分子细胞生物学。2013年5月；33(10): 2078–2090.
基质细胞蛋白CCN1通过诱导肝肌成纤维细胞衰老促进肝纤维化的逆转
美国伊利诺伊州芝加哥伊利诺伊大学生物化学和分子遗传学系
通讯作者。*现住址：美国伊利诺伊州芝加哥圣泽维尔大学生物科学系Ricardo I.Monzon。
2013年1月11日收到；2013年2月15日要求的修订；2013年3月9日验收。
摘要
肝纤维化是对慢性肝损伤的一种创伤愈合反应，与潜在病因无关，并可能发展为危及生命的肝硬化。在这里，我们发现CCN1是CCN（CYR61/CTGF/NOV）家族的基质细胞蛋白，在人类肝硬化肝细胞中积累。肝发育或再生不需要CCN1，因为这些过程在肝细胞特异性小鼠中是正常的通讯录1删除。然而，通讯录1表达在肝损伤时上调，并具有抑制四氯化碳中毒或胆管结扎诱导的肝纤维化发生和促进纤维化消退的功能。CCN1通过结合整合素α触发活化的肝星状细胞和门静脉成纤维细胞的细胞衰老6β1通过RAC1-NADPH氧化酶1复合酶诱导活性氧物种积累，从而衰老细胞表达抗纤维化遗传程序。肝细胞特异性小鼠通讯录1缺失导致纤维化加剧，伴随着细胞衰老缺陷，而肝脏过度表达通讯录1减少肝纤维化并增强衰老。此外，尾静脉输送纯化CCN1蛋白可加速已建立纤维化小鼠的纤维化消退。这些发现揭示了一种新的整合素依赖性慢性肝损伤纤维化解决机制，并将CCN1信号通路确定为治疗干预的潜在靶点。
简介
肝纤维化，或肝脏中过量细胞外基质（ECM）的积聚，是一种病理学，是对多种病因造成的慢性肝损伤的创伤愈合反应，包括病毒感染、酒精中毒、胆道梗阻和非酒精性脂肪性肝炎(1,2). 这些情况可能会导致纤维化，多年来往往会隐匿地发展，导致肝硬化，从而加重肝衰竭、门脉高压和肝细胞癌，从而给公共卫生带来巨大负担。目前，没有FDA批准的治疗肝纤维化的药物，更好地了解如何解决这一病理问题至关重要。与许多器官和组织一样，肝脏的损伤修复与炎症反应和临时ECM的沉积有关，后者通过增强受损组织的完整性和促进实质细胞的增殖来帮助伤口愈合(三). 这个临时基质在修复的后期被分解和重塑，以形成成熟组织。然而，慢性损伤会导致持续炎症和持续刺激ECM的生成，而没有足够的机会进行基质分解和重塑，从而导致纤维化，因为过量的ECM会扭曲组织结构并取代实质。
肝窦周星状细胞（HSCs）是主要的前体细胞，在肝损伤后激活时可转分化为增殖的、产生ECM的肌纤维母细胞样细胞，而门静脉成纤维细胞（PFs）也经历成肌纤维细胞分化，在胆道梗阻引起的纤维化中起重要作用(2,4). 骨髓源性细胞和上皮细胞也可能分化为肌成纤维细胞(5,6)尽管它们对肝纤维化的影响程度一直存在争议(7,8). 曾经被认为是不可逆的，最近的证据表明，如果消除了疾病的根本原因，动物模型和人类患者中由不同病因引起的肝纤维化会逐渐退化(1,2). 这些结果表明存在肝纤维化解决的内源性机制。例如，产生ECM的肌成纤维细胞可以通过凋亡被清除(2)最近的研究表明，这些细胞也可以恢复为非活性的非纤维细胞表型(9,10)或进入衰老状态(11)导致ECM停止生产。虽然肌成纤维细胞凋亡和转化为非活性表型都阻止了ECM的进一步生成，但衰老的肌成纤维纤维细胞可能通过表达抗纤维化基因程序，作为衰老细胞特有的衰老相关分泌表型（SASP）的一部分，积极促进纤维化的消退，包括基质降解酶的上调和ECM蛋白如胶原的下调(12,13). 此外，衰老细胞可以被自然杀伤细胞清除(11). 因此，肌成纤维细胞进入衰老阶段可以阻止这些产生ECM的细胞进一步增殖，促进ECM降解，并加速肌成纤维蛋白从损伤部位的清除。然而，细胞衰老在限制肝纤维化中的作用是一个新兴的概念，仅在CCl的背景下才显示出来4-诱导损伤，以及诱导肌成纤维细胞衰老的分子触发因素尚不清楚。
这里我们显示了基质细胞蛋白CCN1（也称为CYR61）(14,15)虽然对肝脏的发育和功能不是必需的，但在肝硬化患者的肝脏中高度积累。此外，在小鼠模型中，CCN1的表达是在肝损伤后诱导的，它是通过活性氧物种（ROS）在活化的HSC和PFs中的积累触发细胞衰老的关键调节因子，从而限制纤维化形成并促进由各种损伤诱导的肝纤维化的消退。此外，在已建立纤维化的小鼠中，尾静脉输送纯化CCN1蛋白可加速纤维化的消退。这些发现揭示了通过CCN1介导的整合素信号发挥作用的纤维化逆转的关键机制，并确定了治疗干预的潜在靶点。
材料和方法
动物和肝纤维化诱导。
肝纤维化研究中使用的所有小鼠都是2至4个月大的雄性，由兽医护理饲养在屏障设施中。通讯录1糖尿病/糖尿病小鼠在svJ129-C57BL/6混合背景中产生，并回交到C57BL/6背景中10次以上(16,17). 生产通讯录1弗洛克斯/弗洛克斯和抄送1ΔHep公司小鼠，svJ129小鼠胚胎干细胞转染通讯录1-电穿孔靶向构建并筛选出对新霉素的耐药性。带有双重组事件的转染克隆结合靶向结构通讯录1基因组位点（参见)选择并注射到囊胚中以产生靶向嵌合小鼠。注射是在伊利诺伊大学转基因生产服务设施进行的。用EIIa-核心删除子培育小鼠，用期望的液氧P2到loxP3型通过使用位置引物进行基因组DNA分析，选择去除新霉素盒的缺失。将选定的小鼠与C57BL/6小鼠回交四次，以获得通讯录1弗洛克斯/+杂合子动物并繁殖以获得通讯录1弗洛克斯/弗洛克斯老鼠。通讯录1ΔHep公司小鼠是通过杂交产生的通讯录1弗洛克斯/弗洛克斯Alb-Cre小鼠(18)（杰克逊实验室）在白蛋白启动子的控制下表达Cre重组酶。删除通讯录1使用肝脏基因组DNA进行PCR验证（参见)和引物（参见). 转基因小鼠过度表达通讯录1通过向C57BL/6单细胞合子中注入全长的通讯录1cDNA是在pAlb中与白蛋白增强子元件相连的最小启动子的控制下克隆的。GH载体(19). 为了便于转基因检测，在第3′框中将V5表位序列添加到通讯录1cDNA。使用针对V5表位（克隆V5-10；Sigma）的单克隆抗体，通过肝裂解物的Western blotting检测转基因蛋白的表达。
肝细胞特异性缺失通讯录1不会损害肝脏的发育或再生。（A） 显示目标的示意图通讯录1基因组位点通讯录1弗洛克斯-新等位基因通讯录1弗洛克斯通过重组删除新霉素耐药盒的等位基因液氧磷站点2和3(液氧磷2/3），以及通讯录1ΔHep公司Cre介导的切除后的基因座。左指向三角形表示液氧磷地点。引物R序列只出现在第三个液氧磷现场。C介导的重组液氧磷站点2和3导致删除PGK-neo（灰框）以生成所需的通讯录1弗洛克斯等位基因。（B） 通讯录1弗洛克斯当引物F2和R用于PCR时，等位基因被检测为391-bp的DNA带。通讯录1弗洛克斯/弗洛克斯小鼠与Alb-Cre小鼠杂交产生通讯录1Δ肝功能老鼠。ΔHep公司通过使用引物F1和R.（C）从6周龄婴儿中分离出的总肝RNA，通过119-bp DNA带的存在确认了等位基因通讯录1弗洛克斯/弗洛克斯和通讯录1ΔHep公司对小鼠进行分析通讯录1RT-PCR表达。通讯录1通过Image J软件分析，根据β-actin对mRNA带强度进行标准化，以校正相同水平的样本加载。低水平通讯录1mRNA可能来自非实质细胞。（D至F）肝再生由2/3肝部分切除术（PHx）后指定天数内残余肝重量/全肝重量的百分比决定；数据表示为平均值±SD(n个=5个）。（D） 八周大抄送1弗洛克斯/弗洛克斯(弗洛克斯)和通讯录1ΔHep公司(ΔHep公司)在PHx后的指定日期处死小鼠，并测量肝脏重量。（E） 对不同年龄段的小鼠进行PHx试验，7天后进行评估。（F） PHx后，在指定的日期收集残余肝组织，并用Ki67抗体进行免疫组织化学染色，分析细胞增殖情况。在5个随机选择的高功率场中计数Ki67阳性细胞相对于细胞总数的百分比(n个= 3).
为了诱导肝纤维化，雄性小鼠腹腔注射CCl4（1 ml/kg体重在橄榄油中按1:10稀释）每周两次，持续4-6周(20). 如前所述进行胆管结扎（BDL）(21)诱导慢性胆汁淤积，并以假手术作为对照。对于CCN1治疗，40μg纯化重组CCN1蛋白(22)用1ml生理盐水稀释，并用流体动力输送法以6ml/min的速度通过尾静脉注射(23). 单独注射生理盐水溶液作为对照。所有程序均由伊利诺伊大学动物护理委员会批准。
肝部分切除术。
根据公布的方案，对正常雄性小鼠进行2/3部分肝切除术(24). 在指定日期称重并处死小鼠；然后，取下肝脏，称重，冷冻保存以进行细胞增殖分析。
肝细胞的分离。
如前所述，通过两步胶原酶灌注法分离肝细胞(25). 清洗后，在50×克重复了四次。分别从颗粒和上清液中获取肝细胞和非精细胞。如前所述，从正常成年雄性小鼠中分离出HSC(26). 通过油红O染色和抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）（Abcam）、结蛋白（克隆DE-U-10；Sigma）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）抗体的免疫细胞化学分析，证实了储存维生素A和类维生素A的HSC。根据已发表的方案从肝门分离PFs(27)α-SMA和弹性蛋白（Abcam）免疫细胞化学分析证实。人类激活的HSC从ScienceCell购买，并在制造商提供的培养基中生长。
组织学、免疫组织化学、人肝组织芯片、SA-β-Gal和TUNEL分析。
为了检查肝纤维化，按照制造商的方案，用Picrosirius Red溶液（美国MasterTech Scientific）对福尔马林固定石蜡包埋组织切片（7μm厚）进行染色。纤维病变呈红色；六个随机选择区域的显微照片（3.4 x 2.5 mm2)并使用NIH Image J软件分析图像以量化纤维化区域。为了免疫组化检测人类肝组织阵列（LV20812；US Biomax，Inc.）和小鼠组织中的CCN1，我们用细菌谷胱甘肽融合蛋白免疫兔子S公司-转移酶（GST）连接到小鼠CCN1 von Willibrand因子C型重复序列（vWC）结构域，我们使用抗原作为配体，通过亲和柱层析纯化产生的抗血清。二级抗体（GE Healthcare）与辣根过氧化物酶结合，并使用3,3′-二氨基联苯胺（DAB；Sigma）作为显色剂。样品用苏木精复染。如前所述，组织冰冻切片（5μm厚）的衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色在pH 5.5下进行，培养细胞的染色在pH 6.0下进行(28). 随机选择区域的六张显微照片（0.25 x 0.2 mm2)从每只动物的每一个切片中提取，通过使用NIH Image J程序分析数字图像来计算阳性细胞数。用兔多克隆抗p16抗体（Santa Cruz）或小鼠单克隆抗SMA抗体（克隆1A4；Sigma）对肝脏冷冻切片进行双重染色。识别兔IgG的二级抗体与红色荧光染料Alexa Fluor 546（Invitrogen）偶联，抗小鼠IgG二级抗体用绿色荧光染料Alexa Fluoro 488（Invit罗gen）标记。样品用4′，6′二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）复染以显示细胞核。使用蔡司Axiovert 200 M显微镜获取荧光显微照片。使用Ki67抗体（Abcam）通过免疫组织化学方法评估冰冻切片中的细胞增殖。根据制造商的方案，使用ApopTaq Red检测试剂盒（Millipore）进行末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP-生物素缺口末端标记（TUNEL）分析。对每个样品随机选择的八个高倍显微镜场进行分析；计算Ki-67或TUNEL阳性细胞的数量，并将其表示为总细胞的百分比。
蛋白质斑点。
肝组织在Laemmli缓冲液中均质并煮沸，用12%SDS-PAGE溶解等量的蛋白质，然后用增强化学发光检测进行免疫印迹（GE Healthcare）。使用的抗体包括绵羊抗小鼠CCN1（研发系统）、兔抗α-SMA（Abcam）、小鼠单克隆抗V5（克隆V5-10）和抗β-肌动蛋白（mAbcam8226；Abcam）。
RNA分离和qRT-PCR。
按照制造商的方案（Qiagen），使用RNeasy迷你试剂盒从肝组织和HSC中纯化总RNA。使用SuperScript逆转录酶III（Invitrogen）逆转录RNA（2μg）。将cDNA和引物与反应缓冲液iQ SYBR green Supermix（Bio-Rad）混合，进行定量逆转录-PCR（qRT-PCR），并使用iCycler热循环器（Bio-Rad）进行反应。琼脂糖凝胶电泳和熔融曲线分析证实了PCR的特异性。管家基因(亲环素E)用作内部标准。
组织胶原蛋白含量的测量。
根据先前公布的方案，肝组织中的胶原蛋白量被确定为每毫克干肝组织中羟脯氨酸（μg）的量(29). 使用纯羟脯氨酸（Sigma）生成标准曲线。
ROS检测。
如前所述，通过荧光显微镜测定细胞内ROS水平(30). 简单地说，用10μM二氢钙黄绿素（DHC；Invitrogen）加载细胞10分钟，然后用CCN1或前面描述的其他因子治疗。用Hoechst 33342（Invitrogen）（1μg/ml）对细胞进行复染，并立即用荧光显微镜检查。随机选择五个高功率场进行拍照，并使用NIH Image J软件测定DHC积分荧光强度。
RNA干扰。
用10 nM小干扰RNA（siRNA）靶向转染细胞1号,编号4,种族1或者根据制造商的协议，使用Lipofectamine RNAiMAX试剂（Invitrogen）进行扰乱序列控制（集成DNA技术）。转染48 h后用RT-PCR分析基因表达。用于siRNA敲除的序列（5′至3′）如下：对于Nox1，CCAAGATTCTCTCGTGTAGTAC（siNox1#1）和GATGGTTAGCAAGAATTCTTT（siNox1#2）；对于Nox4，AATTAGAAACTCTTTGCGTAGGTAG；对于Rac1，GTGGTGTCGACTTCAGCACTT。
统计分析。
所有实验重复至少三次，结果相似。学生的t吨进行测试以确定统计上显著差异的概率(P（P）值），结果记录在图形图例中。根据明亮视野显微镜检查，人类肝组织中CCN1免疫组织化学染色强度分为低、中、高水平。通过Mann-Whitney U检验分析正常肝组织和肝硬化肝组织中CCN1病毒强度的差异，以确定统计学上显著差异的概率。
结果
CCN1在人类肝硬化的肝细胞中被高度诱导，并对肝损伤作出反应。
CCN1是一种参与皮肤伤口愈合和骨折修复的基质细胞蛋白(31,32); 然而，其在正常肝脏发育、功能或病理中的作用尚不清楚。用免疫组织化学方法对人类肝脏标本进行检查，结果显示CCN1蛋白在正常肝脏中水平较低，但在肝硬化中显著升高(). 大约75%的正常肝脏保持低水平的CCN1，25%表现为中等水平，没有表现出高水平的积累。肝硬化患者的这种分布发生了显著变化，其中40%的患者表现出高水平的CCN1，44%和16%的患者表现为中、低水平(). CCN1主要定位于肝细胞的细胞质中，表明肝细胞是CCN1的主要来源，提示其分泌或内化可能受到高度调节。
人类肝硬化和CCl后CCN1高度升高4对小鼠的治疗。（A） 人肝组织阵列中正常和肝硬化人肝组织中CCN1免疫组织化学染色的代表性图像（棕色）。棒材=100μm。（B） 人类肝组织阵列中CCN1的染色强度分为低、中、高，通过Mann-Whitney U检验分析正常组织和肝硬化组织之间的差异，P（P）= 4.8 × 10−6（C）未经处理的小鼠和注射CCl的小鼠肝切片的免疫组织化学4每周两次，连续四周，用对照IgG或抗CCN1抗体进行检测，并用苏木精进行复染。棒材=100μm。（D） 未经治疗的小鼠和注射CCl的小鼠的肝裂解物4连续6周，每周两次在SDS-PAGE上进行解析，然后使用抗CCN1和β-肌动蛋白抗体进行免疫印迹(n个= 3). （E）通讯录1通过qRT-PCR分析CCl后指定时间分离的肝脏RNA的表达4注入(n个= 6). 数据表示三次试验结果的平均值±标准偏差（SD）。相对，相对。（F） 从正常肝细胞或分离的肝细胞（HC）和未经处理的小鼠（正常）或CCl后6 h的小鼠肝脏的非实质细胞（NP）中获取RNA4治疗。抄送1通过qRT-PCR分析表达。数据表示在一式三份的实验中确定的结果的平均值±标准差。（G） 将从正常小鼠新鲜分离的肝细胞与TNF-α（10 ng/ml）、IL-6（20 ng/ml。这个通讯录1用qRT-PCR分析mRNA水平(n个= 3). 数据表示三次试验结果的平均值±SD。*，P（P）< 0.004.
为了研究CCN1在肝损伤修复和纤维化中的作用，我们使用了一个小鼠肝纤维化模型。肝毒素CCl4被主要在中央静脉周围表达的细胞色素P450系统代谢，产生自由基中间体，导致急性细胞死亡和炎症，如果损伤持续，则导致纤维化。CCN1定位于正常小鼠肝脏的肝细胞中，重复CCl后在中央静脉周围积聚到较高水平4侮辱(). 此外，CCN1染色在具有肝细胞特异性的小鼠肝脏中丢失通讯录1删除（ΔHep公司)（见下文），证实肝细胞是表达CCN1的主要细胞类型(). 同样，免疫印迹显示CCN1蛋白在正常肝脏中的检测水平较低，但在CCl后大量积累4-致伤(). 肝细胞特异性小鼠肝脏中CCN1水平几乎消失通讯录1缺失，但CCl后略有增加4治疗，最有可能发生在非实质细胞(). 单剂量CCl的急性反应4治疗迅速诱发通讯录16小时内肝脏mRNA水平增加80倍以上(). 与未经处理的对照组相比，即使在重复CCl后，mRNA水平也逐渐降低，但仍保持升高4建立纤维化的治疗。从正常或CCl新鲜分离的原代肝细胞4-经处理的小鼠表达通讯录1mRNA分别是肝脏非实质细胞mRNA的4倍或5倍()进一步表明肝细胞是CCN1的主要来源。此外，用炎性细胞因子肿瘤坏死因子α（TNF-α）而非白细胞介素-6（IL-6）治疗原代肝细胞，可诱导通讯录1(). 总之，这些结果表明通讯录1在肝细胞中高度诱导，以应对肝损伤，并可能受到炎症细胞因子（如TNF-α）的调节，这些炎症细胞因子在肝损伤中迅速升高。
自抄送1生殖系对心血管发育至关重要通讯录1基因敲除小鼠胚胎致死(33,34). 检查通讯录1在肝脏发育和功能方面，我们生成了肝细胞特异性缺失通讯录1(通讯录1ΔHep公司)使用Cre-loxP策略().抄送1弗洛克斯/弗洛克斯小鼠的体内通讯录1基因组位点被替换为通讯录1前两个外显子侧翼有LoxP位点的等位基因，其缺失产生真正的无效等位基因(33). 在白蛋白启动子的控制下，这些小鼠与在肝细胞中表达Cre重组酶的小鼠交配。肝细胞特异性通讯录1缺失，用位置特异性引物进行PCR分析确认()，导致通讯录1肝脏中的mRNA通讯录1ΔHep公司小鼠与通讯录1弗洛克斯/弗洛克斯对照小鼠()以及免疫组织化学法对肝脏CCN1蛋白染色的虚拟消除().通讯录1ΔHep公司小鼠存活且可生育，肝脏组织学正常，没有明显的行为或形态异常，表明CCN1对肝脏发育或功能不是必需的。此外，2/3部分肝切除术后的肝再生发生率与通讯录1Δ肝功能鼠标，如中所示通讯录1弗洛克斯/弗洛克斯对照小鼠(). 接受手术的小鼠的年龄没有改变结果()，以及两者通讯录1ΔHep公司和通讯录1弗洛克斯/弗洛克斯手术后7天，小鼠达到与野生型（WT）小鼠相同的肝脏重量（数据未显示）。通过免疫组化分析Ki67表达检测到的肝细胞增殖水平也无法区分(). 这些结果表明通讯录1正常肝脏发育或肝细胞增殖不需要。相反，它在肝硬化、急性和慢性肝损伤中的诱导作用表明了它在肝损伤反应中的作用。
CCN1通过诱导肌成纤维细胞衰老来限制多种病因引起的肝纤维化。
为了研究CCN1在慢性肝损伤中的功能，向小鼠注射CCl4每周两次静脉注射诱导肝纤维化，持续6周(20). 值得注意的是，CCl4-处理过的通讯录1ΔHep公司小鼠表现出显著的中心-中心桥接性纤维化，胶原沉积的纤维化区域是小鼠的约4倍通讯录1弗洛克斯/弗洛克斯对照小鼠(). 这个通讯录1ΔHep公司与对照组小鼠相比，小鼠还积累了约3倍的羟脯氨酸，这是胶原蛋白中一种主要的修饰氨基酸(). 此外，通讯录1ΔHep公司小鼠表达较高水平的肌成纤维细胞标记物α-SMA，表明前体细胞更广泛地激活以表达肌纤维母细胞表型(). 的表达式百万英镑9和百万像素13分别编码明胶酶B和胶原酶3的通讯录1Δ肝功能小鼠，而第1a1列基质金属蛋白酶抑制剂倾倒1明显更高(). 然而，通讯录1ΔHep公司和通讯录1弗洛克斯/弗洛克斯小鼠因CCl而遭受相同程度的肝损伤4因为他们的血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平和细胞增殖和凋亡的程度无法区分(到). 因此，肝脏的损失通讯录1导致CCl后肝纤维化加重4-诱导损伤，提示CCN1在限制肝损伤后纤维化中的作用。
CCN1在CCl中具有抗纤维化作用4-诱导的肝纤维化。（A至C）通讯录1弗洛克斯/弗洛克斯(弗洛克斯)和通讯录1ΔHep公司(ΔHep公司)小鼠腹腔注射溶媒或CCl4每周两次，持续6周以诱导纤维化(n个=7个）。（A） 肝脏切片用天狼星红染色以显示胶原沉积。通过对随机选择的六个区域的显微照片进行图像J分析来评估纤维化区域的百分比。数据表示平均值±SD.CV，中央静脉；PT，入口三联体。棒材=100μm。（B） 测定肝脏羟脯氨酸含量。（C） 肝裂解物在SDS-PAGE上溶解，然后使用抗α-SMA和β-actin抗体进行蛋白质印迹(n个= 3). （D） 用qRT-PCR分析所示基因的肝脏mRNA；数据显示为平均值±SD.*，P（P）< 0.005. （E至G）在单个CCl后的指定时间4注射或重复CCl后4连续6周（42天）诱导纤维化，测定血清ALT水平（E），并使用Ki-67（F）抗体对肝脏进行免疫组织化学分析，或进行TUNEL分析（G）。（H） qRT-PCR-量化通讯录2慢性CCl肝总RNA的基因表达4-或车辆处理WT，通讯录1糖尿病/糖尿病(Dm公司),通讯录1弗洛克斯/弗洛克斯(弗洛克斯)、和通讯录1ΔHep公司(Δ肝功能)老鼠(n个=3个）。
CCN2或结缔组织生长因子（CTGF）是CCN1的近亲，已被证明可促进肝纤维化，并被认为与转化生长因子β（TGF-β）协同作用(35,36). 有趣的是，尽管通讯录2在WT中感应或抄送1弗洛克斯/弗洛克斯CCl小鼠4-诱导纤维化，在小鼠中未观察到诱导通讯录1有缺陷，或者是基因缺失(通讯录1ΔHep公司小鼠）或敲除突变等位基因(通讯录1糖尿病/糖尿病; 见下文）。这些结果表明CCN1上调了抄送2慢性肝损伤时的表达。两者都有通讯录1ΔHep公司和通讯录1糖尿病/糖尿病小鼠在没有通讯录2过度表达(; 另请参见)表明过度的肝纤维化可以与升高的通讯录2表达。
CCN1通过整合素α发挥作用6β1结合位点体内.通讯录1糖尿病/糖尿病(Dm公司)和WT小鼠(n个=6个）用CCl腹腔注射4每周两次，持续6周。（A） 组织切片用天狼星红染色，并测量纤维化区域。（B） 测定肝脏羟脯氨酸含量。（C） 冰冻组织切片进行SA-β-Gal活性染色。（D） 在单剂量CCl后的指定时间点测量血清ALT水平4通过注射。棒材=100μm。
当产生ECM的肌成纤维细胞通过凋亡或衰老被清除时，肝损伤中纤维生成的终止可能部分发生(11,37)因此，这些过程中的缺陷可能导致通讯录1ΔHep公司老鼠。CCl中央静脉周围发现大量衰老细胞4-处理过的通讯录1弗洛克斯/弗洛克斯以衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）的表达作为标志判断小鼠，但其数量在通讯录1ΔHep公司老鼠()表明CCN1对衰老至关重要。衰老细胞也表达CDK抑制剂p16墨水4A（另一个衰老标志物），主要是（>80%）α-SMA表达的肌成纤维细胞(). 相反，抄送1ΔHep公司和通讯录1弗洛克斯/弗洛克斯小鼠表现出相似数量的凋亡细胞，其中许多（45%）也是α-SMA表达的肌成纤维细胞(和). 这些结果表明，肌成纤维细胞衰老的缺陷，而不是受损的肌成纤维纤维细胞凋亡，可能是通讯录1ΔHep公司老鼠。为了进一步评估CCN1的作用，我们培育了过度表达CCN1的转基因小鼠抄送1在肝细胞中(运行经验) (到). 的过度表达通讯录1CCl导致纤维化病变水平降低50%以上，羟脯氨酸水平降低40%4与野生型（WT）小鼠相比的损伤(和). 衰老细胞的数量在运行经验老鼠()进一步表明CCN1可触发肌成纤维细胞衰老，从而抑制肝损伤引起的纤维化。
CCN1通过诱导肌成纤维细胞衰老抑制肝纤维化。（A） 邻近系列肝脏冷冻切片通讯录1弗洛克斯/弗洛克斯和通讯录1ΔHep公司CCl治疗小鼠4为了诱导纤维化，对SA-β-Gal进行染色（上面板，蓝色；n个=7）和TUNEL（下部面板，红色；n个=3）分别用曙红和DAPI进行分析和复染。方框区域被放大并显示在插页中。SA-β-Gal-和TUNEL阳性细胞的百分比显示为平均值±标准偏差。（B）通讯录1弗洛克斯/弗洛克斯如上所述制备的肝脏切片进行p16双重染色INK4a公司（红色）和α-SMA（绿色）并用DAPI复染，或用TUNEL（红色）和α-SMA（绿色）双重染色并用DAPI复染。p16的百分比INK4a公司-显示α-SMA阳性或阴性的TUNEL阳性细胞。（C） DNA结构图通讯录1-过度表达（OE）转基因小鼠，显示通讯录1由与小鼠白蛋白基因增强子融合的最小启动子驱动的cDNA（P阿尔布). V5表位编码序列被添加到框架中通讯录13′端。pA，聚腺苷化信号。（D） 将OE和WT小鼠的肝裂解物在SDS-PAGE上进行解析，并使用V5表位和β-肌动蛋白抗体进行Western印迹分析。（E） 用抗CCN1抗体（棕色）对OE和WT小鼠的肝组织切片进行染色，并用苏木精进行复染。（F） 用CCl治疗OE和WT小鼠4持续6周(n个=6），肝组织切片用天狼星红染色；对纤维化区域进行量化。（G） 测定肝脏羟脯氨酸含量。（H） 肝组织切片进行SA-β-Gal染色，以评估衰老细胞的数量。白条=10μm；黑色条=100μm.*，P（P）< 0.02.
纤维化病变的类型取决于所涉及的病因(2). 而慢性CCl4中毒导致肝纤维化起源于中央静脉区，病毒性肝炎或胆道梗阻患者在门静脉三联体周围维持纤维化病理(2). 因此，我们测试了胆道结扎（BDL）后CCN1的作用，BDL是一种胆汁淤积症模型，可导致门脉周围纤维化(21).通讯录1ΔHep公司BDL后3周，小鼠的纤维化面积和羟脯氨酸含量比对照小鼠增加约3倍(和)SA-β-Gal阳性衰老细胞水平下降60%(). 这些小鼠的促纤维化基因表达增强(第1a1列,倾倒1、和Tgfb1型)以及ECM蛋白降解酶编码基因的下调(百万分之二和百万英镑9) ()与SASP的抑制作用一致。因此抄送1尽管如此，BDL后导致更少的衰老和更多的纤维化通讯录1ΔHep公司和通讯录1弗洛克斯/弗洛克斯对照组小鼠的肝损伤程度与血清ALT水平相似(). 相反通讯录1在里面运行经验小鼠肝纤维化面积和羟脯氨酸含量减少(和)伴随着衰老细胞水平的增加(). 这些结果表明，CCN1诱导细胞衰老以控制因多种病因引起的肝纤维化，并首次说明衰老限制了影响BDL后门静脉三联体的纤维化。
CCN1诱导细胞衰老以抑制慢性胆汁淤积引起的纤维化。（A至E）通讯录1Δ肝功能和通讯录1弗洛克斯/弗洛克斯对照小鼠(n个=4个）进行胆管结扎（BDL），3周后处死进行分析。（A和B）肝切片用天狼星红（A）染色，并测定肝羟脯氨酸含量（B）。（C） 肝切片用SA-β-Gal染色。纤维化和衰老的相对水平以平均值±SD表示。（D）用qRT-PCR分析纤维化相关基因的表达。（E） 如图所示，在BDL后的不同天分析血清ALT水平。所示数据为平均值±SD；n个= 4. （F至H）WT和OE小鼠(n个=4个）。（F和H）肝切片用上文所述的天狼星红（F）和SA-β-Gal（H）染色，以揭示纤维化和衰老。（G） 测定肝脏羟脯氨酸含量。CV，中央静脉；PT，入口三联体。棒材=100μm.*，P（P）< 0.02.
CCN1可诱导活化HSC和PF的细胞衰老。
肝损伤后，活化的HSC和PFs分化为肌纤维母细胞样细胞，并在纤维化形成中发挥关键作用(2). 新鲜分离的HSC用油红O染色阳性，并表达神经胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）和结蛋白，但不表达弹性蛋白；在培养的几天内，这些细胞被激活并分化为表达α-SMA的肌纤维母细胞样细胞（数据未显示）。当用纯化的CCN1蛋白处理分离的活化HSC时，它们进入衰老，因为它们变得扁平和扩大，停止增殖，并表达SA-β-Gal(和). CCN1还增强了百万英镑9,百万像素13、和白介素-6但纤维化前基因表达减少(第1a1列,倾倒1、和Tgfb1型)与SASP的表达一致(). 几行证据表明整合素α6β1，成纤维细胞中的主要CCN1受体(38)，介导CCN1诱导活化HSC衰老。首先，CCN1-DM突变蛋白(39)，其α被破坏6β1结合位点对衰老诱导活性有缺陷，因为它不抑制细胞增殖或诱导SA-β-Gal表达(和). 第二，CCN1与抗整合素α的功能块单克隆抗体共培养6（GoH3），但不控制IgG，抑制CCN1诱导的衰老(). 最后，α6β1-结合肽（T1）(40)与α结合的配体竞争6β1消除了CCN1诱导的衰老，而不结合α的突变T1肽6β1没有效果(). 此外，CCN1还诱导α6β1-激活的人类HSC中的依赖方式(和). 我们还分离出表达弹性蛋白但不表达结蛋白的PFs(27)（数据未显示），并发现CCN1通过抑制细胞增殖和诱导SA-β-Gal和SASP的表达，触发激活PF中的细胞衰老(到).
CCN1诱导活化的HSC和PF衰老。（A） 分离的小鼠HSC在培养中被激活，并用纯化的重组CCN1蛋白（2.5μg/ml）或BSA处理6天。显示了细胞形态（上面板）、SA-β-Gal分析（下面板）和定量结果。（B） 在添加CCN1、DM突变蛋白或BSA（各2.5μg/ml）培养后的指定时间内计数细胞数量。（C） 用BSA或CCN1处理细胞3天，并进行qRT-PCR以量化指示基因的表达。（D） 用BSA、CCN1或DM处理细胞，或用整合素α功能阻断抗体预培养细胞6（GoH3）或对照IgG（50μg/ml）。（E） 用BSA或CCN1处理细胞3天，α6β1在检测SA-β-Gal（F）活性PFs之前，将整合素结合T1肽或非结合突变体（mut-T1；每个0.5 mM）作为竞争物。用CCN1（2.5μg/ml）或BSA处理6天，并检测SA-α-Gal活性。显示了SA-β-Gal测定和定量结果。（G） 计算在BSA、CCN1或DM存在下生长的细胞数。（H） 用BSA或CCN1处理PFs 3天，用qRT-PCR评估指示基因的表达。（I和J）活化的人HSC与BSA或CCN1培养3天，计算细胞总数（I）或检测细胞SA-β-Gal（J）。如有指示，在添加CCN1之前，用T1和mut-T1肽对细胞进行预处理。数据表示为三次测定的平均值±SD。*，P（P）< 0.02. 棒材=10μm。
α的参与6β1通过CCN1在人皮肤成纤维细胞中激活小G蛋白RAC1(41)，具有多种功能，包括作为NOX复合物的激活亚单位，诱导ROS的生成(42). CCN1在活化的HSC和PFs中诱导ROS(和)以及CCN1与ROS清除剂的共培养N个-乙酰半胱氨酸抑制衰老，表明需要活性氧(和). 因为NOX抑制剂罗布青素也有效地减少了衰老(和)，我们假设CCN1通过RAC NOX依赖性机制产生ROS。除了较远相关的DUOX1和DUOX2外，小鼠细胞中还有四种NOX亚型(43). CCN1治疗特别升高1号和种族1表达式，但不是其他表达式氮氧化物或赛车亚型或2号辅因子p47凤凰（phox）(). 击倒任何一方1号或种族1通过特异性siRNAs抑制CCN1诱导的ROS()通过细胞增殖和SA-β-Gal染色判断衰老(和). 击倒第4个也在成纤维细胞中表达，没有效果(到). 同样，在活化的PFs中，CCN1诱导ROS积累和衰老，这也需要NOX依赖的ROS生成(和). 这些结果表明CCN1与整合素α结合6β1并通过RAC1-NOX1-ROS轴诱导细胞衰老，导致与SASP相关的抗纤维化基因表达，以抑制纤维化。
CCN1诱导的衰老通过RAC1-Nox1-ROS轴发生。（A） 用CCN1或BSA处理活化的小鼠HSC 2 h，并装载DHC，通过荧光显微镜检测ROS，并显示定量。（B） 在添加CCN1之前，用NAC（2.5 mM）或罗布青素（10μM）预处理HSC 1 h。每日补充NAC或罗布青素，3天后定量SA-β-Gal活性。（C） 用CCN1处理3天的HSC通过qRT-PCR检测指示基因的表达，P（P）< 0.003. （D） siRNA-介导的击倒编号x1（siNox1#1和siNox1#2），第4个（siNox4），以及种族1（siRac1）经RT-PCR证实。使用扰码序列siRNA作为对照。（E至G）用CCN1（2.5μG/ml）处理敲除细胞2 h，并用DHC装载荧光显微镜（E），并在CCN1处理3天后检查相对细胞数（F）和SA-β-Gal阳性细胞百分比（G）。（H） 用CCN1或BSA处理活化的PFs 2小时，并装载DHC用于荧光显微镜。（一） PFs用NAC（2.5 mM）和罗布青素（10μM）预处理1 h，然后添加CCN1。每日补充NAC和罗布青素，3天后定量SA-β-Gal活性。数据以平均值±标准偏差表示。条形=10μm。
测试CCN1是否通过结合α来诱导衰老和限制纤维化6β1
体内，我们利用通讯录1糖尿病/糖尿病敲入小鼠，其中通讯录1基因组位点已被Dm公司等位基因，编码α6β1结合位点(17,38).通讯录1糖尿病/糖尿病慢性CCl小鼠4治疗症状复制通讯录1ΔHep公司与WT小鼠相比，天狼星红染色和羟脯氨酸含量显示，与SA-β-gal阳性衰老细胞减少60%相比，小鼠和持续加重的纤维化(到)，尽管这两种基因型经历了相同程度的肝损伤(). 这些结果表明，CCN1通过其α6β1结合位点体内诱导衰老，限制肝纤维化。
尾静脉注射CCN1可加速肝纤维化的消退。
由于CCN1是一种内源性抗纤维化因子，我们测试了使用纯化CCN1蛋白是否可以促进已建立纤维化动物的纤维化消退。通讯录1糖尿病/糖尿病小鼠注射CCl4连续4周诱导肝纤维化，CCN1蛋白或载体每4天通过尾静脉注射一次，共4次，从最终CCl后4天开始4注入(). 最后一次注射CCN1后2天的肝切片染色显示，CCN1蛋白治疗使纤维化面积比载体治疗的对照组减少了约50%()伴随着羟脯氨酸进一步降低约40%(). CCN1治疗也显著减少第1a1列和倾倒1mRNA水平和增加百万英镑93倍表达，与SASP结果一致(). 这些数据表明，CCN1蛋白的递送加速了肝纤维化的消退，提示在激活CCN1诱导的衰老途径治疗肝纤维化方面具有潜在的治疗价值。
尾静脉输送CCN1蛋白可加速纤维化的消退。（A） CCl的示意图4i.p.注入通讯录1糖尿病/糖尿病小鼠和CCN1尾静脉给药。箭头表示以40μg/只小鼠注射CCN1的点。（B） 在最后一次注射后2天，收集在消退期内注射CCN1或溶媒的小鼠的肝脏，并用天狼星红染色；n个= 7. 棒材=100μm。（C） 肝脏中羟脯氨酸含量定量(n个= 3; *,P（P）< 0.02). 开放式酒吧，用载具或CCl治疗的小鼠4诱导纤维化4周；灰条，CCl治疗小鼠4持续4周，然后用CCN1或载体尾静脉注射18天纤维化缓解。（D） 通过qRT-PCR分析尾静脉注射CCN1或载体后小鼠的肝脏中指示基因的表达。数据以平均值±SD表示；n个= 3.
讨论
本研究最重要的发现是CCl不同形式的肝损伤诱导的肝纤维化4随着纤维原性肌成纤维细胞进入衰老，胆管结扎中毒得到有效抑制，并且在人类肝硬化肝脏中高度积累的基质细胞蛋白CCN1在触发肌成纤维纤维细胞衰老以对抗这些不同病因的纤维化中起着关键作用。CCN1通过整合素α的参与诱导肝肌成纤维细胞衰老6β1通过激活RAC1-NOX1途径激活ROS积累。因此，尽管NOX1诱导的活性氧已被证明可促进HSC活化并刺激肝纤维化(44,45)，它们也可能对纤维化的消退至关重要。初步试验表明，即使在已经建立纤维化的动物中，施用CCN1也可以加速纤维化的消退，这表明激活CCN1诱导的衰老途径可能具有治疗前景。
CCN1是一种血管生成诱导剂，参与皮肤伤口愈合和骨折修复(32,46). 然而，它在肝脏发育、功能和病理中的作用尚不清楚。这里我们表明，虽然肝细胞是肝脏中CCN1的主要来源，但肝细胞特异性消融通讯录1在肝部分切除术后肝再生过程中，对肝脏发育和功能或肝细胞增殖没有明显影响。这些结果首次表明通讯录1肝脏发育或肝细胞增殖不需要。相反，抄送1对急性和慢性肝损伤都有高度诱导作用，肝硬化患者CCN1蛋白水平显著升高(). 尽管CCN1的主要功能是抑制纤维化形成并促进纤维化消退，但慢性持续性肝损伤可能会压倒内源性表达的抗纤维化活性通讯录1尽管CCN1积累水平升高，但仍可能发展为肝硬化。
细胞衰老是一种不可逆的细胞周期阻滞，是对细胞应激（如DNA损伤、氧化应激、癌基因激活、染色质破坏和端粒侵蚀）的反应(47,48). 虽然衰老是一种公认的肿瘤抑制机制，但新的证据表明，它可能在衰老、组织修复甚至恶性肿瘤中发挥作用(12). 尽管之前的报告(11)表明衰老可以限制纤维化，这一新兴概念仅在CCl中进行了测试4-导致肝脏损伤。在这项研究中，我们扩展了这些发现，以表明两种CCl4-和BDL诱导的肝损伤对CCN1诱导的衰老作出反应。衰老的肌成纤维细胞停止增殖并表达抗纤维化基因程序。因此，CCN1通过触发肝肌成纤维细胞的细胞衰老，阻止这些产生ECM的细胞的增殖并将其转化为ECM降解细胞，从而加速纤维化的消退。因此，CCl引起的衰老4-BDL诱导的肝损伤在肝细胞缺失的小鼠中显著减少通讯录1导致纤维化加剧(和).
靶向细胞类型特异性过度表达和缺失的观察抄送1在肝细胞中，CCN1通过调节HSC的衰老而在纤维化中发挥显著作用，PFs表明CCN1以旁分泌方式发挥作用(到). 这种作用模式与CCN1通过与靶细胞表面受体结合而在细胞外发挥作用一致。在这方面，值得注意的是通讯录1糖尿病/糖尿病敲除小鼠，其表达的突变CCN1与整合素受体α结合缺陷6β1，本质上是现象复制通讯录1ΔHep公司小鼠肝纤维化反应(和)表明CCN1的影响主要通过α6β1这些结果强烈表明CCN1的细胞外和旁分泌作用。因此，尽管通过肝组织的免疫组织化学染色可以观察到细胞质CCN1，但这可能代表CCN1分泌效率低下或CCN1的重新分泌。
CCN蛋白家族成员在纤维化中可能发挥相反的作用(14,49). CCN2/CTGF是CCN1的同源物，已被证明是一种纤维化前调节因子，其高表达与包括肝脏在内的许多器官和组织的纤维化有关(50). 因此，监测CCN2水平正在发展成为肾、肺和肝纤维化的潜在诊断工具(14). 在这里，我们发现当CCN1有缺陷而没有增加时，纤维化会加剧通讯录2表达式()表明过度纤维化可以与升高的通讯录2表达式。此外，CCN2水平在通讯录1ΔHep公司和通讯录1糖尿病/糖尿病慢性CCl小鼠4受伤，表明CCN1可能调节通讯录2表达体内.
CCN1通过结合整合素α触发活化HSC和PF中的细胞衰老6β1通过依赖RAC-NOX1的机制生成ROS(和). 高水平的活性氧可能导致DNA损伤反应和p53和p16的激活墨水4/pRb依赖的细胞衰老途径(16,48). 因此，CCN1可能通过活性氧依赖性激活p53和p16来诱导衰老墨水4/肝脏中的pRb途径。对这一概念的支持可以从CCl的观察中找到4-诱导性纤维化在第53页−/−;第16页墨水4/农业研究基金−/−对这种衰老途径有缺陷的小鼠(11).
活性氧在所有细胞类型中产生，对许多细胞功能至关重要(51). 活性氧在肝干细胞中的积累有助于其活化和成纤维反应，目前有几项临床试验正在测试抗氧化剂在逆转肝纤维化中的功效(52). 已发现HSC中表达的NOX1和NOX2在肝纤维化中起关键作用(44,45)和GKT137831，一种NOX1/4抑制剂，抑制HSC中的纤维化反应并减轻小鼠的肝纤维化(53,54). 有趣的是，CCN1在活化的HSC中特异性诱导NOX1亚型及其激活物RAC1，并通过该酶介导衰老(). 因此，尽管NOX1介导的活性氧生成对HSC的纤维化激活和肝纤维化都至关重要，但矛盾的是，通过激活的HSC进入衰老，它对纤维化退行至关重要。这些发现表明，在纤维化治疗中以HSC中ROS生成为靶点可能是最有效的，虽然纤维化正在积极进行，但在消退过程中可能通过肌成纤维细胞衰老阻止纤维化退行。
目前正在开发一系列抗纤维化疗法，包括消除损伤原因、减少炎症、抑制HSC活化和纤维化以及促进HSC凋亡的各种方法(55). CCN1诱导衰老途径作为肝纤维化解决的有效内源性机制的鉴定表明，通过激活CCN1衰老途径，可以提供一种新的治疗模式。通过尾静脉注射CCN1蛋白可加速已建立纤维化小鼠的纤维化消退，这一发现为该方法提供了概念证明(). 探索促使肝肌成纤维细胞衰老的途径，包括传递针对HSC的遗传信息或化学调节物(56)和PFs，可能在开发治疗肝纤维化的新治疗策略方面提供信息。
致谢
我们感谢同事们的有益讨论，感谢Mark A.Magnuson提供pAlb。GH载体。
这项工作得到了美国国立卫生研究院的资助(GM78492公司; 和AR61791型).
参考文献
2Hernandez-Gea V，Friedman SL。2011肝纤维化的发病机制.每年。《病理学评论》。
6:425–456 [公共医学][谷歌学者] 三。Gurtner GC、Werner S、Barrandon Y、Longaker MT。2008伤口修复和再生.自然
453:314–321 [公共医学][谷歌学者] 4Iwaisako K、Brenner DA、Kisseleva T。2012肝纤维化有什么新进展？肝纤维化中肌成纤维细胞的起源.《肠胃病学杂志》。肝素。
27(补充2):65–68[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 5.Baertschiger RM、Serre-Beinier V、Morel P、Bosco D、Peyrou M、Clement S、Sgroi A、Kaelin A、Buhler LH、Gonelle-Gispert C。2009人多潜能间充质干细胞在损伤肝脏中的成纤维潜能.公共科学图书馆一号
4：e6657。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 7.东山R、莫罗T、中尾岛S、三井K、福满彻H、上田Y、池田K、阿达奇E、布格哈里奥斯G、冈崎I、稻崎Y。2009骨髓源性细胞在小鼠肝纤维化过程中对胶原蛋白生成的贡献可以忽略.胃肠病学
137:1459–1466 [公共医学][谷歌学者] 8Taura K、Miura K，Iwaisako K、Osterreicher CH、Kodama Y、Penz-Osterriecher M、Brenner DA。2010小鼠肝纤维化中肝细胞不经历上皮-间充质转化.肝病学
51:1027–1036[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 9Kisseleva T、Cong M、Paik Y、Scholten D、Jiang C、Benner C、Iwaisako K、Moore-Morris T、Scott B、Tsukamoto H、Evans SM、Dillmann W、Glass CK、Brenner DA。2012肝纤维化消退过程中肌成纤维细胞恢复为非活性表型.程序。国家。阿卡德。科学。美国。
109:9448–9453[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 10Troeger JS、Mederacke I、Gwak GY、Dapito DH、Mu X、Hsu CC、Pradere JP、Friedman RA、Schwabe RF。2012小鼠肝纤维化消退过程中肝星状细胞的失活.胃肠病学
143:1073–1083[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 11Krizhanovsky V、Yon M、Dickins RA、Hearn S、Simon J、Miething C、Yee H、Zender L、Lowe SW。2008活化星状细胞的衰老限制肝纤维化.单元格
134:657–667[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 12Rodier F，Campisi J。2011细胞衰老的四个方面.《细胞生物学杂志》。
192:547–556[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 13Coppe JP、Desprez PY、Krtolica A、Campisi J。2010衰老相关的分泌表型：肿瘤抑制的阴暗面.每年。《病理学评论》。
5:99–118[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 14Jun JI，Lau LF（刘俊杰）。2011针对细胞外基质：CCN蛋白作为新的治疗靶点.Nat.Rev.药物发现。
10:945–963[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 15Lau LF（左前）。2011CCN1/CYR61：现代基质细胞蛋白的模型.单元格。分子生命科学。
68:3149–3163[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 16Jun J-I，Lau LF。2010基质细胞蛋白CCN1诱导成纤维细胞衰老并限制皮肤伤口愈合中的纤维化.自然细胞生物学。
12:676–685[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 17Chen C-C、Young JL、Monzon RI、Chen N、Todorovic V、Lau LF。2007TNFα的细胞毒性受整合素介导的基质信号调节.EMBO J。
26:1257–1267[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 18Postic C、Shiota M、Niswender KD、Jetton TL、Chen Y、Moates JM、Shelton KD、Lindner J、Cherrington AD、Magnuson MA。1999葡萄糖激酶在葡萄糖稳态中的双重作用由Cre重组酶敲除的肝和胰腺β细胞特异性基因决定.生物学杂志。化学。
274:305–315 [公共医学][谷歌学者] 19Postic C，马萨诸塞州马格努森。2000白蛋白核心转基因在肝脏中的DNA切除随着年龄的增长而进行.起源
26:149–150 [公共医学][谷歌学者] 20Constandinou C、Henderson N、Iredale JP。2005啮齿动物肝纤维化模型.方法摩尔医学。
117:237–250 [公共医学][谷歌学者] 21Kountouras J，Billing BH，Scheuer PJ。1984长时间胆管梗阻：大鼠肝硬化的新实验模型.英国实验病理学杂志。
65:305–311[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 22.Kireeva ML、Mo Yang F-EGP、Lau LF。1996Cyr61是生长因子诱导的即刻早期基因的产物，可促进细胞增殖、迁移和粘附.分子细胞。生物。
16:1326–1334[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 23Liu F、Song Y、Liu D。1999通过全身注射质粒DNA在动物体内基于流体动力学的转染.基因疗法。
6:1258–1266 [公共医学][谷歌学者] 24米切尔·C、威伦伯林·H。2008一种可重复且耐受良好的小鼠2/3部分肝切除方法.《国家协议》。
三:1167–1170 [公共医学][谷歌学者] 25.Mathijs K、Kienhuis AS、Brauers KJ、Jennen DG、Lahoz A、Kleinjans JC、van Delft JH。2009沙地鼠原代肝细胞代谢能力的评估.药物Metab。处置。
37:1305–1311 [公共医学][谷歌学者] 26Weikilchen R，Gressner AM。2005肝星状细胞的分离培养.方法摩尔医学。
117:99–113 [公共医学][谷歌学者] 27Li Z、Dranoff JA、Chan EP、Uemura M、Sevigny J、Wells RG。2007转化生长因子-β和基质硬度调节培养中的门静脉成纤维细胞活化.肝病学
46:1246–1256 [公共医学][谷歌学者] 28.Debacq-Chainiaux F，Erusalimsky JD，Campisi J，Toussaint O。2009检测衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-betagal）活性的协议，该酶是培养和体内衰老细胞的生物标记物.《国家协议》。
4:1798–1806 [公共医学][谷歌学者] 29加利福尼亚州爱德华兹，O'Brien J。1980组织水解物中羟脯氨酸测定方法的改进.临床。蜂鸣器。学报
104:161–167 [公共医学][谷歌学者] 30Juric V、Chen CC、Lau LF。2009细胞外基质蛋白CCN1（CYR61）在体内外调节Fas介导的凋亡.分子细胞。生物。
29:3266–3279[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 31Chen C-C、Mo F-E、Lau LF。2001血管生成诱导剂Cyr61诱导人类皮肤成纤维细胞伤口愈合的遗传程序.生物学杂志。化学。
276:47329–47337 [公共医学][谷歌学者] 32Athanasopoulos AN、Schneider D、Keiper T、Alt V、Pendurthi UR、Liegibel UM、Sommer U、Nawroth PP、Kasperk C、Chavakis T。2007血管内皮生长因子（VEGF）诱导成骨细胞CCN1上调介导内皮细胞促血管生成活性并促进骨折愈合.生物学杂志。化学。
282:26746–26753[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 33Mo FE、Muntean AG、Chen CC、Stolz DB、Watkins SC、Lau LF。2002CYR61（CCN1）对胎盘发育和血管完整性至关重要.分子细胞。生物。
22:8709–8720[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 34Mo F-E、Lau LF。2006基质细胞蛋白CCN1对心脏发育至关重要.循环。物件。
99:961–969[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 35格雷斯纳OA，格雷斯纳AM。2008结缔组织生长因子：纤维化肝病中的纤维化主开关.肝脏Int。
28:1065–1079 [公共医学][谷歌学者] 36黄G，Brigstock博士。2012结缔组织生长因子对肝星状细胞的调节.前面。Biosci公司。
17:2495–2507 [公共医学][谷歌学者] 37Elsharkawy AM、Oakley F、Mann DA。2005肝星状细胞凋亡在逆转肝纤维化中的作用及其调控.细胞凋亡
10:927–939 [公共医学][谷歌学者] 38Chen N，Chen CC，Lau LF。2000整合素α6β1和细胞表面硫酸乙酰肝素蛋白聚糖介导人皮肤成纤维细胞与Cyr61的粘附.生物学杂志。化学。
275:24953–24961 [公共医学][谷歌学者] 39Leu S-J、Chen N、Chen C-C、Todorovic V、Bai T、Juric V、Liu Y、Yan G、Lam SCT、Lau LF。2004基质细胞蛋白CCN1（CYR61）的靶向突变：整合素α6β1-硫酸乙酰肝素蛋白聚糖辅受体介导的细胞活性的选择性失活.生物学杂志。化学。
279:44177–44187 [公共医学][谷歌学者] 40Leu S-J、Liu Y、Chen N、Chen CC、Lam SC、Lau LF。2003血管生成诱导物CCN1（CYR61）中一个新的整合素α6β1结合位点的鉴定.生物学杂志。化学。
278:33801–33808 [公共医学][谷歌学者] 41Chen C-C、Chen N、Lau LF。2001血管生成因子Cyr61和CTGF在原代人皮肤成纤维细胞中诱导粘附信号.生物学杂志。化学。
276:10443–10452 [公共医学][谷歌学者] 42Cheng G、Diebold BA、Hughes Y、Lambeth JD。2006Nox1依赖性活性氧生成由Rac1调节.生物学杂志。化学。
281:17718–17726 [公共医学][谷歌学者] 43Lambeth JD、Kawahara T、Diebold B。2007Nox和Duox酶活性和表达的调节.自由基。生物医学。
43:319–331[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 44Paik YH、Iwaisako K、Seki E、Inokuchi S、Schnabl B、Osterreicher CH、Kisseleva T、Brenner DA。2011烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NOX）同源物NOX1和NOX2/gp91（phox）介导小鼠肝纤维化.肝病学
53:1730–1741[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 45崔W、松野K、岩田K、易比M、松本M、张J、朱K、胜山M、新泽西州托克、Yabe-Nishimura C。2011NOX1/烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸还原型（NADPH）氧化酶促进星状细胞增殖并加重胆管结扎诱导的肝纤维化.肝病学
54:949–958 [公共医学][谷歌学者] 46Jun JI，Lau LF（刘俊杰）。2010细胞衰老控制伤口愈合中的纤维化.老龄化（纽约州奥尔巴尼市）
2:627–631[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 47.Campisi J，d'Adda di Fagagna F。2007细胞衰老：当好细胞发生坏事情时.自然修订版分子细胞生物学。
8:729–740 [公共医学][谷歌学者] 48Collado M、Blasco MA、Serrano M。2007癌症和衰老中的细胞衰老.单元格
130:223–233 [公共医学][谷歌学者] 49.Yoon PO、Lee MA、Cha H、Jeong MH、Kim J、Jang SP、Choi BY、Jeong-D、Yang DK、Hajjar RJ、Park WJ。2010CCN2和CCN5对心肌肥厚和纤维化发展的拮抗作用.分子细胞杂志。心脏病。
49:294–303 [公共医学][谷歌学者] 50Brigstock博士。2009结缔组织生长因子（CCN2，CTGF）与器官纤维化：转基因动物的经验教训.J.细胞通讯。信号。
4:1–4[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 51Lambeth JD、Krause KH、Clark RA。2008NOX酶作为药物开发的新靶点.塞明。免疫病理学。
30:339–363 [公共医学][谷歌学者] 52De MS，Brenner DA。2008酒精性肝病中的氧化应激：NADPH氧化酶复合物的作用.《肠胃病学杂志》。肝素。
23(补充1)：S98–S103[公共医学][谷歌学者] 53.Jiang JX、Chen X、Serizawa N、Szyndralewiez C、Page P、Schroder K、Brandes RP、Devaraj S、Torok NJ。2012新型NOX4/NOX1抑制剂GKT137831在体内减轻肝纤维化和肝细胞凋亡.自由基。生物医学。
53:289–296[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 54青山T、派克YH、渡边S、莱鲁B、加吉尼F、菲奥拉索-Cartier L、莫兰戈S、海茨F、梅洛C、Szyndralewiez C、P页、布伦纳DA。2012烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶在实验性肝纤维化中的作用：新型潜在治疗药物GKT137831.肝病学
56:2316–2327[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 55Cohen-Naftaly M，Friedman SL。2011慢性肝病患者新型抗纤维化治疗的现状.治疗。高级胃肠病学。
4:391–417[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 56佐藤Y、村濑K、加藤J、小本M、佐藤T、川野Y、Takimoto R、高田K、宫西K、松永T、高山T、Niitsu Y。2008维生素A偶联脂质体介导抗胶原特异性伴侣siRNA治疗肝硬化.自然生物技术。
26:431–442 [公共医学][谷歌学者] 
