烟酰胺核苷酸转氢酶（NNT）辅助因子平衡在三羧酸（TCA）循环中协调还原羧基化和葡萄糖分解代谢^*♦

摘要

介绍

癌症和增殖细胞在很大程度上依赖糖酵解，但也会转换为谷氨酰胺-维护的三羧酸（TCA）²以满足加速增长和扩散的需要(1–三). 这种代谢重编程最大限度地利用葡萄糖进行葡萄糖特异性合成代谢过程，同时确保嘧啶、蛋白质和脂质合成的功能性TCA循环(4,5). 在此背景下，阐明协调葡萄糖和谷氨酰胺利用的信号通路和变构机制是确定癌细胞代谢依赖性的关键。最近癌症生物学方面的研究阐明了转录因子、致癌基因和环境信号如何不仅调节葡萄糖和谷氨酰胺的摄取，而且决定其细胞内命运(6–9). Myc是胶质瘤细胞中谷氨酸分解的致癌激活物(6)，而葡萄糖衍生的通过丙酮酸羧化酶的再修复是谷氨酰胺非依赖性生长所必需的(10). 此外，葡萄糖摄取和谷氨酰胺摄取通过己糖胺生物合成途径耦合(11)和Mondo A转录激活(12). 此外，肿瘤微环境中经常发生缺氧，已知低氧诱导因子（HIF）的稳定通过糖酵解酶、PKM2、乳酸脱氢酶A和PDK-1的反激活将葡萄糖转化为乳酸(13–16). 此外，最近研究表明，缺氧可通过异柠檬酸脱氢酶1（IDH1）和2（IDH2）同时激活α-酮戊二酸的还原羧基化（RC），以支持柠檬酸盐的生成(7,17–19)通过NADPH提供氢化物离子（H⁻)将α-酮戊二酸还原为异柠檬酸(20–22). 直到最近，缺氧促进RC的机制还存在争议。我们表明，低氧诱导因子（HIFs）通过调节柠檬酸盐水平来促进RC是必要且充分的(46). 然而，HIF的表达并没有增加NADPH的水平，而且IDH酶反向反应的这种辅因子的来源尚未被研究。

人们认识到，TCA循环本质上是一种氧依赖性途径，氧化代谢中间产物生成NADH，NADH是ATP生成所必需的还原当量。因此，线粒体NADH/NAD⁺该比率是TCA循环活性的变构调节因子，通过偶联到氧化磷酸化(23)但从碳通量分布的角度来看，它在TCA循环中协调葡萄糖和谷氨酰胺进入的作用尚不清楚。考虑到细胞增殖需要一个功能性TCA循环，NADH/NAD的转移可能⁺氧化或还原状态可能会对TCA循环中葡萄糖和谷氨酰胺的利用产生不同的影响。

位于线粒体内膜的烟酰胺核苷酸转氢酶（NNT）对氢离子当量（H）的转移进行催化⁻)使用质子梯度（xH）从NADH到NADPH⁺ _外面的→ x小时⁺ _在里面)如下所示：NADH+NADP⁺+x小时⁺_（退出）↔北美⁺+NADPH+xH⁺_（英寸）NNT被认为是线粒体和还原型谷胱甘肽中NADPH的主要来源(24–26). 因此，可以想象NNT活性会产生线粒体中RC反应所需的NADPH，这是以前推测过的假设(27)，但从未进行过实验测试。此外，考虑到与NADH/NAD的连接⁺平衡时，NNT也可能在TCA循环中协调葡萄糖和谷氨酰胺的分解代谢。这里，使用¹³碳同位素示踪剂，我们阐明了NNT在中枢碳代谢中的作用，特别是其对RC的贡献和葡萄糖分解代谢的调节。

实验程序

结果

敲除NNT降低谷氨酰胺对TCA循环的贡献

我们假设线粒体NAD（P）H/NAD（P）的紊乱⁺NNT敲除导致的平衡将影响TCA循环中葡萄糖和谷氨酰胺的利用。为了研究NNT在中枢碳代谢中的作用，我们去掉了它的翻译并使用不同的[¹³C] 葡萄糖和[¹³C] 谷氨酰胺同位素示踪剂，通过GC-MS分析确定TCA循环代谢物的富集。我们用含有NNT靶向shRNA序列的慢病毒感染SkMel5黑色素瘤细胞系，并产生NNT敲除多克隆细胞群(图1一). 根据NCI-60小组（dtp.NCI.nih.gov/mtargets/mt_search.html），SkMel5细胞系在RNA水平上高表达NNT，以及其他黑色素瘤、白血病和一些肾细胞癌细胞。为了追踪谷氨酰胺对TCA循环的贡献，我们在[U-¹³C类₅]谷氨酰胺示踪剂。敲除NNT降低了谷氨酰胺氧化对TCA循环的贡献，这由TCA循环代谢物的M4富集水平决定(图1B类). 我们观察到，与感染干扰载体shRNA的对照细胞相比，NNT击倒的SkMel5细胞中柠檬酸M5、富马酸M3、苹果酸M3和天冬氨酸M3的富集也显著降低(图1C类)这表明还原羧基化对TCA循环的贡献降低。我们还通过用[1-¹³C类₁]谷氨酰胺示踪剂，专门转移¹³C标记碳仅通过RC进入TCA循环代谢物。敲除NNT可降低SkMel5细胞中M1-TCA循环代谢物的百分比(图1D类). 我们观察到，在NNT敲低的SkMel5细胞中，谷氨酰胺的再补作用也减少了(图1E类)这表明α-酮戊二酸/谷氨酸的生成在底物偏好上发生了转变（从谷氨酰胺到葡萄糖）。然而，当解释谷氨酰胺的补体作用时，我们观察到NNT敲除条件下SkMel5细胞中RC的特异性抑制(图1F类). 我们还测试了NNT在一个VHL（甚高频）-严重依赖这种还原途径的肾癌细胞系缺陷(7). 为此，我们击倒了NNTVHL（甚高频）-786-O细胞缺陷(图1G公司)并在[1-¹³C类₁]谷氨酰胺。与Sk-Mel5细胞相比，受扰载体感染的786O细胞表现出较高的RC活性(图1H（H）). 敲除NNT降低柠檬酸M1的富集(图1H（H）)而它仅轻微影响786-O细胞中谷氨酰胺衍生的修复(图1我)通过比较α-酮戊二酸和谷氨酸之间的M1富集度确定。NNT敲除后回复反应的差异可能是由于NAD（P）对谷氨酸脱氢酶的特异变构作用所致（见“讨论”）。有趣的是，我们没有观察到富马酸、苹果酸和天冬氨酸的M1富集变化，这些物质是细胞溶质中形成的IDH2反应的下游代谢物。因此，我们不能排除细胞溶质IDH1反应在细胞中的代偿作用，这些细胞在很大程度上依赖于此途径，并且可能需要持续供应NADPH。综上所述，这些数据表明，NNT严格参与辅因子平衡，有助于线粒体中谷氨酰胺氧化和还原羧基化。

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图1。

NNT敲除对谷氨酰胺分解代谢的影响。 一，在SkMel5细胞中验证NNT敲除。B–F类，NNT敲除对SkMel5细胞谷氨酰胺代谢的影响。B类和C类，谷氨酰胺氧化的贡献(B类)和还原羧基化(C类)至TCA循环，从[U-¹³C类₅]谷氨酰胺。Scr控制、扰码控制；成功，琥珀酸；福姆，富马酸；马尔苹果酸；天冬氨酸，天冬氨酸；Cit公司柠檬酸盐。D类，还原羧基化对TCA循环的贡献，使用[1-¹³C类₁]谷氨酰胺示踪剂。E类谷氨酰胺补体对α-酮戊二酸的贡献(阿克格)形成。F类，SkMel5细胞板中还原羧基化的归一化贡献，来自[U-¹³C类₅]谷氨酰胺。G公司，在786-O细胞中验证NNT敲除。H（H），还原羧基化对NNT击倒786-O细胞中TCA循环的贡献。我谷氨酰胺补体对α-酮戊二酸的贡献(阿克格)786-O细胞形成。

敲除NNT刺激TCA循环中的葡萄糖分解代谢

为了研究NNT在葡萄糖代谢中的作用，我们用[U-¹³C类₆]并通过GC-MS分析确定其对TCA循环代谢物形成的贡献。[U-¹³C类₆]葡萄糖示踪剂转移二 ¹³C单位通过丙酮酸脱氢酶到TCA循环代谢物，而丙酮酸羧化酶（PC）活性包括三 ¹³草酰乙酸中的C原子，然后传播到其他TCA循环代谢物。因此，TCA循环代谢物的M3质量同位素与PC活性相关，而M5柠檬酸盐、M4α-酮戊二酸盐和M4谷氨酸盐反映了葡萄糖碳通过丙酮酸脱氢酶和PC的总体贡献。尽管NNT的敲除降低了SkMel5细胞中谷氨酰胺的氧化，它同时激活了TCA循环中的葡萄糖分解代谢，从[U-¹³C类₆]葡萄糖(图2,一和B类)表明NNT的敲除将底物偏好转换为葡萄糖衍生的TCA循环。我们没有观察到这些代谢物的M2同位素的变化，这表明在NNT敲除条件下丙酮酸脱氢酶的特定贡献（相对于PC-衍生无补体）没有显著影响（数据未显示）。由于M3质量同位素也可以通过持续的TCA循环形成，我们用[3-¹³C类₁]葡萄糖追踪葡萄糖衍生回补对TCA循环的特定贡献，在TCA循环中，丙酮酸中的标记碳通过PC保留在草酰乙酸中或以CO形式丢失₂通过丙酮酸脱氢酶。NNT击倒SkMel5刺激了PC活性(图2C类). 值得注意的是，NNT敲除细胞中TCA循环代谢物的M1富集度的增加不如[U-¹³C类₆]葡萄糖。因为来自[3]的M1草酰乙酸盐（单碳形式）-¹³C类₁]葡萄糖生成柠檬酸M1（六碳形式）¹³C标签在氧化TCA循环期间部分丢失，可能稀释了PC-衍生的传播¹³后续TCA循环期间的C标签。在786-O细胞中也获得了类似的结果(图2,D类和E类)尽管效果不如在SkMel5细胞中观察到的明显。这些观察结果支持我们使用[U-¹³C类₅]谷氨酰胺，这表明谷氨酰胺氧化在SkMel5细胞中降低，但在NNT敲除后786-O细胞中没有显著影响。

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图2。

NNT敲除对葡萄糖分解代谢的影响。 一和B类，葡萄糖氧化对SkMel5细胞板中TCA循环的贡献，通过M3的富集测定(一)和M4/M5(B类)TCA循环代谢物，来自[U-¹³C类₆]葡萄糖。Scr控制、扰码控制；成功，琥珀酸；福姆，富马酸；阿克格，α-酮戊二酸；马尔苹果酸；天冬氨酸，天冬氨酸；Cit公司柠檬酸盐。C类，丙酮酸羧化酶对NNT敲除和控制SkMel5细胞中TCA循环代谢物形成的特定贡献，使用[3-¹³C类₁]葡萄糖示踪剂。D类和E类，葡萄糖氧化对786-O细胞板中TCA循环的贡献，来自[U-¹³C类₆]葡萄糖(D类)和[3-¹³C类₁]葡萄糖(E类).

NNT在TCA循环中足以刺激RC和抑制葡萄糖分解代谢

由于NNT的敲除影响TCA循环中葡萄糖和谷氨酰胺的利用，我们研究了NNT的过度表达是否足以诱导互补代谢反应，特别是在还原羧基化（RC）的作用中。为此，我们用NNT编码cDNA质粒稳定地转染了SkMel5细胞，并生成了一个多克隆细胞群，与它们的扰码载体对应物相比，该细胞群过度表达NNT（Ex-NNT）(图3一). 过表达NNT模拟谷氨酰胺氧化的作用(图3B类)和RC(图3,C类和D类)TCA循环。相反，与打乱载体细胞相比，NNT过度表达细胞中PC-衍生的修复受到抑制(图3,E类和F类). 这些数据表明，NNT足以协调TCA循环中谷氨酰胺和葡萄糖的利用。

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图3。

SkMel5细胞中NNT过度表达的代谢效应。 一、SkMel5细胞组中的NNT蛋白水平（Ex-NNT，车道4).B–D类，NNT过度表达对谷氨酰胺分解代谢的影响。B类和C类，谷氨酰胺氧化的贡献(B类)和还原羧基化(C类)来自[U-¹³C类₅]谷氨酰胺。Scr控制、扰码控制；成功，琥珀酸；福姆，富马酸；马尔苹果酸；天冬氨酸，天冬氨酸；Cit公司柠檬酸盐。D类，NNT过度表达对还原羧基化的影响，使用[1-¹³C类₁]谷氨酰胺示踪剂。E类和F类，葡萄糖氧化对SkMel5细胞中TCA循环的贡献，来自[U-¹³C类₆]葡萄糖(E类)和[3-¹³C类₁]葡萄糖(F类).阿克格，α-酮戊二酸。

敲除NNT降低细胞增殖并使SkMel5黑色素瘤细胞对葡萄糖剥夺敏感

由于NNT的敲除将TCA循环中的底物偏好从谷氨酰胺转换为葡萄糖碳，我们假设NNT敲除细胞的增殖将更加依赖葡萄糖。为了验证这一点，我们首先测量了72小时内SkMel5细胞的葡萄糖摄取和乳酸分泌率。与对照细胞相比，NNT敲除的SkMel 5细胞表现出更高的葡萄糖摄取量和乳酸分泌量(图4一). 与对照细胞相比，NNT敲除细胞的葡萄糖净摄入量也较高(图4B类)与TCA循环燃料对葡萄糖碳的总体较高需求相一致。我们在SkMel5细胞组中未观察到谷氨酰胺消耗量和谷氨酸生成率的显著差异（数据未显示）。接下来，为了利用对葡萄糖碳的依赖性，我们将SkMel5细胞系培养在低葡萄糖培养基中24小时。NNT敲除细胞的活性丧失更为明显，NNT过度表达细胞对低葡萄糖浓度几乎不敏感(图4C类). 相反，在低谷氨酰胺含量的培养基中培养时，NNT过表达细胞对谷氨酰胺缺乏更敏感(图4D类). 我们还观察到，与对照细胞相比，NNT敲低的SkMel5细胞增殖降低(图4E类)，通过敲除NNT部分抑制在nu/nu小鼠中作为异种移植瘤生长的SkMel5细胞的生长(图4F类). 与同位素研究一致，这些发现表明，NNT的低表达在TCA循环中部分重新连接葡萄糖和谷氨酰胺分解代谢，使细胞对葡萄糖剥夺敏感。

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图4。

NNT敲除对细胞增殖和葡萄糖碳敏感性的影响。 一所用SkMel5细胞的葡萄糖摄取率和乳酸分泌率。Scr控制，加扰控制。B类，葡萄糖碳的净摄入量，由两倍葡萄糖消耗率和乳酸生成率之间的差异确定。C类和D类，低血糖下细胞增殖(C类)和低谷氨酰胺(D类)条件。细胞增殖归一化为生长在5 m内的相应对照细胞类型米葡萄糖和1m米含谷氨酰胺的培养基。E类，NNT敲低对SkMel5细胞增殖的影响。F类，NNT对nu/nu小鼠中作为异种移植瘤生长的SkMel5细胞增殖的抑制作用。学生的t吨该试验比较了在低葡萄糖或含谷氨酰胺的培养基下与相应对照组的增殖面板C和D类。使用单尾Student’st吨在中测试面板F,n个=5或更多。

NNT敲除对葡萄糖和谷氨酰胺分解代谢的影响由受干扰的NAD（P）H/NAD（P）介导⁺余额

敲除NNT降低了TCA循环中还原羧基化（RC）的作用，而NNT过度表达刺激了这一途径。为了测试NNT对RC的贡献是否与其对RC的贡献是否与其产生NADPH的能力有关，我们使用荧光酶分析和LC-MS定量了NADP对的细胞比率。如图5,一和B类NADPH/NADP的细胞比率⁺NNT敲除后的SkMel5细胞比打乱控制后的细胞低，而NNT过表达细胞的比率更高(图5一). NADPH和NADP⁺水平以及每个NNT敲除结构对该比率的影响因定量方法而异，可能反映了不同的提取程序。为了研究葡萄糖在提供细胞溶质NADPH中的代偿作用，我们评估了NNT敲除条件下磷酸戊糖途径（PPP）的活性。为此，我们用[1,2-¹³C类₂]葡萄糖，将一个标记的碳转移到一氧化碳₂通过氧化PPP，但同时保护两者¹³C原子通过糖酵解(30). 敲除NNT后，与SKMel5细胞糖酵解相关的PPP活性轻度增加，这由丙酮酸和乳酸的标记碳（M1）与双重标记碳（M2）的比率决定(图5C类). 该结果表明，观察到的NADPH/NADP的变化⁺NNT敲除细胞中的比率和RC被胞浆中的PPP活性略微补偿。在NNT敲除细胞中，异柠檬酸盐/柠檬酸盐与α-酮戊二酸盐混合池的比率没有显著影响（数据未显示）。这表明，在NNT敲除条件下，IDH2反应可能处于非平衡状态，其中NADPH/NADP的变化⁺比率没有伴随相应的还原（异柠檬酸盐/柠檬酸盐）和氧化（α-酮戊二酸盐）代谢物比率的改变(31). 然而，NNT敲除细胞中柠檬酸和异柠檬酸水平升高(图5D类)表明NNT的敲除可能通过调节柠檬酸盐水平间接影响IDH2反应的质量作用。

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图5。

SkMel5细胞面板中的辅因子水平。 一、NADPH/NADP⁺水平，根据制造商的说明使用酶试剂盒进行分析。Scr控制、扰码控制；澳大利亚，任意单位。B类、NADPH/NADP⁺水平，通过LC-MS测定。C类PPP对丙酮酸和乳酸生成的贡献，相对于糖酵解。D类、柠檬酸盐和异柠檬酸盐水平，通过GC-MS分析测定。E类、NADH/NAD⁺根据制造商的说明，使用酶试剂盒检测水平。F类、NADH/NAD⁺水平，通过LC-MS测定。G公司，细胞丙酮酸与乳酸的比率，通过GC-MS分析测定。H（H），提出了NNT在调节TCA循环活动中的作用模型。左侧示意图，NNT催化通过产生NADPH促进线粒体中的还原羧基化（RC）。在NNT激活的条件下，细胞在葡萄糖的贡献之间表现出充分的平衡(蓝色)-和谷氨酰胺(红色)-衍生碳进入氧化TCA循环。α公斤，α-酮戊二酸。右侧示意图，NNT功能的丧失降低了NADPH/NADP⁺抑制RC-衍生柠檬酸盐的形成并增加活性氧物种(ROS公司)水平和线粒体解偶联（线粒体解偶联）。这会降低NADH/NAD⁺从而刺激葡萄糖分解代谢对TCA循环的贡献，描述为氧化TCA循环中蓝色的百分比增加。误差线表示95%置信区间面板A和E类.

我们观察到细胞NADH/NAD减少⁺NNT敲除细胞比率(图5,E类和F类)与尹的发现一致等。(26)这表明，敲除NNT可降低细胞NADH/NAD⁺PC12细胞中的比率。然而，这一结果与基于NNT催化的酶反应的预期结果相反。众所周知，敲低NNT可诱导线粒体解偶联并降低线粒体膜电位(26,32)导致线粒体NADH/NAD减少⁺比率。相反，因为大多数线粒体NADH是以结合形式存在的(33)线粒体占细胞体积的20%(34)，观察到的NADH/NAD⁺比值主要代表细胞溶质室的比值。进一步研究NNT敲低对NADH/NAD的影响⁺平衡后，我们测定了丙酮酸和乳酸的水平，这反映了细胞溶质NADH/NAD的变化⁺比率(31). NNT敲除细胞的丙酮酸/乳酸比率高于对照细胞(图5G公司)，表示细胞溶质NADH/NAD较低⁺比率。

NADH/NAD⁺辅因子测量结果支持以下模型：NNT的敲除刺激葡萄糖氧化对TCA循环的贡献，作为对NADH/NAD降低的反应⁺比率。相反，NADPH/NADP⁺测量结果证实了我们的¹³C-标记的谷氨酰胺研究表明，NNT在促成RC中的作用在于其在线粒体中产生NADPH的能力(图5H（H）).

讨论

NNT被认为是线粒体NADPH的主要生成物(24). 据推测，NNT还可以调节胰岛素分泌和葡萄糖稳态，一些研究表明，NNT突变的C57BL/6J小鼠表现出葡萄糖不耐受和胰岛素分泌受损(32,35)而其他研究则对这一假设提出了质疑(36,37). NNT参与NADPH的产生和质子移位，人们主要从活性氧解毒和应激反应的角度来看待它(24)家族性糖皮质激素缺乏症患者中报告NNT突变(38). NNT也被证明可以调节巨噬细胞的炎症反应(39)，再次强调了其在线粒体中作为自由基解毒剂的作用。NNT严格来说是一种辅因子调节酶，将还原当量（氢化物离子）从NADH转移到NADP⁺，产生驱动某些合成代谢反应所需的NADPH。根据这一观点，NNT在中枢碳代谢中的作用以前从未被研究过。我们的¹³碳同位素研究阐明了TCA循环活动受到干扰的辅因子平衡的结果。

我们的研究表明，IDH2可以通过NADPH的供应在质量作用水平上调节RC。敲除NNT可抑制RC对SkMel5和786-O细胞TCA循环的作用，而过度表达NNT足以刺激此反应。还有其他可能有助于线粒体NADPH生成的候选酶。苹果酸酶3（ME3）定位于线粒体，将丙酮酸的产生与NADP的还原偶联⁺(40). 我们没有评估ME3在SkMel5细胞或786-O细胞中的表达水平或其对RC的贡献。然而，ME3是一种碳代谢酶，shRNA-介导的过表达敲除等遗传途径不仅会干扰辅因子平衡，也会干扰碳分布。因此，要从碳再分配的作用中区分NADPH供应的作用，需要采取策略排除NADPH依赖的代谢影响。NNT的敲除也抑制了SkMel5细胞中谷氨酰胺的氧化，这可以部分归因于谷氨酰胺补体减少。然而，当归一化为谷氨酰胺的补体贡献时，在NNT敲低的SkMel5细胞中RC的贡献降低。相反，[U-¹³C类₅]谷氨酰胺和[1-¹³C类₁]在786-O细胞中进行的谷氨酰胺研究表明，在谷氨酰胺引起的无补体水平上，NNT敲除只起到适度的作用。谷氨酸转化为α-酮戊二酸（回补）可由谷氨酸脱氢酶1（GLUD1）或天冬氨酸转氨酶（GOT1和GOT2）介导。此外，GLUD1反应可以是NADP⁺-或NAD⁺-依赖于谷氨酸的脱氨基作用(41). 因此，可以想象，SkMel5和786-O细胞对NNT敲除的不同回补反应可能与GLUD1和GOT1/2的不同活性和/或GLUD1对NADP的特定要求有关⁺和NAD⁺在不同的细胞系中。总之，我们的研究结果强调了NNT在通过NADPH生成促进RC中的作用。

我们发现，敲除NNT会同时增加TCA循环中的葡萄糖分解代谢。葡萄糖氧化增加部分通过PC发生。这引起了人们对辅酶因子在协调TCA循环中葡萄糖和谷氨酰胺利用中的作用的关注，并支持现有文献表明，在缺乏谷氨酰胺的情况下，肿瘤细胞的生长需要PC活性(10). 与对照细胞相比，NNT敲除的SkMel5细胞表现出更高的葡萄糖摄取，对葡萄糖剥夺更敏感，而NNT过度表达的细胞则无法做到这一点，并且在低谷氨酰胺条件下增殖更少。尽管在NNT敲除条件下PC对TCA循环的增加作用并不像“谷氨酰胺依赖细胞”中报道的那样明显(10)这些观察结果揭示了癌细胞对失调的辅因子平衡的代谢可塑性。值得注意的是，尽管NNTD在蛋白质水平和TCA循环反应方面有更好的击倒作用，但我们观察到葡萄糖净摄入量、葡萄糖缺乏反应和体内仅适用于NNTA的增殖(图4,B类,C类、和F类). 这种差异可能反映了NNTA击倒的SkMel5细胞的代谢负担，尽管它们没有像NNTD细胞那样重组细胞内代谢，但它们被迫增加其净葡萄糖摄取量，以保持足够的葡萄糖碳通量进入TCA循环。

讨论NADH/NAD中观察到的变化特别有趣⁺比率和中枢碳代谢的预期结果。对NNT酶反应的认识预测线粒体NADH/NAD⁺在NNT击倒条件下应提高比率。我们观察到细胞NADH/NAD减少⁺NNT敲低细胞中的比率，这与Yin的发现一致等。(26)与预测趋势相反。在这方面，据报道，NNT的敲除导致线粒体解偶联、低ATP水平和线粒体膜电位降低(24,26)与线粒体NADH/NAD降低有关⁺比率。因此，线粒体NADH/NAD的预期初始增加⁺NNT敲除的比率很可能被线粒体偶联和电子传递链活性的间接影响所抵消。事实上，尹等。(26)注意到NNT的敲除导致细胞NADH/NAD的初始增加⁺比率随后下降。此外，从变构观点来看，线粒体减少更多（NADH/NAD升高⁺比率）应抑制TCA循环，这很难与NNT敲除细胞中观察到的葡萄糖氧化增加相协调。然而，由于PC是一种ATP依赖酶，可以想象，线粒体NADH/NAD较高⁺可同样激活该反应以维持功能性TCA循环。研究PC在更多减少或氧化的线粒体中对TCA循环的贡献是一个悬而未决的问题。总的来说，我们的同位素研究表明，NNT的敲除部分通过PC增加了葡萄糖分解代谢对TCA循环的贡献，作为对NADH/NAD降低的反应⁺比率。

类似于对阴的研究等。(26)，我们测量了细胞NADH/NAD⁺比率，主要代表细胞溶质室的比率。事实上，与对照细胞相比，NNT敲除细胞中的丙酮酸/乳酸比率和丙酮酸水平更高。在这种情况下，苹果酸-天冬氨酸穿梭器（MAS）将还原当量从细胞质转移到线粒体。MAS活性受线粒体氧化还原状态调节(42)可以通过丙酮酸/乳酸比率进行评估(43–45). 由于MAS被线粒体NADH氧化激活，这增加了NNT敲除可能激活MAS以响应线粒体NADH/NAD降低的可能性⁺比率。相反，MAS依赖于线粒体的能量状态，添加线粒体解偶联剂会抑制其活性(44). 由于已知NNT敲除可增加线粒体解偶联，因此尚不清楚NNT敲减如何影响MAS活性。NNT敲除对减少胞浆和线粒体之间当量转运动力学的影响尚存在争议，需要直接测量这些辅因子的分隔池。

总之，我们的结果显示了受干扰NAD（P）H/NAD（P）的影响⁺中枢碳代谢的平衡，突显了NNT在TCA循环中协调葡萄糖和谷氨酰胺利用方面尚未探索的作用。这些发现强调了癌症生物学家在研究生长信号和转导途径的代谢结果时需要考虑辅因子和变构作用。

致谢

参考文献