转染Neuro-2a细胞。转染（GGGGCC）的Neuro-2a细胞的细胞活力显著降低₃₀构建pcDNA控制载体并与转染（GGGGCC）的细胞进行比较_三构建或控制EGFP表达载体(P（P）< 0.0001,t吨测试）。（GGGCC）存在下Purα过度表达₃₀构建体显著提高了细胞活力(P（P）= 0.0041,t吨测试）。(B类)灯光(顶部)和电子(中间的和底部)蝇眼中过度表达Purα和rGGGCC重复序列的蝇的显微镜观察。(左侧)表达苍蝇（GGGCC）₃₀-EGFP。(赖特)表达苍蝇（GGGCC）₃₀-EGFP和Purα。(C类)Purα基因敲除诱导Neuro-2a细胞死亡。针对Purα的siRNA瞬时转染显著降低PurαmRNA水平(左侧) (P（P）< 0.0001,t吨检测）和细胞活力(赖特) (P（P）= 0.0022,t吨测试）。

此外，考虑到Purα的过度表达减少了rGGGCC重复序列诱导的细胞死亡，我们推断Purα本身的丢失应该导致细胞死亡。为了验证这个想法，我们用抗Purα的siRNA转染Neuro-2a细胞，发现细胞活力显著降低(图5C类).

最后，考虑到我们的MS分析也确定Purβ是一种潜在的rGGGCC重复结合蛋白，尽管其丰度低得多，并且由于Purβ与Purα具有高度同源性，我们还使用Neuro-2a细胞进行了共转染拯救和siRNA敲除实验，以评估Purβ在rGGGCC重复介导的神经元毒性中的作用。有趣的是，在这些实验中，Purβ的行为与Purα类似(图S3).

Purα在扩展GGGGCC重复中形成夹杂物果蝇属人类携带者的模型和大脑。

除了TDP阳性内含物外，人类GGGCC扩增携带者在C9或72最近的研究表明，在一些脑区有p62阳性TDP阴性内含物(21). 有趣的是，p62阳性TDP-阴性内含物似乎对扩增重复载体相当特异(22,23)，这让我们质疑Purα是否在果蝇属表达扩展重复序列或携带扩展重复序列的人类C9或72六聚体重复。在德罗索比拉rGGGCC中存在与泛素共定位的Purα内含物₃₀-表达苍蝇，但在rGGGCC中不表达_三-表达苍蝇(图6A类). 在患有神经病理学定义的额叶叶变性伴TDP-43内含物（FTLD-TDP）的人小脑中，Purα形成内含物(图6B类和图S4). 具体来说，在小脑分子层，我们在四个扩增的GGGGCC重复序列载体中的三个、四个FTLD-TDP非载体中的三个和六个对照中的一个中发现了核内包涵体。有包涵体的对照组是年龄最大的个体，在94岁时接受检查，与病例相比，主观上包涵体较少。其他染色结果见SI文本.

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图6。

rGGGCC中的Purα包裹体果蝇属和人类GGGCC扩增重复携带者。(A类)果蝇属在表达扩张rGGGCC重复序列的果蝇中，Purα和泛素在rGGGC诱导的内含物中共定位。用rGGGCC显示了14日龄苍蝇眼睛横截面的共焦图像_三（控制）或GGGCC₃₀ 在trans中对gmr-GAL4，用泛素抗体（红色）和Purα抗体（绿色）染色。细胞核用DAPI（蓝色）染色。(B类)患有FTLD-TDP的人小脑中Purα形成内含物。FTLD-TDP患者小脑分子层和颗粒细胞层的p62和Purα染色显示，rGGGCC重复序列扩增。在分子层中，p62阳性TDP阴性核内包涵体显示为红色箭头，Purα染色的核内包包体显示为蓝色箭头。在颗粒细胞层中，p62阳性TDP阴性内含物显示为绿色箭头，Purα内含物表示为黑色箭头。

讨论

最近，GGGGCC在C9或72被发现是ALS和FTD最常见的遗传原因(10). 扩增的GGGGCC重复序列如何引起神经退行性变尚不清楚。在这里，我们假设rGGGCC重复序列结合RBP，促进RBP的隔离，使其脱离RNA代谢的正常作用，从而导致神经退化。在这里，我们报道rGGGCC重复序列的表达可导致神经退行性变。我们已将Purα确定为与表达的rGGGCC重复序列结合的主要RBP之一，并提供了生化和遗传学证据，表明rGGGCCC重复序列以序列特异的方式与Purα相互作用，表明Purα参与ALS/FTD。

为了测试重复RNA-介导的毒性是否是ALS/FTD中GGGGCC重复序列扩增的潜在机制，我们在哺乳动物神经元细胞中表达了扩增的和正常的rGGGCC-重复序列，发现只有扩增的rGGFCC-重复序列的表达才能诱导细胞死亡。然后我们使用了果蝇属模型显示，扩展的rGGGCC重复序列的表达会导致苍蝇眼睛的年龄依赖性中断和运动减少，rGGCCC重复序列表达分别指向苍蝇眼睛或运动神经元。这些效应是扩张的rGGGCC重复表达果蝇特有的，在表达EGFP或正常rGGGGCC的文件中没有发现，这强烈表明观察到的细胞死亡是这些细胞中rGGCCC RNA表达的直接结果，而不是靶向效应或与不同品系的相对表达水平有关。

在显示扩增的rGGGCC重复序列诱导神经退行性变后，我们使用小鼠脊髓裂解物在体外确定Purα是结合扩增rGGCCC重复序列的主要RBP，然后在体内确认这种相互作用。我们还发现Purβ结合rGGGCC重复序列；然而，我们选择关注Purα，因为它在大脑中更丰富。小鼠脑裂解物中rGGGCC重复序列和RBP之间的相互作用是特异性的，仅部分减少rGG重复序列。这一发现表明，Purα结合rGGGCC重复序列的亲和力比rCGG重复序列高，或者可能存在rGGGCCC和rCGG重叠序列的单独结合位点，它们可以变构地相互修饰。我们还没有发现TDP-43使用小鼠或人脑裂解物结合rGGGGCC重复序列的证据。有趣的是，我们发现，尽管已知hnRNP A2/B1与rGGG重复序列结合，但无论是在体外还是在体内，hnRNP A2/B1都没有明显结合rGGGCC重复序列，类似于Purα。这一结果可能与最近关于rGGGCC重复序列体外hnRNP A2/B1结合的报道不一致(24)但这种差异可能与两项研究之间的结合条件差异和输入材料中RBP的相对丰度有关。这些差异也可以解释先前研究中报道的rGGGCC重复序列的hnRNP A3结合(24)但在本研究中没有。

最后，我们发现Purα的过度表达可以减轻rGGGCC介导的神经退行性变果蝇属和哺乳动物细胞。我们还发现，Purβ（而非Purγ）的作用类似于Purα，它在被敲除后诱导细胞死亡，并通过减弱rGGGCC介导的细胞死亡。重要的是，我们在rGGGCC中检测到Purα内含物₃₀-表达苍蝇。在人类受试者中，我们最有趣的发现是FTLD-TDP病例小脑分子层核内包涵体的频率与对照组不同。这一发现的意义尚不清楚，因为有或无扩大GGGCC重复序列的FTLD-TDP病例显示这些内含物，需要在更大的病例系列中进行随访。总的来说，我们的数据支持这样的假设，即扩大的GGGCC重复序列可以通过将RBP从其正常细胞作用中隔离出来而导致功能的毒性增加，并表明Purα在疾病中的潜在作用。

在ALS/FTD中，有令人信服的遗传和病理证据表明RBP参与疾病发展。在遗传学上，两个RBP的突变，即TDP-43和保险丝，可导致任何一种疾病。病理学上，这两种疾病最常见的特征是TDP-43阳性蛋白内含物。我们发现了Purα和Purβ可能参与ALS/FTD的证据。Purα是一种进化上保守的RBP，具有多种功能，包括调节基因转录和翻译，在控制细胞周期和分化中起着重要作用(25). 它也是RNA转运颗粒的组成部分，并与许多蛋白质相互作用，包括Purβ(26). 如果GGGGCC重复相关的ALS/FTD是由RNA毒性引起的，那么我们预计神经元表达C9或72逐渐积累与Purα结合的rGGGCC重复序列的基因，最终导致Purα的耗竭。鉴于Purα在RNA转运颗粒中的作用，Purα的逐渐丢失可能特别重要，这可能导致神经元内转运的多个mRNA的丢失。事实上，轴突运输缺陷长期以来被认为是神经退行性疾病中的一个常见问题(27).

最近的证据表明，潜在有毒的同聚蛋白是由非编码重复序列翻译而来的(16)通过一个称为重复关联非ATG（RAN）翻译的过程，RAN翻译的证据已在C9或72扩展重复载波(28,29). 然而，这些同聚蛋白是否有助于疾病的发病机制尚待确定。RAN翻译和RNA-介导的毒性都可能以相加或协同的方式导致疾病。事实上，通过与rGGGCC重复序列直接相互作用或通过招募其他蛋白质，添加Purα和其他特异性结合rGGCCC重复序列的RBP可能会阻止RAN翻译。

所有模型都有局限性，我们使用30个GGGCC重复序列作为扩展重复序列的替代可能会限制我们工作的通用性。现有数据表明，90%的人类等位基因位于或低于8个重复序列，其中两个重复序列占等位基因的50%以上(11,17). 另一方面，大多数受影响的携带者似乎有数百到数千次重复，而不是30次；然而，有证据表明重复序列的躯体不稳定，导致疾病所需的最小重复大小尚不清楚(11). 在像我们在本研究中使用的过表达系统中，重复的实际拷贝数可能远大于生理条件下的拷贝数。此外，我们发现来自不同物种的Purα对rGGGGCC重复序列具有不同的亲和力，这极有可能影响可检测细胞损失的阈值。我们的模型代表了我们可以稳定引入的最大重复；我们认为在C9或72基因本身。的确，尽管有可能减少C9或72基因表达可能与人类疾病有关；很明显，GGGGCC重复序列发挥毒性作用的特定基因既不必要也不充分。

总之，我们的研究结果表明，rGGGCC在哺乳动物和果蝇属系统可导致神经退化。Purα是一种主要的结合rGGGCC的蛋白，Purα与rGGGCCC之间的相互作用具有序列特异性和剂量依赖性。我们发现Purα在哺乳动物细胞或果蝇属可以抑制rGGGCC介导的神经退行性变，我们还发现了Pur-α在果蝇属表达rGGGCC₃₀人类病例中Purα染色显示C9或72带有FTLD-TDP的载波和非载波。综上所述，这些发现表明，新发现的ALS/FTD中GGGCC的扩增部分通过RNA介导的毒性作用，并指出Purα是一种RBP，可能在ALS/FTT疾病的发病机制中发挥作用。

材料和方法

补充材料

致谢

脚注

工具书类