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实验动物与生态基因生理学杂志。作者手稿；PMC 2013年12月1日提供。
以最终编辑形式发布为：
实验动物与生态基因生理学杂志。2012年12月；317(10): 630–644.
2012年10月1日在线发布。 数字对象标识：10.1002/jez.1765
预防性维修识别码：PMC3640405型
尼姆斯：NIHMS456119标准
PMID：23027641

促性腺激素释放激素（GnRH）、促性腺素抑制剂（GnIH）、Kisspeptin和GnRH-受体在小鼠出生至衰老期间睾丸活动中的定位及其可能作用

沙巴娜·安杰姆,1 阿米塔赫·克里斯纳,1,* 拉贾戈帕拉·斯里达兰,2和株式会社三
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

评估神经肽、促性腺激素释放激素（GnRH）、促性欲激素抑制激素（GnIH）、kisspeptin和促性腺素释放激素受体（GnRH-R）的分布和浓度变化，并与细胞色素P450侧链裂解（P450 SCC）酶活性、，小鼠从出生到衰老期间睾丸中的雄激素受体（AR）和血清睾酮水平。结果表明，这些分子主要定位于间质细胞和生殖细胞，并且从出生到衰老，免疫抑制有显著变化。研究发现，睾丸GnRH-R染色增加与青春期和成年期类固醇生成活性增加相一致，而染色减少与衰老期类固酮生成活性降低相一致。Western/slot分析证实了免疫染色的类似变化。因此，这些结果表明GnRH在睾丸青春期发育和衰老过程中可能发挥作用。GnRH激动剂治疗（[DTrp6，专业9-从青春期前到青春期，小鼠睾丸的类固醇生成活性显著增加，进一步支持了GnRH在睾丸青春期成熟中的作用。衰老过程中GnRH-R的显著下降可能是由于衰老过程中GnIH合成的显著增加导致GnRH-R表达的下降。据认为，GnRH-R水平的显著变化可能与类固醇生成的变化有关，这种变化会导致小鼠睾丸的青春期激活或衰老。此外，GnRH-R水平的变化可能受到睾丸中GnRH、GnIH和kisspeptin之间相互作用的调节。

生殖系统在出生后的整个时期都会发生巨大变化，从新生儿期和婴儿期到青春期开始、成年期，最后到衰老(芬克，2000;Tena-Sempere和Huhtaniemi，2003年). 这种复杂的功能和发育特征的变化表明，负责实现、维持和改变哺乳动物生殖能力的监管系统具有多方面的性质。最近一项对人类和其他哺乳动物物种的研究表明，生殖衰老是一个复杂的过程，涉及神经肽功能的改变，神经肽控制对雌二醇作出反应的下丘脑-垂体-性腺轴(Downs and Wise，2009年). 促性腺激素释放激素（GnRH）是最重要的神经肽，为生殖轴提供主要驱动力。在雄性大鼠中，衰老相关的生殖功能下降被证明是由于下丘脑GnRH分泌减少所致(格伦瓦尔德等人，1994年). 据进一步报道，衰老雄性大鼠下丘脑GnRH基因表达降低(91年，格伦瓦尔德和松本)这表明GnRH合成能力降低可能导致与衰老相关的促性腺激素分泌和性腺活性下降。

虽然人们普遍认为GnRH是垂体促性腺激素合成和释放的唯一下丘脑调节器，但最近的研究表明，GnRH-与其他神经肽的关系对GnRH--的合成和分泌至关重要(Herbison，2006年). 各种神经肽的信号参与下丘脑GnRH生物合成和释放的动态控制。2000年，Tsutsui及其同事发现了一种新的下丘脑神经肽，与GnRH相反，它能有效抑制鹌鹑体内促性腺激素的释放，并将其命名为GnIH(Tsutsui等人，2000年). 从过去10年的研究中，我们现在知道GnIH存在于几种鸟类中，包括鹌鹑、鸡、麻雀和八哥，并通过对GnRH系统和垂体前叶的作用，通过GPR147介导，通过减少促性腺激素的释放和合成来调节鸟类的繁殖（综述，Tsutsui，2009年;Tsutsui等人，2010a,b条). 随后，在各种哺乳动物中发现了GnIH同源基因（综述，筑井，2009;Tsutsui等人，2010a,b条). GnIH及其哺乳动物同源物RF-酰胺相关肽（RFRPs）属于LPXRF酰胺羧基肽共识序列（X=L或Q）组（综述，筑井，2009;Tsutsui等人，2010a,b条). RFRP基因编码的哺乳动物GnIH同源基因也已在各种哺乳动物的大脑中鉴定出来(Fukusumi等人，2001年,Yoshida等人，2003年;Ukena等人，2002年;Ubuka等人，2009年). 例如，GnIH或RFRP-3（哺乳动物GnIH-同源物）的中枢或外周给药均能剂量依赖性地抑制仓鼠LH的分泌(Kriegsfeld等人，2006年)，只大鼠(Johnson等人，2007年;村上等人，2008年)和绵羊(Clark等人，2008年). 另一种新发现的兴奋性神经肽kisspeptin被证明是青春期过渡和卵巢类固醇诱导的LH激增的关键介质(Lederman等人，2010年). 研究表明，kisspeptin神经传递的减少可能导致与年龄相关的LH激增异常(Lederman等人，2010年). Kisspeptin是GnRH神经元最强大的兴奋性神经肽(Han等人，2005年). Kisspeptin神经元可能将信号从外周传递给GnRH神经元(Oakley等人，2009年). GnIH和kisspeptin的发现及其与GnRH的密切关系为我们理解生殖控制的神经内分泌机制开辟了一条新途径(Roa等人，2009年). 最近关于GnRH、GnIH和kisspeptin的大多数研究都集中于青少年的青春期和生殖调控(埃布林，2005年;Pineda等人，2010年;Roseweir和Millar，2009年)只有少数研究表明这些神经肽在生殖衰老中的重要性(Lederman等人，2010年).

性腺也是许多神经肽的合成和结合位点，包括GnRH、GnIH和kisspeptin(麦奎尔和宾利，2010年). 这些神经肽在性腺中的意义已经被广泛研究过，主要是在青春期和成年期进行的(克拉克森和赫比森，2006年). 这些神经肽是否在性腺水平上相互作用尚未得到研究。本研究的主要目的是同时评估睾丸中三种密切相关的神经肽（GnRH、GnIH和kisspeptin）和GnRH-R的分布和浓度变化，并与细胞色素P450侧链裂解酶（P450 SCC）、雄激素受体（AR）的变化进行比较在小鼠睾丸和血清睾酮水平中，从出生到衰老，以了解这些分子在睾丸中的生理意义。这项研究的结果表明GnRH可能在睾丸青春期发育中发挥作用。为了证实这一发现，进行了体内研究，以确定GnRH激动剂（[DTrp6，专业9-青春期前的GnRH治疗会影响睾丸类固醇生成酶（P450 SCC），并且这种影响是否通过GnRH-R水平的增加而介导。为了了解GnIH在衰老中的作用，进行了一项体外研究，以确定GnIH是否影响睾丸GnRH-R。

材料和方法

动物

所有实验都是根据2002年印度动物法的原则和程序进行的，并得到了巴纳拉斯印度大学动物研究委员会系的批准。本研究使用不同年龄组的雄性Parkes品系小鼠，来自我们动物房内维持的近交系群体。动物被安置在标准的实验室条件下（光照：黑暗12小时：12小时），并随意提供颗粒食物和水。

样品采集

小鼠被分为以下年龄组：（a）出生（第1天）；（b） 青春期前（4周）；（c） 青春期（6周）；（d） 生殖活跃（15周）；（e）衰老（65周）。出生日期指定为第1天。称重小鼠并在其各自年龄组处死(n个=7）在轻度麻醉乙醚下斩首。从血液中采集血清，并保存在−20°C下进行睾酮测定。每只动物的一侧睾丸保持在−20°C进行免疫印迹，另一侧睾丸固定在Bouin液中进行组织学和免疫组织化学。处死前记录每只小鼠的体重。切除两个睾丸并称重，计算性腺指数（GSI=睾丸重量×100/小鼠体重），并表示为睾丸重量（mg/100 g体重）。

睾酮测定

睾酮检测ELISA试剂盒购自意大利福利格诺（PG）Giustozzi Dia Metra（批号：DKO002），并通过加标对照进行验证。将25微升标准品、对照品或样品添加到ELISA板的每个孔中。随后，向每个孔中添加100μL稀释共轭溶液。然后将ELISA板在37°C温度下轻轻摇晃培养1小时。然后将微孔抽吸并用蒸馏水冲洗数次。然后向每个孔中添加100μL四甲基联苯胺（TMB）色敏底物，并在室温下在黑暗中孵育平板15分钟。最后，添加100μL停止溶液，并使用微孔板阅读器在450 nm处测量吸光度。标准曲线的范围为0.2至16 ng/mL。未知值在代表标准曲线最线性部分的窄范围内运行。组内变异系数为5.4%，组间变异系数为15%。在95%置信限下，睾酮的最低可检测浓度为0.07 ng/mL，可与零标准区分开来。抗体与睾酮、雄烯二酮、5α-二氢睾酮和其他类固醇的交叉反应性分别为100%、0.8%、16%和100%。

组织学

将睾丸埋入石蜡中，连续切片6μm；准备了五套幻灯片。一组用于苏木精和伊红染色，另一组用于免疫组化。

免疫组织化学

将不同年龄组（出生（第1天）、青春期前、青春期、生殖活跃和衰老）小鼠的睾丸石蜡包埋，并用免疫组织化学方法对6μm切片进行GnIH、kisspeptin、GnRH和GnRH-R的分析。在去石蜡化和水合后，用0.3%H淬火内源性过氧化物酶2O（运行）2，在0.05 M Tris–HCl、0.15 M NaCl（TBS，pH 7.4）中平衡。背景阻断分别用正常山羊血清和马血清进行。用一级抗体培养组织切片（参见表1详细信息）在PBS中室温下在TBS中放置1小时。使用ABC染色试剂盒进行扩增。在0.01 M Tris–HCl（pH 7.6）和0.1%H中，0.03%3,3′-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB；Sigma，St.Louis，MO）中显示出过氧化物酶活性2O（运行）2用埃利希苏木精对细胞核进行复染。然后将载玻片脱水，装上载玻片，在光学显微镜下观察（日本东京尼康）并拍照。对于对照实验，抗体（GnRH、GnIH和kisspeptin-10）在室温下通过与肽（200 ngGnRH/mL；1μg/mL GnIH:1μg/mL kisspectin-10）预孵育1小时来吸附。对于预吸收，将抗原添加到稀释的抗血清中，在4°C下培养过夜，离心，然后使用上清液。

表1

免疫组织化学和Slot/Weistern blot所用抗体的详细信息。

抗体目标物种来源浓度（用于IHC）浓度（用于Western/slot）控制
促性腺激素释放激素人类Peninsula Lab，Inc.，美国加利福尼亚州圣卡洛斯（产品目录号IHC-72011）1:2,0001:5,000预先吸收
GnRH-R公司人类圣克鲁斯生物技术公司（分类号N-20，SC 8682）1:1001:500否定
促性腺激素抑制激素鹌鹑Kazuyushi Tsutsui，日本东京1:5,0001:8,000预先吸收
吻素鼠标法国努齐利·阿兰·卡拉蒂1:5,0001:8,000预先吸收
细胞色素P450 SCC老鼠美国加利福尼亚州米利波雷市塔姆利加（分类号AB1244）1:500
雄激素受体人类美国圣克鲁斯生物技术公司（分类号N-20，SC 816）1:200
肌动蛋白β-肌动蛋白西格玛A2228、128K48131:500

免疫印迹

将不同年龄组的睾丸合并以产生10%（w/v）的匀浆，并根据Chanda等人（2003年）将Lowry法测定的等量蛋白质（50μg）加载到SDS-PAGE（10%）上进行电泳。此后，在4°C下将蛋白质电泳转移至PVDF膜（美国圣路易斯Sigma-Aldrich）过夜。使用PBS将等量蛋白质的样品调节至等体积，并使用Millipore狭缝印迹仪将样品加载到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上进行狭缝印痕分析。通过Ponceau-S染色检查转移效率。然后用含有5%脂肪干乳的TBS（pH 7.6）封闭PVDF膜60分钟，然后用初级抗血清孵育（参见表1详细信息）在室温下1小时或在4°C下过夜。然后在TBS–Tween 20中清洗膜三次，每次10分钟。用抗兔IgG结合辣根过氧化物酶（1:1000）进行免疫检测4小时，然后在TBS中清洗10分钟（三次）。使用ECL试剂盒检测信号（加州Hercules Bio-Rad）。每个蛋白质的印迹重复三次。免疫印迹的密度分析是通过使用计算机辅助图像分析（图像J 1,38x，NIH，USA）扫描和量化相对积分密度值（RIDV）的条带来进行的。这些数据被归一化为β肌动蛋白水平，并表示为相对于对照组的%RIDV。

治疗

体内研究

小鼠每天腹腔内注射不同剂量的GnRH激动剂（[DTrp6，专业9-（低=200 ng/天/体重，高=2μg/天/体重）溶于生理盐水中15天(n个=每组8-10）。对照组小鼠(n个=10）仅接收车辆。GnRH激动剂的剂量（[DTrp6，专业9-NEt]GnRH）是根据以前的研究选择的，但有轻微改变(Singh和Krishna，2010年). 治疗从产后第4周开始，以保持各组所有小鼠的一致性。最后一次注射后30分钟内，用麻醉乙醚将动物斩首处死，并采集血液。处死前记录每只小鼠的体重。将睾丸切除、清洁并称重。将每只动物一侧的睾丸冷冻并保存在−20°C下，以进行细胞色素P450 SCC和GnRH-R蛋白表达的免疫印迹。

体外研究

为了研究GnIH对GnRH-R表达的影响，我们对成人睾丸进行了体外研究，用不同剂量的GnIH24小时。GnIH的剂量是根据以前的研究选择的，但有轻微改变(Ubuka等人，2006年). 成年雄性小鼠(n个=3）被带到实验室后，立即用小剂量麻醉乙醚斩首处死。他们迅速取出睾丸，在含有250 U/mL青霉素和250μg/mL硫酸链霉素的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM；印度孟买Himedia）中清除附着的脂肪组织。将睾丸切成等份（每块约10 mg），并按照上述方法进行培养(Banerjee等人，2011年). 培养基为DMEM（含丙酮酸钠和L-谷氨酰胺）和火腿F-12（1:1；v:v）（Himedia）的混合物，含有100 U/mL青霉素、100μg/mL链霉素和0.1%牛血清白蛋白（美国圣路易斯西格玛-奥尔德里奇）。在37°C下初始孵育2小时后，丢弃培养基，并最终在1 mL培养基中培养睾丸（每管一个），培养基在含有95%空气和5%CO的湿润气氛中2在37°C下用两剂GnIH低剂量（1 ng/mL）和高剂量（10 ng/mL）维持pH 7.4 24小时。每个治疗组一式三份。在这些条件下培养的睾丸看起来健康，没有任何坏死迹象。在培养结束时收集睾丸，用PBS清洗数次，并在−20°C下冷冻以进行免疫印迹研究。

统计分析

密度测定数据表示为相对积分密度值百分比±SEM的平均值。从免疫印迹获得的条带归一化为β-肌动蛋白（美国圣路易斯Sigma-Aldrich）条带。通过单因素方差分析（ANOVA）和Neuman–Keul检验确定各组间睾酮水平和GnIH、GnRH、GnRH-R和kisspeptin强度差异的显著性。使用SPSS软件12 for window（Apache软件基金会）进行相关性研究，以比较不同组的数据。如果P（P）< 0.05.

结果

小鼠不同衰老阶段睾丸质量和性腺指数的变化

小鼠从出生到衰老的不同衰老阶段中睾丸质量（mg）和GSI的变化如图所示图1A和B结果显示，从出生到生育活跃状态，体重逐渐增加。GSI和睾丸质量从出生到生殖活跃状态逐渐增加，但显著下降(P（P）<0.05）小鼠衰老期间(图1A和B).

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年龄依赖性变化(A类)睾丸肿块和(B类)小鼠性腺小体指数（GSI）。数值表示为平均值±SEM(N个= 8–10). *数值明显更高(P（P）<0.05）与其他年龄组（出生、青春期前、青春期和衰老）相比。C类：小鼠在发育和衰老过程中血清睾酮水平的变化。数值为平均值±SEM。*繁殖活跃期数值明显较高(P（P）<0.05）与出生、青春期前、青春期和衰老阶段相比**数值显著(P（P）<0.05）在小鼠衰老和生殖活跃期较低。出生（第1天）；青春期前（1周）；青春期（6周）；生殖活跃（15周）；衰老（65周）。

小鼠不同衰老阶段睾酮浓度的变化

小鼠从出生到衰老的不同衰老阶段中睾酮浓度（ng/mL）的变化如所示图1C睾酮浓度从出生到生殖活跃状态逐渐增加，但显著下降(P（P）<0.05）小鼠衰老期间(图1C).

小鼠不同衰老阶段睾丸GnRH和GnRH-R表达的变化

GnRH在小鼠睾丸中的免疫细胞化学定位显示出从出生到衰老的显著变化(图2A). 在不同的衰老阶段，GnRH阳性染色主要局限于间质细胞，但在衰老期间，在生殖细胞中可见染色。出生时，GnRH的中度免疫染色主要见于Leydig细胞。GnRH在青春期前Leydig细胞中的免疫染色显著降低。青春期期间，Leydig细胞中GnRH的免疫染色显著增加。生殖活跃期间质细胞中GnRH的免疫染色进一步增强。GnRH中度免疫染色主要见于衰老过程中的生殖细胞，间质细胞轻度染色。

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A类GnRH肽在小鼠睾丸发育和衰老过程中的免疫定位。在发育过程中，GnRH在间质中的免疫反应性增加。在出生、青春期和生殖活跃期，Leydig细胞（LC）中观察到GnRH的强免疫染色，而在衰老期，杂乱生精小管的生殖细胞（GC）中则观察到中度免疫染色。出生和衰老期间，黑色箭头表示莱迪格细胞（LC）的免疫染色，而白色箭头表示生殖细胞（G）、生殖细胞（GC）和脱落生殖细胞（e GC）的免疫着色。所有数字均以100倍的放大倍数显示。B类GnRH受体（GnRH-R）在小鼠睾丸发育和衰老过程中的免疫定位。在发育过程中，GnRH-R在间质中的免疫反应性增加。在青春期和生殖活跃期，Leydig细胞、生殖细胞以及细长精子细胞中观察到GnRH-R的强免疫染色。Leydig细胞轻度免疫染色，衰老时生殖细胞无免疫反应。黑色箭头显示Leydig细胞（LC）的免疫染色，而白色箭头显示生殖细胞（G）、生殖细胞（GC）在出生、青春期、生殖活跃期的免疫染色以及萎缩生精小管和衰老生精细胞的无免疫染色。所有数字均以100倍放大倍数显示。[彩色图片可在本文的在线版本中查看，网址为http://onlinelibrary.wiley.com/journal/10.1002/（ISSN）1932-5231]

GnRH-R在小鼠睾丸中的免疫细胞化学定位显示，从出生到衰老有显著差异(图2B). GnRH-R阳性染色定位于不同老化阶段的间质细胞和生殖细胞。出生时，Leydig细胞和生殖细胞中均发现GnRH-R中度免疫染色。GnRH-R在青春期前的Leydig细胞和生殖细胞中的免疫染色均显著降低。GnRH-R的免疫染色在青春期的Leydig细胞和生殖细胞中显著增加，在生殖活跃期的间质细胞、生殖细胞以及细长精子细胞中持续存在。GnRH-R的轻度免疫染色主要见于衰老过程中的间质细胞。

睾丸GnRH和GnRH-R免疫印迹从出生到衰老的密度分析显示出显著差异。GnRH和GnRH-R的免疫反应性显著降低(P（P）<0.05）。GnRH和GnRH-R的免疫反应性显著增强(P（P）<0.05）在青春期和生殖活跃期(图3A和B). 然而，GnRH的免疫反应性显著增强(P（P）<0.05），但GnRH-R的免疫反应性显著降低(P（P）<0.05）衰老期间(图3A和B).

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A类：不同年龄组Parkes品系小鼠睾丸中GnRH肽的缝隙印迹分析*数值显著(P（P）<0.05），青春期前与出生时相比有所下降**数值显著(P（P）与出生和青春期前相比，小鼠青春期、生殖活跃期和衰老期增加。B类：不同年龄组小鼠睾丸GnRH-R蛋白表达的免疫印迹分析*数值显著(P（P）<0.05），青春期前与出生时相比有所下降**数值显著(P（P）与出生、青春期前和衰老小鼠相比，青春期和生殖活跃期的小鼠数量增加。#数值显著(P（P）与出生、青春期和生殖活跃期相比，小鼠衰老程度降低。[彩色图片可在本文的在线版本中查看，网址为http://onlinelibrary.wiley.com/journal/10.1002/（ISSN）1932-5231]

小鼠不同衰老阶段睾丸GnIH和Kisspeptin表达的变化

GnIH和kisspeptin在小鼠睾丸的免疫细胞化学定位也显示出从出生到衰老的显著变化。GnIH和kisspeptin阳性染色在不同衰老阶段的间质细胞中均有定位。出生时，在睾丸的Leydig细胞和原始生殖细胞中发现GnIH和kisspeptin的中度免疫染色。GnIH和kisspeptin在青春期前的Leydig细胞中的免疫染色均略有下降。青春期Leydig细胞中GnIH和kisspeptin的免疫染色增强。GnIH在Leydig细胞和细长精子细胞中呈强免疫染色，kisspeptin在生殖活跃期间质细胞中呈中等免疫染色，GnIH-kisspept在退化生殖细胞和衰老小鼠睾丸Leydig中呈强阳性反应(图4A和B).

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A类GnIH在小鼠睾丸发育和衰老过程中的免疫定位。GnIH的免疫反应性在小鼠出生至青春期前的Leydig细胞（LC）中呈轻度染色，在生殖细胞（G）中无染色，在青春期和生殖活跃期的睾丸、生殖细胞和衰老期的延长精子细胞中呈强染色。黑色箭头显示Leydig细胞（LC）中的免疫染色，而白色箭头显示衰老过程中生殖细胞（GC）的免疫染色。所有数字均以100倍的放大倍数显示。B类kisspeptin在小鼠发育和衰老过程中的免疫定位。kisspeptin蛋白的免疫反应性主要定位于睾丸间质和Leydig细胞。kisspeptin的免疫反应性在出生至青春期前的Leydig细胞（LC）中呈轻度至中度染色，在青春期、繁殖活跃期和衰老小鼠的生殖细胞（GC）中呈强染色。黑色箭头显示Leydig细胞（LC）中的免疫染色，而白色箭头显示衰老过程中生殖细胞（GC）的免疫染色。所有数字均以100倍的放大倍数显示。[彩色图片可在本文的在线版本中查看，网址为http://onlinelibrary.wiley.com/journal/10.1002/（ISSN）1932-5231]

睾丸GnIH和kisspeptin免疫印迹的密度分析显示，从出生到衰老，两者之间存在显著差异。GnIH和kisspeptin的免疫反应性显著降低(P（P）<0.05）。GnIH的免疫反应性显著增强(P（P）<0.05）在青春期和生殖活跃期(图5A)随后kisspeptin显著增加(P（P）<0.05）在青春期(图5B).

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A类：不同年龄组Parkes系小鼠睾丸GnIH肽表达的Slot-blots分析*数值显著降低(P（P）<0.05）**数值显著增加(P（P）<0.05），在青春期，小鼠繁殖活跃与出生和青春期前相比。#值非常重要(P（P）与青春期和生殖活跃期相比，衰老增加。B类不同年龄组Parkes系小鼠睾丸kisspeptin蛋白表达的Slot-blots分析*数值显著降低(P（P）<0.05）**数值显著增加(P（P）<0.05）在小鼠青春期与生殖活动期。#值非常重要(P（P）与青春期和生殖活跃期相比，衰老增加。[彩色图片可在本文的在线版本中查看，网址为http://onlinelibrary.wiley.com/journal/10.1002/（ISSN）1932-5231]

GnIH和kisspeptin的免疫反应性进一步增强(P（P）<0.05）衰老期间(图5A和B).

小鼠不同衰老阶段睾丸细胞色素P450 SCC和雄激素受体（AR）蛋白水平的变化

用免疫印迹法和密度分析法研究了从出生到衰老不同阶段睾丸细胞色素P450 SCC和雄激素受体蛋白水平的变化(图6A). 细胞色素P450 SCC蛋白的免疫印迹显示，约42kDa处有一条免疫反应带，雄激素受体蛋白分别在约90kDa和110kDa时有双免疫反应带。结果显示，从出生到衰老的不同阶段，小鼠睾丸中细胞色素P450 SCC和雄激素受体的免疫反应性测定的蛋白质水平发生了显著变化。细胞色素P450 SCC的免疫印迹强度显著增加(P（P）<0.05）从出生到青春期生殖活跃状态，然后显著下降(P（P）<0.05）衰老期间(图6A). 通过免疫反应测定雄激素受体的蛋白质水平显著增加(P（P）<0.05）。在生殖活跃的睾丸中清楚地观察到约90和110kDa的双重免疫反应带，然后显著下降(P（P）<0.05）在衰老过程中(图6B).

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A类：不同年龄组小鼠睾丸P450 SCC和AR表达的免疫印迹分析*数值显著增加(P（P）<0.05）青春期和生殖活跃期与出生和青春期前小鼠的比较**价值显著下降(P（P）<0.05）在小鼠衰老与青春期前、青春期和生殖活跃期。B类：AR的免疫印迹分析在繁殖活跃小鼠睾丸中检测到两种抗AR抗体的免疫反应分子*数值显著(P（P）与出生、青春期前和生殖活跃期相比，小鼠青春期期增加**值非常重要(P（P）与青春期前、青春期和生殖活跃期相比，小鼠衰老程度降低。[彩色图片可在本文的在线版本中查看，网址为http://onlinelibrary.wiley.com/journal/10.1002/（ISSN）1932-5231]

不同衰老阶段小鼠睾丸GnRH、GnIH、Kisspeptin和GnRH-R与睾丸P450鳞状细胞癌和血清睾酮浓度的相关性

结果表明，GnRH的变化与GnIH和kisspeptin在小鼠出生到衰老期间的睾丸浓度之间存在显著相关性。小鼠睾丸GnRH-R表达的变化与睾丸细胞色素P450 SCC和血清睾酮浓度显著相关(表2).

表2

睾丸GnRH和GnRH-R与不同衰老阶段（出生至衰老）小鼠睾丸GnIH、kisspeptin、P450 SCC和血清睾酮浓度的相关性。

促性腺激素抑制激素KP-10型睾酮细胞色素P450 SCC
促性腺激素释放激素第页= 0.924;P（P）< 0.05第页= 0.940;P（P）< 0.05纳秒纳秒
GnRH-R公司纳秒纳秒第页= 0.7783;P（P）< 0.05第页= 0.7529;P（P）< 0.05

NS-不显著，值在P（P）< 0.05.

促性腺激素释放激素受体激动剂对青春期前小鼠睾丸细胞色素P450 SCC和GnRH-R蛋白表达的影响

免疫印迹的密度分析表明，不同剂量（200 ng和2μg/天/体重）的GnRH促性腺激素（[DTrp6，专业9-NEt]GnRH）(图7A和B). 低剂量的促性腺激素释放激素受体激动剂没有产生显著的变化，而高剂量则产生显著的增加(P（P）与对照组相比，治疗组小鼠GnRH-R蛋白的表达(图7A). 促性腺激素释放激素激素产生剂量依赖性显著增加(P（P）与对照组相比，治疗组小鼠睾丸中细胞色素P450 SCC蛋白的表达(图7B).

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促性腺激素释放激素激动剂（[DTrp6，专业9-GnRH-R和P450 SCC表达上的NEt]GnRH）。青春期前不同剂量的GnRH治疗表现出显著性(P（P）与对照组相比，2μg/体重的睾丸GnRH-R表达增加(A类). *值很重要(P（P）与对照组相比，两种剂量GnRH（200 ng/天和2μg/天）的睾丸P450 SCC表达增加(B类). [彩色图片可在本文的在线版本中查看，网址为http://onlinelibrary.wiley.com/journal/10.1002/（ISSN）1932-5231]

体外GnIH治疗对睾丸GnRH-R蛋白表达的影响

免疫印迹密度分析显示，不同剂量GnIH（低剂量=1 ng/mL，高剂量=10 ng/mL）处理的小鼠睾丸中GnRH-R蛋白的%RIDV有显著变化。GnIH治疗产生的剂量依赖性显著降低(P（P）与对照小鼠相比，睾丸中GnRH-R蛋白的表达(图8).

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GnIH对睾丸GnRH受体（GnRH-R）蛋白表达的影响。体外研究表明，1和10ng/mL的GnIH显著(P（P）与对照组相比，睾丸GnRH-R的表达降低*值很重要(P（P）<0.05）与对照组相比。

讨论

本研究结果显示，从出生到衰老，小鼠睾丸中GnRH、GnIH、kisspeptin和GnRH-R的表达存在显著差异。我们的研究表明，出生时小鼠睾丸中存在三种重要神经肽（GnRH、GnIH、kisspeptin）和GnRH-R。这与早期研究表明新生和成熟大鼠睾丸中存在GnRH和GnRH-R一致(Huhtaniemi等人，1985年). 大鼠睾丸中也有GnRH和GnRH-R基因的胎儿表达(Botte等人，'98年). 因此，我们的研究支持早先的研究结果，即GnRH可能早在围产期就影响睾丸的发育和功能(Ugrumov等人，1985年). 从青春期前到青春期，这些神经肽（GnRH、GnIH和kisspeptin）和GnRH-R的免疫染色显著增加，与小鼠睾丸中cythochrome P450 SCC水平的增加平行。青春期GnRH的增加可能是H–P–G轴激活和睾酮水平升高的原因，睾酮水平是完成睾丸下降的腹股沟-阴沟期所必需的(Pitteloud等人，2002年). GnRH和GnRH-R已在几种哺乳动物的成年睾丸中得到证实(夏普和弗雷泽，80年;Bhasin等人，'83年;87年夏普和库珀;Bull等人，2000年;亚当斯，2005年;Ramakrishnappa等人，2005年). 在成熟大鼠和成人中，在间质细胞中发现GnRH-R mRNA(Bahk等人，1995年)GnRH-R mRNA在大鼠和小鼠睾丸生殖细胞中表达(亚当斯，2005). 目前的免疫组织化学研究表明，GnRH、GnIH、kisspeptin和GnRH-R的免疫染色显著增加，尤其是在青春期Leydig细胞中。生殖活跃期精子中也出现GnRH-R和GnIH免疫染色。本研究表明这些神经肽（GnRH、kisspeptin和GnIH）和GnRH-R在调节睾丸类固醇合成和/或精子成熟中的作用。最近，GnIH和GnIH-R也在鸟类的性腺中表达(Bentley等人，2008年). GnIH也可能参与生殖细胞分化的调节，因为GnIH/R和GnIH-R都在睾丸的生殖细胞（精母细胞和精子细胞）中表达(Bentley等人，2008年). 这些研究表明GnIH通过GnIH-R直接作用于鸟类性腺的Leydig细胞(Bentley等人，2008年). kisspeptin及其受体GPR-54基因在人类和啮齿动物性腺中的表达也得到了证实(Kotani等人，2001年;Ohtaki等人，2001年;Funes等人，2003年;Tena-Sempere，2006年;Castellano等人，2006年;Shahab等人，2005年). 这项研究有趣地表明，GnRH免疫染色主要从生殖活跃期的Leydig细胞转移到衰老小鼠睾丸的生殖细胞。这可能是衰老小鼠睾丸中GnRH浓度增加的原因之一，尽管Leydig细胞中GnRH免疫染色急剧下降。这种免疫反应性的改变是否是由于老年睾丸组织结构紊乱所致，尚需进一步研究。因此，目前的观察和早期的研究表明，睾丸GnRH和GnIH可能对性腺发育和功能（包括睾丸类固醇生成和精子成熟）起自分泌或旁分泌调节作用(Uzbekova等人，2001年;赵等，2010). GnRH的定位，特别是在大鼠和小鼠生殖细胞中的定位(Ramakrishnappa等人，2005年)鸟类中的GnIH(Bentley等人，2008年;麦奎尔和宾利，2010年)还有仓鼠(Uzbekova等人，2001年)，提示GnRH和GnIH在精子发生中可能起作用。

GnRH的作用是否在睾丸生长发育的各个阶段受到GnIH和kisspeptin的调节，目前尚不清楚。我们的研究表明，从出生到衰老，睾丸GnRH、GnIH和kisspeptin之间呈正相关。早期研究表明，GnIH抑制GnRH的分泌和作用，而kisspeptin刺激GnRH的分泌和作用(Han等人，2005年;Tsutsui等人，2010年a,b条). 目前用GnIH进行的体外治疗导致小鼠睾丸中GnRH-R的浓度显著下降。因此，推测GnIH对GnRH的作用可能与调节睾丸GnRH-R的表达有关。

本研究的一个重要观察结果是，从青春期前到青春期，睾丸中GnRH、GnIH、kisspeptin和GnRH-R的表达显著增加。这些参数的变化与睾丸活动的增加显著相关，如睾丸重量和循环睾酮浓度的增加。这一观察结果表明，这些神经肽（GnRH、GnIH和kisspeptin）和GnRH-R的表达增加可能对睾丸中负责青春期发育的类固醇生成增加至关重要。早期对接种GnRH的公牛的研究表明，其睾丸发育受到抑制，包括循环睾酮浓度受到抑制(库克等人，2000年). 众所周知，增加对幼年哺乳动物下丘脑内GnRH神经元的刺激会导致青春期的开始，随后H–P–G轴完全激活(Chandolia等人，1997年). 在本研究中，GnRH-agonist（[DTrp6，专业9-NEt]GnRH）对青春期前小鼠持续15天，睾丸中类固醇生成酶cythochrome P450 SCC和GnRH-R蛋白的表达显著增加，这表明睾丸GnRH-R浓度会导致青春期前促性腺激素的变化。这一发现表明，GnRH通过刺激睾丸类固醇生成促进青春期激活。早期研究表明，接受补充GnRH的一岁公牛的睾丸组织中，睾丸生长增强，精子发生和支持细胞数量增加(Zirkin和Chen，2000年).

本研究的另一个重要观察结果是，衰老期间睾丸中GnRH-R的浓度显著下降。GnRH-R浓度的降低与衰老期间小鼠循环睾酮水平的显著降低相一致。众所周知，大鼠血清睾酮水平随着年龄的增长而下降，如早期所示(Wang和Stocco，2005年). 成年大鼠睾丸间质细胞产生睾酮的能力高于老年大鼠。早期的研究报告称，老年小鼠Leydig细胞中StAR水平下降，表明在衰老过程中胆固醇向线粒体内膜的转运可能存在缺陷(Chen等人，’96). 本研究表明，与成年小鼠相比，衰老小鼠中细胞色素P450 SCC酶的浓度显著降低。早些时候，在棕色挪威大鼠身上发现，与年龄相关的类固醇生成减少的原因不是由于LH水平下降(Gruendelwald等人，2000年). 在人类中，男性的血清睾酮水平通常从50年开始下降(贝朗格等人，1994年;Zwart等人，’96). 睾酮水平的下降伴随着LH水平的增加或不变(Zwart等人，’96). 这些观察结果并不排除人类衰老过程中与年龄相关的H–P轴缺陷，表明存在原发性睾丸缺陷。在本研究中，睾丸GnRH、GnIH和kisspeptin的表达在衰老期间显著增加，而GnRH-R蛋白的睾丸表达在这一期间显著下降。GnRH-R下降与睾酮合成显著下降密切相关。目前的研究尚不清楚GnRH和GnRH-R在衰老过程中差异调节的原因。然而，我们目前的观察结果与之前在雄性棕色挪威大鼠身上的发现相一致，表明与年龄相关的生殖能力下降被认为部分是由于GnRH作用减弱所致(Gruendelwald等人，2000年). 睾丸GnRH-R表达减少可能是由于衰老过程中GnIH合成增加所致。我们的体外研究清楚地表明，GnRH-R在用GnIH处理的小鼠睾丸中的下调与衰老一样。

本研究提供的数据显示，GnRH-R在不同生殖阶段在睾丸中的双相调节。从出生到衰老，GnRH浓度的增加导致GnRH-R的下调，但青春期前到青春期除外，在青春期，GnRH浓度的升高导致GnRH-R的上调。GnRH-R表达的显著增加与青春期类固醇生成率的增加相一致，而衰老过程中GnRH-R的降低与睾丸类固醇生成率的降低相一致。因此，GnRH-R表达的变化可能与小鼠睾丸的青春期激活和衰老有关。目前的研究尚不清楚GnRH-R表达变化的原因。需要进一步研究以确定老年睾丸是否能够对外源性GnRH激动剂产生反应。GnRH与GnIH和kisspeptin相互作用的累积效应可能调节GnRH-R的睾丸表达，并可能是本研究中观察到的双相效应的原因。需要更详细的研究来证实这一假设。

简言之，本研究显示，从出生到衰老，小鼠睾丸中GnRH、GnIH、kisspeptin和GnRH-R的浓度存在显著变化，并且与睾丸类固醇生成因子和循环睾酮浓度的变化存在显著相关性。免疫组织化学分析显示睾丸GnRH、GnIH、kisspeptin和GnRH-R主要定位于间质细胞和生殖细胞。我们的结果表明，GnRH、GnIH和kisspeptin可能作为自分泌或旁分泌因子调节性腺发育和功能。GnRH-促性腺激素治疗（[DTrp6，专业9-在青春期前给小鼠服用NEt]GnRH）后，睾丸中类固醇生成酶P450 scc和GnRH-R的表达显著增加。这一观察结果表明，GnRH可能在睾丸成熟中发挥作用。GnRH-R的显著下降与衰老期间睾酮合成的减少相一致。GnRH-R表达减少可能是由于衰老过程中GnIH合成增加所致。GnRH-R的表达可能受到GnRH、GnIH和kisspeptin在睾丸水平上的相互作用的调节。需要进一步的研究来证实这一假设。

致谢

我们感谢国家农业研究所的阿兰·卡拉蒂博士慷慨捐赠KP-10抗体。这项工作在一定程度上得到了UGC、新德里和A.K.的赠款支持。；日本教育、科学和文化部（18107002、22132004和22227002）向K.T.提供的科学研究，以及美国国立卫生研究院（HD41749、HD52155和RR03034）向R.S.和S.A.提供的资助，高度感谢新德里教资会的资助。

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