血浆膜-内质网接触位点调节磷脂酰胆碱合成

摘要

引言

内质网（ER）的结构酿酒酵母在真核生物中有点独特，因为它的网状网络是所有真核细胞的特征，位于质膜（PM）下方。三维电子断层扫描重建单个细胞中酵母总ER[1]发现PM-associated ER（pmaER）由内质网小管和扁平的开窗内质网片组成，与PM的胞质小叶紧密相连。与PM相邻的pmaER区域没有核糖体[1]与ER和PM之间的物理接触点一致[2]. PM–ER接触可能在所有真核细胞中起重要作用[三]在酵母中，pmaER富含脂质合成酶[2]表明PM-ER接触对脂质代谢很重要。具有脂质相关功能的蛋白质家族被发现具体定位于PM–ER接触位点[4,5,6]虽然接触物本身的作用尚未被直接证实，但它们被认为在PM和ER之间的非囊泡脂质转运中发挥作用。最近，人们发现，完整的ER磷脂酰肌醇磷酸磷酸酶Sac1在PM–ER接触物中的定位调节PM中的磷脂酰肌糖4-磷酸（PI4P）水平在trans中[7].在变速器中Sac1的催化作用需要与Osh3相互作用，Osh3是一种定位于PM-ER接触的氧化甾醇结合蛋白家族的可溶性脂质结合蛋白[7]. 与接触物在调节Sac1中的作用一致，pmaER减少的突变体增加了PI4P水平[8].

我们之前发现，在酵母中有两个与ER生物发生有关的基因，SCS2系列和ICE2公司具有加剧的遗传相互作用，以及Δscs2Δice2双突变体降低了pmaER，表明pmaER发挥了细胞生长所需的基本功能[9]. Ice2是一种功能未知的完整ER蛋白，是pmaER遗传所必需的[10]. Scs2是VAP家族中一种高度保守的尾锚定蛋白，它将含有FFAT基序的蛋白质定位于内质网[4]并调节酵母磷脂合成[11]. Scs2通过与这些蛋白质中的FFAT基序相互作用，将氧化甾醇结合蛋白同源物Osh2和Osh3定位到pmaER[4,6]，这是监管在trans中Sac1活性[7].

结果和讨论

为了揭示PM–ER接触位点功能的线索，我们检查了酵母全球遗传相互作用网络[12]这是一个成对遗传相互作用的综合图，其中具有相似功能的基因形成相干簇。我们注意到SCS2系列和ICE2公司属于富含磷脂代谢相关基因的集群(图1A). 其中包括通过肯尼迪途径制造磷脂酰胆碱（PC）所需的基因，肯尼迪途径是一种从脂质前体胆碱、乙醇胺和二酰甘油合成PC和PE的挽救途径(图1B) [13]. 该簇主要表现出与含有两种PEMT酶的簇的遗传相互作用加重，这两种酶由CHO2公司和OPI3（OPI3）通过甲基化途径合成PC(图1A、B). 该簇中还有Ino2–Ino4转录因子，它激活Kennedy和甲基化途径基因的表达[13]，以及冰2进一步表明甲基化途径中的功能。

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图1

Opi3功能在Δ中受损scs2系列Δ冰2细胞。(A类)基因簇包含SCS2系列和ICE2公司揭示了PM-ER接触在磷脂代谢中的潜在作用。基因根据(B). 数据来自Costanzo等[12]. (B)磷脂合成的主要途径酿酒酵母.每个步骤所需的编码酶的基因以斜体显示。(C类)在补充有+Cho或+Etn的SD培养基（−）或SD上生长的所示突变酵母菌株的十倍系列稀释液。(D类)WT和Δscs2Δice2在SD培养基上生长的酵母，用表达Opi3（+pOPI3）的质粒或对照质粒（−）转化。(E类)突变酵母在不含胆碱的SD培养基上生长。(F类)用表达Scs2（+pSCS2）的质粒或对照质粒（−）转化SD培养基上生长的酵母。(G公司)体内PE甲基化分析。对数相酵母脉冲标记[^三H] -Etn和PC合成速率通过测量PE到PC的转化率来确定。误差条，s.e.m.星号，P（P）<0.005与重量(H（H）)从质粒表达Opi3的指示菌株的PE甲基化分析（NS与WT）。(我)在含有1 mM DTT（+DTT）或不含（−）胆碱的SD培养基上生长的酵母。Cho，胆碱；二酰甘油；DTT，二硫苏糖醇；内质网；Etn，乙醇胺；NS，不显著；PA，磷脂酸；PC，磷脂酰胆碱；磷脂酰二甲基乙醇胺；PE，磷脂酰乙醇胺；PM，质膜；磷脂酰单甲基乙醇胺；PS，磷脂酰丝氨酸；SD，合成定义；合成，合成；WT，野生型。

该聚类表明PM–ER接触可能调节PC合成。我们发现胆碱而不是乙醇胺拯救了Δscs2系列Δ冰2慢生长表型(图1C)表明该突变株可能在甲基化途径中存在PC合成缺陷。的过度表达OPI3（OPI3）在Δ中scs2系列Δ冰2突变体修复了其生长缺陷(图1D)，而过度表达CHO2公司没有(补充图S1在线），表明Opi3功能受损。单甲基乙醇胺通过肯尼迪途径转化为磷脂酰单甲基乙醇酰胺（PME），并绕过了对Cho2的需求，但添加该物质并不能挽救Δ的增长scs2系列Δ冰2单元格(补充图S1在线）与突变体中Opi3功能的丧失一致。

Cho2进行第一次PE甲基化，而Opi3主要负责第二次和第三次甲基化(图1B)，虽然Opi3也可以首先甲基化，但速率降低[14]. 由于这种冗余，Δ二氧化氯和Δ鸦片3细胞在缺乏胆碱的培养基上生长不良，但不是专性胆碱营养不良，而Δ二氧化氯Δ阿片3细胞是专性营养缺陷型细胞，通过过表达Opi3而不是Cho2来拯救细胞[14]. 基因簇中观察到Scs2和Cho2之间的遗传交互作用加剧以及Scs2与Opi3之间的交互作用缓解(图1A)建议Scs2可以直接修改Opi3功能。与Scs2调节Opi3一致，我们发现Δscs2系列Δ二氧化氯细胞是专性胆碱营养不良细胞(图1E)Scs2的过度表达挽救了Δ的胆碱营养不良二氧化氯突变体(图1F). 的功能ICE2公司不太清楚；然而，我们确实发现了与PSD1型被乙醇胺解救出来的(补充图S1在线），进一步支持Ice2在基因簇暗示的甲基化途径中的作用。

测量Δ中的Opi3函数scs2系列Δ冰2突变体，我们用脉冲标记细胞[^三H] -乙醇胺，并监测放射性标记PE转化为PC的过程。在野生型和突变型细胞中，至少在分析的前3小时内，标记并入PC的速度呈线性(补充图S1在线）。正如预期的那样，我们发现PC合成速率在Δ二氧化氯突变体控制显著减少(图1G). 与Opi3功能降低一致，PC合成也在Δscs2系列Δ冰2突变体(图1G). Opi3的过度表达使PC合成速率恢复到与野生型相似的水平(图1H;补充图S1在线）。因此，减少了Δ中PC的合成scs2系列Δ冰2突变体可能是其胆碱营养不良的原因。最后，Δ南海2号Δ冰2突变体对二硫苏糖醇敏感(图1I)表明内质网应激增加，也与Opi3功能降低一致[15].

Δ中Opi3功能损失scs2系列Δ冰2突变体表明Opi3在PM–ER接触中发挥作用。使用标记有绿色荧光蛋白（GFP）的内源性I型完整ER蛋白Pho88，我们验证了我们之前的发现，Δscs2系列Δ冰2细胞具有正常的内质网小管和核内质网，但在细胞皮层内质网显著减少(图2A). 为了描述PM–ER接触的特征，我们使用了一种特殊的标记物，它是一种完整的ER膜蛋白，通过直接与PM相互作用定位于PM–ER的接触[5]. 如前所述，Tcb3-GFP仅定位于细胞皮层的pmaER结构域，而不定位于核ER或ER小管(图2B). 与三维电子断层扫描一致，显示pmaER在芽和母细胞中形成不同的结构域，并且在芽颈中不存在[1]Tcb3-GFP在颈部不连续，在整个细胞周期中定位于pmaER(图2C). 在Δ中scs2系列Δ冰2突变体Tcb3-GFP定位明显被破坏。pmaER缺陷在中小芽中很明显，其中Tcb3-GFP常常不能定位于芽的外围，而是定位于芽中心附近的内质网小管(图2D). 在母亲身上，Tcb3-GFP也定位于核ER。

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图2

PM–ER触点调节Opi3。(A类)表达内源性Pho88-GFP的酵母细胞图像。箭头表示核ER，箭头表示pmaER，星号表示不存在pmaER。(B)表达来自质粒的内源性Tcb3-GFP（绿色）和RFP-ER（红色）的酵母。标签如中所示(A类). (C类,D类)表达Tcb3-GFP的酵母在整个细胞周期中都处于阶段性。双箭头表示Tcb3-GFP在ER小管中定位错误，星号表示没有pmaER，否则标签如(A类). (E类)表达内源性Opi3-GFP的酵母。星号表示空泡，否则标签如(A类). 所有比例尺，2μm。(F类)WT和Δ的增长scs2系列Δ冰2在不存在（−）或存在（+Cho）胆碱的情况下，从含有半乳糖的SD培养基上生长的质粒中过表达Osh蛋白的酵母。(G公司)质粒中表达Osh3的指示菌株的PE甲基化分析。误差线，s.e.m(H（H）)WT和Δ的生长分析二氧化氯在不含胆碱的含有半乳糖的SD培养基上生长的质粒中过度表达Osh3的突变酵母。内质网；绿色荧光蛋白；NS，不显著；PC，磷脂酰胆碱；PE，磷脂酰乙醇胺；PM，质膜；pmaER，PM-associated ER；SD，合成定义；合成，合成；WT，野生型。

现在，我们检测了带有GFP标记的内源性Opi3酶的定位，该酶具有功能性(补充图S2在线）。在野生型细胞中，Opi3-GFP定位于整个内质网(图2E). 我们在液泡中观察到一些额外的弥散染色，这可能是Opi3-GFP转换的结果。在Δ中scs2系列Δ冰2突变体，Opi3-GFP在核内质网的定位保持完整；然而，pmaER中几乎完全没有(图2E). 核ER中Opi3-GFP的定量显示其表达水平没有变化(补充图S2在线），表明Opi3功能的丧失可能是由突变株中pmaER的缺陷引起的。与此一致，Opi3过度表达似乎并没有拯救pmaER(补充图S2在线）。

Scs2将Osh2和Osh3定位到PM–ER触点[4]我们测试了它们在调节Opi3中的作用。Osh2的过度表达部分恢复了Δ的生长scs2系列Δ冰2突变体，而Osh3完全被拯救(图2F). 相反，Osh1被Scs2定位于核-空泡交界处[4]没有拯救，事实上阻碍了增长(图2F). Osh3过表达恢复了Δscs2系列Δ冰2突变体(图2G)与突变体生长的拯救一致。然而，Osh3没有在Δ中拯救pmaERscs2系列Δ冰2单元格(补充图S2但它确实恢复了Δcho2突变体(图2H)表明Osh3调节了接触点的Opi3功能。

我们现在利用Δ的胆碱营养不良表型scs2系列Δ冰2筛选突变株，以确定PM–ER接触结构的调节器。我们鉴定了一个携带PAH1型基因(图3A)，编码脂类家族中一种高度保守的磷脂酸磷酸酶，在肯尼迪途径中催化磷脂酸转化为二酰甘油(图1B) [16]. 令人惊讶的是，Pah1，D398E的一个无催化活性突变体[17]还挽救了Δ的胆碱营养不良scs2系列Δ冰2突变体(图3B)反对通过肯尼迪途径进行救援。与此一致，Pah1仍然救出了一个Δscs2系列Δ冰2Δpct1具有失活Kennedy通路的三重突变体(图3C). 在Δ南海2号Δ冰2突变体(图3D;补充图S3在线），表明Pah1拯救了Opi3功能。然而，它并没有拯救Δ二氧化氯突变体(补充图S3在线），表明Pah1没有直接调节Opi3。

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图3

Pah1调节PM–ER触点。(A类,C类)连续稀释(A类) Δscs2系列Δ冰2和(C类) Δscs2系列Δ冰2Δpct1在含有葡萄糖（Dex）或半乳糖（Gal）的SD培养基上，酵母在半乳糖启动子（+pGST–Pah1）控制下从质粒过度表达GST–Pah1。(B)从缺乏胆碱的SD培养基上生长的质粒中表达HA–Pah1或无催化活性的D398E突变的酵母。(D类)野生型和Δ的Opi3甲基化检测scs2系列Δ冰2细胞过度表达GST–Pah1。(E类)Δ中Tcb3-GFP的图像scs2系列Δ冰2酵母过度表达GST–Pah1。比例尺，2μm。(F类)超微结构分析示意图和说明PM–ER接触的典型透射电子显微镜图像（箭头）。(G公司)PM–ER触点与PM周长的比率**P（P）<10⁻⁴与WT相比*P（P）<0.001与WT##P（P）<0.01与Δscs2系列Δ冰2, #P（P）<0.05与Δ南海2号Δ冰2. (H（H）)PM–ER触点长度*P（P）<0.005（相对于WT）#P（P）<0.005与Δscs2系列Δ冰2. (我)PM–ER触点的频率**P（P）<0.005（相对于WT）*P（P）与WT相比<0.05##P（P）<0.005与Δscs2系列Δ冰2; #P（P）<0.05与Δscs2系列Δ冰2误差棒，s.e.m.ER，内质网；绿色荧光蛋白；NS，不显著；PM，质膜；SD，合成定义；合成，合成；WT，野生型。

这些结果表明，Pah1可能在Δscs2系列Δ冰2突变体。与Opi3和Osh3相比，GST–Pah1的过度表达似乎恢复了Tcb3-GFP定位到pmaER(图3E)，Pah1也将Opi3-GFP恢复到pmaER(补充图S3在线）。因此，我们使用透射电子显微镜对PM–ER触点进行了超微结构分析。我们量化了ER段长度、频率以及PM–ER接触者与PM周长的总比率(图3F;补充图S4在线）。在Δ中scs2系列Δ冰2突变体，我们发现芽中的接触减少到约7%，母亲中的接触减少到约13%，而野生型的接触减少到约25%(图3G). 在芽中，这种减少是由于接触部位长度的减少(图3H)和频率(图3I). 在母亲中，由于接触部位长度不受影响，减少的只是频率的降低。

Δ中Pah1和D398E Pah1的过度表达scs2系列Δ冰2突变体使芽和母体的接触恢复到接近野生型水平(图3G). 芽中接触长度和频率增加导致救援(图3H，I)表明Pah1挽救了芽中pmaER形成的缺陷。在野生型细胞中，由于频率增加，Pah1的接触增加到细胞外围的约40%，支持Pah1在启动接触中的生理作用。最后，Pah1挽救了Δ的二硫苏糖醇敏感性scs2系列Δ冰2突变体，不需要激活未折叠蛋白反应(补充图S3进一步支持了Pah1通过一种独立于一般应激反应途径激活的机制直接修复了PM–ER接触中的缺陷。

我们的结果表明，PM–ER接触为酵母PEMT酶Opi3调节PC合成提供了空间机制。接触时Opi3活性改变的结果可能是PM稳定性改变，正如在Pemt的肝脏中发现的那样^−/−小鼠，其PM中的PE:PC增加[18]. PM中PE:PC增加的酵母突变体对非离子洗涤剂敏感，这会破坏双层的稳定性[19]. 我们发现Δ柠檬3/玫瑰3由于PE翻转酶活性降低而在PM中积聚PE的细胞[20,21]，对NP-40敏感(图4A). 我们还发现Δ鸦片3增加PME的细胞[22]，对NP-40敏感(图4B)表明PME在PM中积累Δscs2Δice2突变体同样对NP-40敏感，被Opi3抑制(图4C). 重要的是，D398E Pah1也被抑制，这与拯救PM–ER接触和Pah1重建Opi3功能一致(图4D). Osh3的缺失也导致了NP-40的敏感性，进一步支持了其在接触处调节Opi3的作用(图4E). Osh3的这一功能与其在调节PM中PI4P水平中的作用无关[7]，因为Δsac1公司细胞对NP-40不敏感(图4E). NP-40敏感性不是由于PE翻转酶活性降低，因为Δscs2系列Δ冰2细胞对肉桂霉素（Ro09-0198）不敏感，肉桂霉素结合位于PM外叶的PE并裂解细胞[20,21]，而Δ柠檬3/玫瑰3细胞高度敏感(图4F).

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图4

PM–ER触点影响PM稳定性在trans中. (A–E)在含有胆碱的SD培养基上，在没有（−）或存在0.1%NP-40（+NP-40）的情况下进行酵母生长分析。(F类)在含有胆碱的SD培养基上，在没有（−）或存在辛纳霉素（+）的情况下进行酵母生长分析。(G公司)的示意图体外反甲基化分析。Opi3拓扑以哺乳动物PEMT为基础，方框表示包含催化位点的区域[25]. (H（H）)混合前和混合后120分钟分发标签。(我)混合120分钟后，标签在脂质体部分的分布。误差棒，s.d.ER，内质网；PC，磷脂酰胆碱；磷脂酰二甲基乙醇胺；PM，质膜；磷脂酰单甲基乙醇胺；SD，合成定义；WT，野生型。

之前的工作表明Opi3可以发挥作用在trans中催化位于并列膜中的PME甲基化[23]. 因此，PM–ER联系人的角色可能是为以下人员提供Opi3访问PM中的PE/PME在trans中甲基化。我们使用体外化验。我们将含有氚化PME的脂质体与含有Opi3的ER微粒体孵育，并监测PC的合成(图4G). 脂质体和微粒体的混合导致约35%的PME转化为磷脂酰二甲基乙醇胺（PDE）和PC(图4H). 回收含有最多放射性标记的脂质体部分(补充图S5在线），揭示了类似的脂质分布，约30%的PME转化为PDE和PC(图4I). 因此，PDE和PC在脂质体部分的积累与在trans中Opi3活动。我们没有发现Δ中NBD–PE/PC的内吞或摄取缺陷scs2系列Δ冰2突变体(补充图S5在线），表明PM和ER之间的脂质转运可能没有受到干扰，进一步支持Opi3的功能在trans中在联系人处。

我们建议PM–ER接触通过提供其脂质底物来调节Opi3的活性在trans中并限制Opi3在触点处接触Osh3。类似于其在Sac1监管中的拟议作用[7]，Osh3可能会在PM–ER触点的PM至Opi3中出现PME或PE。在变速器中Opi3甲基化可能使细胞快速调整PM的PME/PE:PC比率，从而影响双层的物理性质。在变速器中Opi3甲基化需要PME存在于PM中。酵母细胞器亚细胞组分的脂质体分析在高尔基体中鉴定出PME，但在任何其他隔室中都没有，包括内质网微粒体和PM[24]. 这表明PME是分泌途径的一个组成部分，并被转运到PM，在那里它迅速转化为PC。最后，所有真核PEMT的活性位点都位于ER膜的细胞质表面，PM可以接近[25] (图4G)和原核PEMT是缺乏跨膜结构域的可溶性酶[26]并且必须根据其性质与PM联系在trans中因此，PM–ER接触可能通过提供位于ER中的PEMT酶来调节PC合成在trans中在下午。

方法

质粒酵母菌株和生长条件。本研究中使用的质粒和酵母菌株的详细信息可以在补充信息在线。所有酵母菌株均基于S288C，并在30°C的合成定义（SD）培养基上进行24–48小时的生长分析。

基于阵列的全基因组抑制筛选。通过采用合成基因阵列方法将来自酵母GST–ORF集合（Open Biosystems）的每个质粒导入到Δscs2Δice2在缺乏胆碱的培养基上对生长进行应变和评分。

共焦显微镜。表达GFP标记蛋白的酵母菌株生长到对数相，并使用配备蔡司×100物镜（Plan-neofluar，1.3）的蔡司LSM-5 Pascal共焦显微镜系统进行成像，方法是在载玻片和盖玻片之间的培养基中压榨1–5μl活酵母。

PM–ER触点的透射电子显微镜。对于薄片电子显微镜，细胞被制备并在日立H7600透射电子显微镜上成像。每个条件下至少分析15个芽细胞。

体内甲基化测定。简言之，收集对数期细胞，并与24μCi的[^三H] -乙醇胺在37°C下放置1 H，在30°C下洗涤并摇晃指定时间，然后提取总脂质并通过高效液相色谱法进行分析。

体外操作3反式甲基化试验。简而言之，从野生型菌株中分离出含有Opi3的微粒体，并从Δ鸦片3用[3-H]蛋氨酸标记的菌株，微粒体与[^三H] -PME负载的脂质体在30°C下持续2小时。在20%（w/v）蔗糖缓冲液上通过离心将脂质体与微粒体分离之前或之后提取脂质[^三H] -甲基-PME在薄层色谱后定量。

补充信息EMBO提供报告联机(http://www.emboreports.org).

补充材料

致谢

脚注

工具书类