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哼，变种。2013年2月；34（2）：363–373。
2012年10月30日在线发布。 数字对象标识：10.1002/humu.22244
预防性维修识别码：项目经理3638346
PMID：23111906

泛欧研究C9或72与FTLD相关的重复：地理流行率、基因组不稳定性和中间重复

朱莉·范德泽,1,2,† 伊尔斯·吉塞林克,1,2,† 卢比娜·迪伦,1,2 蒂姆·范·朗格霍夫,1,2 杰西·Theuns,1,2 塞巴斯蒂安·恩格尔博格斯,2,三 Stéphanie Philtjens酒店,1,2 马修·范登布尔克,4 Kristel Sleegers公司,1,2 安妮·西本,1,2,5 Veerle Bäumer公司,1,2 吉萨·梅斯,1,2 埃伦·科尔斯米特,1,2 芭芭拉·博罗尼,6 亚历山德罗·帕多瓦尼,6 西尔瓦娜·阿切蒂,6 罗伯特·佩内茨基,7 珍妮·迪尔·施米德,7 亚历山大·德门多萨,8 加布里埃尔·米尔顿伯格-米尔顿伊,8 索尼娅·佩雷拉,8 何塞·皮门特尔,9 贝内德塔·纳克米亚斯,10 西尔维娅·巴格诺利,10 桑德罗·索比,10 卡罗琳·格拉夫,11,12 惠辛·蒋,11 玛丽·韦斯特伦德,11 拉奎尔·桑切斯山谷,13 阿尔伯特·拉多,13 埃伦·盖尔皮,14 伊莎贝尔·桑塔纳,15,16 玛丽亚·罗萨里奥·阿尔梅达,17 Beatriz圣地亚哥,15 乔瓦尼·弗里索尼,18 奥拉齐奥·萨内蒂,18 克里斯蒂安·邦维奇尼,18 马蒂斯·辛诺夫齐克,19,20 沃尔特·梅兹勒,19,20 詹妮弗·缪勒（Jennifer Müller vom Hagen）,19,20 Ludger Schöls公司,19,20 迈克尔·T·海内卡,21,22 弗兰克·杰森,21,22,23 拉多斯拉夫·马泰吉,24 伊娃·帕罗布科娃,24 Gabor G Kovacs公司,25 托马斯·斯特罗贝尔,25 斯塔科·萨拉福夫,26 伊瓦利奥·图内夫,26,27 阿尔贝娜·乔丹诺娃,1,28 阿德里安·达内克,29 托马斯·阿兹伯格,30 吉安·玛丽亚·法布里奇,31 西尔维娅·泰斯蒂,31 埃里克·萨尔蒙,32 帕特里克·桑滕斯,5 珍妮·雅克·马丁,2 帕特里克·克拉斯,2,33 里克·范登伯格,34 彼得·保罗·德德恩,2,三 马克·克鲁斯,1,2,* 克里斯汀·范·布勒克霍温,1,2,*并代表欧洲早期失智症（EOD）联盟‡
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

我们评估了C9或72G公司4C类2泛欧洲额颞叶变性（FTLD）队列中的扩张(n个=1205），由欧洲早期发病痴呆症（EOD）联合会确定。接下来，我们对我们的数据和其他欧洲研究的数据进行了荟萃分析，共有来自15个西欧国家的2668名患者。The frequency of theC9或72西欧FTLD患者的总扩张率为9.98%，家族性为18.52%，散发性为6.26%。芬兰和瑞典的总频率分别为29.33%和20.73%，西班牙的总频率为25.49%。相比之下，德国的流行率仅限于4.82%。此外，我们研究了与风险单倍型密切相关的中间重复序列（7–24个重复单位）在疾病和C9或72表达式。体外报告基因表达研究表明C9或72随着正常重复单位数量的增加，表明中间重复可能作为易感等位基因，有利于功能丧失疾病的发病机制。此外，我们观察到，在邻近G的富含GC的低复杂度序列中，短indels的频率显著增加4C类2在中重复C9或72扩展载体(P（P）<0.001），最常见的指数产生一个长连续的不完美G4C类2重复，这可能更容易导致复制滑移和病理扩张。

关键词：FTLD公司,C9或72重复扩增，中间等位基因，欧洲早期失智症协会

介绍

六核苷酸G的病理性扩张4C类2基因启动子区的重复C9或72（MIM#614260）最近被确定为潜在基因缺陷后的长期缺陷[Dejesus-Hernandez等人。，2011; Gijselinck等人。，2012; Renton等人。，2011]联动装置[Boxer等人。，2011; Gijselinck等人。，2010; Luty等人。，2008; Le Ber等人。，2009; Morita等人。，2006; Pearson等人。，2011; Vance等人。，2006; Valdmanis等人。，2008]和协会[Laaksovirta等人。，2010; Shatunov等人。，2010; van Es等人。，2009; Van Deerlin等人。，2010]额颞叶变性（FTLD）和肌萎缩侧索硬化（ALS）发生在染色体9p21区域[Van Langenhove等人。，2012年a]. 在法兰德斯-比利时人群中，我们计算出病理性G4C类2扩张是FTLD的第二常见遗传原因【Gijselinck等人。，2012; Van Langenhove等人。，2012年b]. 特别是在家族性ALS患者亚组（FTLD–ALS）中，C9或72是第一个解释高达85.71%患者的致病基因【Gijselinck等人。，2012; Van Langenhove等人。，2012年b]. 从那时起，对不同地理区域的几个患者队列进行了这种重复扩增突变建立的筛选C9或72作为FTLD的主要基因，在总FTLD中的频率为7%–11%，在家族FTLD患者中的频率是12%–25%【Boeve等人。，2012; DeJesus-Hernandez等人。，2011; 法拉利等。，2012; Gijselinck等人。，2012; Xiung等人。，2012; Mahoney等人。，2012; 马朱尼2012; Renton等人。，2011; Simon-Sanchez等人。，2012; Snowden等人。，2012].

已经提出了不同的可能疾病机制，包括单倍体不足和RNA毒性[Dejesus-Hernandez等人。，2011; Gijselinck等人。，2012]以及广泛的基因型-表型相关性研究正在被报道[Al-Sarraj等人。，2011; Arighi等人。，2012; 比吉奥，2012; Boeve等人。，2012; Chio等人。，2012; Dejesus-Hernandez等人。，2011; 法拉利等。，2012; Gijselinck等人。，2012; Xiung等人。，2012; Majounie等人。，2012; Mahoney等人。，2012; Murray等人。，2011; Renton等人。，2011; Simon-Sanchez等人。，2012; Snowden等人。，2012; Troakes等人。，2011; Whitwell等人。，2012]. 然而，关于突变谱，即G基因突变的基因组机制，我们知之甚少或一无所知4C类2重复序列不断扩大，重复序列长度对疾病易感性和基因表达的影响。

在本研究中，我们旨在扩大我们的C9或72在法兰德斯-比利时FTLD和FTLD-ALS队列中的观察结果(n个=360）与845名FTLD和FTLD–ALS患者组成的更大的欧洲队列进行比较，其中我们确定了病理性G4C类2扩展。此外，我们为G的作用提供了第一个证据4C类2上的中间重复长度C9或72有利于G细胞病理性扩张的基因组机制的表达和假设4C类2重复。

材料和方法

研究人群

欧洲FTLD队列是通过欧洲早期失智症（EOD）联盟收集的（补充。表S1). 欧洲EOD协会于2011年8月成立，旨在集中和协调流行病学、临床和生物数据以及欧洲各地EOD患者的生物材料，以促进备受关注的转化性痴呆研究。补充。表S1描述了欧洲EOD联盟成员提供的每个国家和每个临床亚组的患者数量。我们收到了917名无关FTLD和FTLD-ALS患者的DNA、临床和人口统计信息，以及46名尸检患者的组织病理学数据。917名患者还包括来自比利时法语区瓦隆尼亚的10名患者，以及来自意大利、西班牙和瑞典的另外6名患者，他们被转诊到我们分子遗传学部（DMG-DSF）的诊断服务设施进行临床基因检测。患者根据既定的临床诊断Neary标准进行诊断【Neary等人。，1998]以及神经病理学诊断的麦肯齐共识标准【麦肯齐等人。，2010].

法兰德斯-比利时队列包括337名FTLD无关患者和23名FTLD-ALS患者。这些患者是通过比利时神经病学（BELNEU）联盟招募的，该联盟与比利时九家不同的专业记忆诊所和神经病学部门的神经学家合作[Gijselinck等人。，2012; Van Langenhove等人。，2012年b]（补充。表S2). 除患者队列外，还收集了一组佛兰德斯-比利时对照队列(n个= 1,083). 有关更多详细说明，请参阅补充。材料和方法.

组织病理学C9或72扩展载体

从11开始C9或72G公司4C类2扩增载体、福尔马林固定脑组织进行免疫组化。从额叶皮层、颞叶新皮层、海马、纹状体区、新纹状体、中脑、脑桥和小脑获取5微米切片。在7例患者中，提供了来自丘脑和脊髓的额外样本。对载玻片进行泛素、p62、高磷酸化tau、β淀粉样蛋白、TDP43和FUS染色。有关技术细节，请参阅补充。材料和方法.

C9或72G公司4C类2基因分型分析

我们开发了一种可供选择的重复计时PCR检测方法（反向RP-PCR；图1)和短串联重复序列（STR）片段长度测定，其具有针对具有高GC含量的等位基因优化的侧翼引物（STR-PCR；图1)允许可靠识别G4C类2膨胀载体和正常长度的精确尺寸。这些检测在两个队列和携带中间重复等位基因或侧翼LCS变异但未扩增的年轻一代指数患者的亲属中进行。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为humu0034-0363-f1.jpg

基因分型分析以表征C9或72区域和G4C类2重复。这个C9或72G公司4C类2repeat（黄色框）位于亚型第一外显子的上游NM_018325.3号（深蓝色箭头），与GC-丰富的低复杂度序列（LCS；浅灰色框）相邻，其核苷酸序列如上所示。重复出现的10 bp缺失序列g.26747_26756delGTGGT公司CGGGG公司(表4，补充。图S1)我们在LCS中观察到的，用蓝色表示。在序列下方，显示了每个PCR基因分型分析的引物及其相应PCR扩增子：粉红色的STR-PCR、绿色的正向RP-PCR、红色的反向RP-PCR和蓝色的RP-PCR测序。

有关引物和扩增协议的技术细节，请参见附录。材料和方法.

的排序C9或72GC-富低复杂度序列

我们使用了替代正向RP-PCR的产物（RP-PCR用于测序；图1)并用位点特异性反向引物对低复杂度序列（LCS）进行测序。

法兰德斯-比利时患者(n个=317）和控制(n个=752）个队列和57个扩张型携带者以及114个非扩张型携携者在欧洲队列中被成功筛查。存在G时LCS变化的共分离4C类2在两个可用的家族中进行了扩张分析。有关技术细节，请参阅补充。材料和方法.

C9或72外显子序列测定和剂量分析

这两个队列都进行了编码和剪接突变筛查C9或72在400名对照组中测定了罕见突变的频率。此外，我们使用多重扩增定量技术筛选了Flanders-Begian队列中的外显子缺失或重复[Kumps等人。，2010]. 有关技术细节，请参阅补充。材料和方法.

遗传关联研究

我们计算了与C9或72中间G4C类2标记染色体9p21的SNP rs2814707的等位基因和单倍型风险分层C9或72中间重复。在logistic回归模型中计算95%置信区间（CI）的比值比（OR），并根据年龄和性别进行调整。此外，我们研究了小风险T等位基因和中间重复长度之间的相关性。此外，在两组无G基因的患者中4C类2我们使用Kruskal–Wallis检验计算了发病年龄和正常重复长度之间的相关性。此外，我们在Kaplan-Meier生存分析中比较了短（2-6）和中等（7-24）重复长度的发病年龄。所有分析均在IBM SPSS Statistics 20（IBM Corporation，Armonk，NY，USA）中进行。有关详细信息，请参阅附录。材料和方法.

荧光素酶报告分析

我们选择了2 kbC9或72包含G的启动子片段（chr9:27572414–27574451；NCBIBuild37–hg19）4C类2基于ENCODE转录数据，重复并富集组蛋白标记、DNaseI超敏簇和转录因子结合位点【Gijselinck等人。，2012]. 该片段是通过使用带有侧翼attB位点的引物对携带不同数量正常重复单元（2、9、17和24个单元）的个体进行PCR获得的。PCR产物通过BP重组反应（Invitrogen，Life Technologies，Grand Island，NY，USA）克隆到pDONR221载体（Invit罗gen，美国纽约州格兰德岛生命技术公司），并通过序列分析确认所有插入物的完整性。选择正确的进入克隆并克隆到内部开发的无启动子目的载体中，该目的载体包含高斯（Gaussia）通过使用LR重组反应，Gateway盒下游的荧光素酶报告基因（Invitrogen，Life Technologies，Grand Island，NY，USA）。将人HEK293T细胞在24孔组织培养皿中以2×10的速度增殖并接种以进行瞬时转染5每孔细胞数，恢复24小时。细胞与40 ng pSV40-CLuc质粒共转染，该质粒编码海萤带有SV40启动子的荧光素酶基因（美国马萨诸塞州伊普斯威奇新英格兰生物实验室）和三个独立的1000 ngC9或72每个单位的启动子构建体，使用2.4μl Lipofectamine 2000（Invitrogen，Life Technologies，Grand Island，NY，USA），以双链形式。24小时后，高斯（Gaussia）荧光素酶活性（LAG公司)和海萤荧光素酶活性（LAC类)使用BioLux在生长培养基中以双倍计量高斯（Gaussia）和海萤荧光素酶检测试剂盒（美国马萨诸塞州伊普斯威奇新英格兰生物实验室）和带有双试剂注射器的Veritas微孔板光度计（美国威斯康星州麦迪逊普罗米加）。为了校正转染效率和DNA摄取，相对荧光素酶活性（RLA）计算为RLA=LAG公司/洛杉矶C类。该实验重复三次，每个结构有36个测量值。不同重复长度之间的RLA由Mann–Whitney计算U型测试。有关详细信息，请参阅补充。材料和方法.

结果

欧洲排爆协会

欧洲队列包括917名无关患者，其中845名可能或可能诊断为FTLD(n个=781）或FTLD–ALS(n个= 64;表1). 在另外72名患者中，临床表现显示FTLD的适应症以及其他神经退行性脑疾病（如阿尔茨海默病或帕金森病）的症状。对45名患者进行了尸检脑的病理诊断，包括FTLD-TDP(n个=28），平方英尺-平方毫米-平方英尺-平方英尺(n个=15），英尺/平方英寸(n个=1）和FTLD-TAU(n个=1）诊断。845名患者中有609人（72.07%）有家族病史信息，其中251人有阳性家族病史，358人被认为是散发患者(表2). FTLD（62.7±9.0，范围28-88岁）和FTLD-ALS患者组（60.9±9.8，范围31-83岁）的平均发病年龄和范围具有可比性。

表1

欧洲和法兰德斯-比利时队列的描述性特征

临床诊断队列总计n个家庭n个(%)发病±SD（范围）病理n个(%)
欧洲队列
总计845274 (32.43)62.5 ± 9.0 (28–88)45 (5.33)
FTLD公司781251（32.14）62.7 ± 9.0 (28–88)28 (3.59)
FTLD–肌萎缩侧索硬化症6423 (35.94)60.9 ± 9.8 (31–83)17 (26.56)
其他一7240 (55.56)60.0 ± 12.1 (35–95)不适用。
法兰德斯-比利时队列
总计360108 (30.00)62.9 ± 9.7 (29–85)24 (6.67)
FTLD公司337101 (29.97)63.0 ± 9.7 (29–85)21 (6.23)
FTLD–ALS公司237 (30.43)62.7 ± 10.0 (39–75)3 (13.04)
欧洲和法兰德斯-比利时组合
总计1205382（31.70）62.7 ± 9.2 (28–88)70 (5.81)
FTLD公司1118352 (31.48)62.8 ± 9.2 (28–88)49 (4.38)
FTLD–肌萎缩侧索硬化症8730 (34.48)61.4 ± 9.8 (31–83)21 (24.14)
一这组其他72名患者没有包括在总数中，因为他们不符合可能或可能的诊断标准。

表2

频率C9或72病理学G4C类2欧洲和法兰德斯-比利时队的扩张

自由贸易区FTLD–肌萎缩侧索硬化症总计
欧洲队列
总计50/7816.40%23/6435.94%73/8458.64%
家庭21/2518.37%11/2347.83%32/27411.68%
零星的13/3583.63%5/2718.52%18/3854.68%
其他一16/1729.30%2014年7月50.00%23/18612.37%
法兰德斯-比利时队列
总计21/3376.23%7/2330.43%28/3607.78%
家庭12/10111.88%6/785.71%108年18月16.67%
零星的9/2363.81%2016年1月6.25%10/2523.97%
欧洲和法兰德斯-比利时组合
总计71/11186.35%30/8734.48%101/12058.38%
家庭33/3529.38%17/3056.67%第50页，共382页13.09%
零星的22/5943.70%第6页，共43页13.95%28/6374.40%
其他一16/1729.30%7/1450.00%23/18612.37%
一其他包括欧洲队列中没有家族史数据的患者。

C9或72病理学G4C类2扩张

确定G的影响和分布4C类2在欧洲扩张，G4C类2通过正向RP-PCR测定重复长度(图1). A G公司4C类2欧洲队列中8.64%（73/845）出现扩张(表2). 每个临床亚组中，6.40%的FTLD和35.94%的FTLD-ALS患者携带病理性G4C类2扩展。在家族性患者中，总发病率增加到11.68%，FTLD患者的发病率为8.37%（21/251），FTLD-ALS患者为47.83%（11/23）。在散发患者中，总频率降至4.68%，FTLD的频率为3.63%（13/358），FTLD-ALS的频率为18.52%（5/27）。

评估G的分布4C类2我们计算了总体和每个临床表型，每个国家的突变频率（补充。表S2;表3). 在比利时、葡萄牙和意大利，病理性G4C类2扩展突变显示可比总频率在6.09%至7.86%之间，接近欧洲平均总频率8.38%。然而，在西班牙人（25.49%）和瑞典人（21.33%）的患者队列中观察到显著增加。相比之下，在德国患者中，只有3.52%是携带者。

表3

Meta分析C9或72西欧流行率研究

总计家庭零星的
国家总计n个载体n个运营商（%）总计n个载体n个运营商（%）总计n个载体n个运营商（%）荟萃分析中的研究
总计一26362639.9875614018.5218041136.26
比利时369297.861151916.52254103.94Gijselinck等人(2012)，欧洲EOD财团
丹麦821012.20不适用。不适用。不适用。不适用。不适用。不适用。Lindquist等人(2012)
芬兰752229.33271348.1548918.75Majounie等人(2012)
法国2003618502244150149.33Majounie等人(2012)
德国228114.826657.5816263.7欧洲EOD财团，Majounie等人(2012)
意大利345216.098655.81259166.18欧洲EOD财团
荷兰3403510.291163025.8622452.23Majounie等人(2012)
葡萄牙151106.629244.3559610.17欧洲EOD财团
西班牙511325.492063031722.58欧洲EOD财团
瑞典821720.7314857.1474912.16欧洲EOD财团，Majounie等人(2012)
英国713598.271702816.47543315.71Majounie等人(2012)

荟萃分析结合了欧洲EOD联合研究、Gijselinck等人、《柳叶刀神经病学》2012年研究【Gijselinc等人。，2012]，Majounie等人，《柳叶刀神经病学》2012年研究。，2012]，和Lindquist等人，《临床神经学研究》[Lindquister等人。，2012].

一来自捷克共和国、保加利亚和奥地利的欧洲EOD联合研究患者样本，以及来自撒丁岛的Majounie研究患者样本少于20名，因此被排除在荟萃分析之外。注意：信息不可用。

C9或72-相关临床和病理表型

共73 G4C类2欧洲队列中的扩张携带者中，50人被诊断为FTLD，23人被诊断患有FTLD–ALS。所有携带者的平均发病年龄为58.0±7.5岁，发病年龄范围为40-75岁，在FTLD和FTLD-ALS亚组中具有可比性（补充。表S3). 31名死亡携带者的平均病程为5.3±3.5年（范围为1至14年），但临床亚组之间存在差异。FTLD–ALS携带者的平均生存期缩短1.4年，为4.7±3.5年(n个=17，范围1-14年），而FTLD患者为6.1±3.6年(n个=14，范围1-14年）。23G的4C类2扩展载体，更广泛的临床信息可用于不同FTLD表型的亚类化。22例患者的临床表现符合bvFTD（95.65%），1例患者出现PNFA。尸检脑可用于11个欧洲G4C类2扩张运营商（两名葡萄牙人、五名西班牙人、一名奥地利人、一位捷克人和两名瑞典患者）。在所有11例患者中，我们在额叶和颞叶新皮质、海马和新纹状体中发现了TDP-43病理学，这与B型TDP蛋白病相一致[Mackenzie等人。，2010]. 因此，TDP-43免疫反应性神经元胞质内含物（NCI）和营养不良神经突起广泛分布于整个皮质厚度，但与较深的皮质层相比，NCI在第2层锥体细胞中更为明显。除TDP-43阳性病理学外，p62免疫阳性NCI还存在于海马齿状回颗粒层和小脑皮质颗粒层。此外，在海马CA4和CA3区的锥体神经元中观察到p62阳性的不规则颗粒NCI。

基因组复杂性C9或72地区

这个C9或72G公司4C类2重复序列与GC-rich，LCS相邻，包含C9或72成绩单NM_018325.3号(图1). 我们对法兰德斯-比利时队列中317名非血缘患者和752名对照组的GC-rich LCS进行了测序(图1). 我们在总共19个个体中观察到5-23个碱基对（bp）的杂合缺失，其中10个患者携带G4C类2扩张（10/27=37.04%），非携带者5例（5/290=1.72%），对照组4例（4/752=0.53%）；表4). 这些可变缺失在G基因携带者中更为常见4C类2与非携带者组相比扩张（OR=33.53；95%CI 10.31–109.09；P（P）<0.001）和对照组（OR=93.50；95%CI 28.53–306.39；P（P）< 0.001). 值得注意的是，10名扩张携带者中有9名（90.00%）表现出相同的杂合子10-bp GTGGTCGGG缺失（g.26747_26756 delGTGGT公司CGGGG；补充。图S1)在非携带者和对照组患者中未观察到(表4). 这个10 bp的缺失与G相邻4C类2重复并连接两个100%GC序列，从而扩展G的GC丰富基序4C类2用不完全重复重复(图1). 在这种情况下，令人惊讶的是GTGGT基序的删除(图1)在27名非血缘关系患者的所有10个缺失携带者中都发现有扩增的G4C类2重复（37.04%），非携带者仅1次（1/290=0.34%），对照组1次（1/1752=0.13%）；表4). 为了复制这些发现，我们成功地对欧洲队列中57名无关患者携带者和114名非携带者的LCS进行了测序。我们在患者携带者中观察到相当高的缺失和插入频率（indel）（14/57=24.56%），在非携带者中观察到相当高的缺失和插入频率（0/114，<0.88%；OR=36.79；95%CI 4.69–288.35；P（P）= 0.001;表4). 14名患者携带者中有7名（50.00%）出现相同的10 bp缺失，14名患者中有10名（71.43%）GTGGT缺失(表4). 值得注意的是，患有g.26747_26751del的FTLD患者的儿童GTGGT公司删除但没有扩增没有显示出从头扩增。该缺失位于5个重复单位的等位基因上。

表4

病理G携带者的低复杂度序列（LCS）指数4C类2法兰德斯-比利时和欧洲非航空公司的扩张

诊断个人数量Indel基因组突变名称一,b条
法兰德斯-比利时队列
患者扩展载体（10/27）
FTLD公司7g.26747_26756删除GTGGT公司CGGGG公司
FTLD–肌萎缩侧索硬化症2g.26747_26756删除GTGGT公司CGGGG公司
FTLD–肌萎缩侧索硬化症1g.26742_26764三角形GGGGCGTGGT公司CGGGGCGGCCCG公司
未扩张患者（5/290）
FTLD公司1g.26747_26751删除GTGGT公司
FTLD公司三g.26752_26762delCGGGGCGCC
FTLD-ALS系统1g.26752_26774delCGGGGCGGCCCGGGGCGCC
控件（4/752）
控制三g.26752_26762delCGGGGCGCC
控制1g.26746_26761德尔卡GTGGT公司CGGGGCGGGC公司
欧洲队列
患者扩展携带者（14/57）
FTLD公司6g.26747_26756删除GTGGT公司CGGGG公司
自由贸易区1g.26747_26751删除GTGGT公司
FTLD公司1g.26747_26768德尔GTGGT公司CGGGGCGGCCCGGGGG
FTLD公司1g.26753_26764delGGGCGCGCG
FTLD公司1g.26775_26776英寸
FTLD公司1g.26775_26776英寸
FTLD–肌萎缩侧索硬化症1g.26747_26756删除GTGGT公司CGGGG公司
FTLD–肌萎缩侧索硬化症1g.26746_26773删除CGTGGT公司CGGGGCGGCCCGGGGCGCGGGC
FTLD–肌萎缩侧索硬化症1g.26752_26762delCGGGGCGCC
一核苷酸序列GTGGT在邻近G的LCS中最常被删除4C类2在中重复C9或72（以粗体表示）。

LCS包含在正向RP-PCR分析产生的PCR片段中，以识别G4C类2扩展载体(图1)【Gijselinck等人。，2012]. 消除G中LCS可变性的影响4C类2扩增检测和确定正常重复等位基因的大小，我们在有义链上开发了一种反向RP-PCR分析(图1). 该分析证实了G的存在4C类2两组患者人数的增加。

法线尺寸C9或72G公司4C类2重复长度

我们使用STR基因分型分析（STR-PCR；图1)，以确定非携带者中正常等位基因和G中野生型等位基因的大小4C类2扩展载体。此外，我们使用了反向RP-PCR分析(图1)验证非扩张携带者中最长等位基因的大小。当我们比较两种分析之间的等位基因长度时，我们获得了99%的一致性。LCS缺失可以解释等位基因评分不一致。这意味着STR-PCR可以用于正确测定正常重复等位基因的大小。G的观测长度4C类2在法兰德斯-比利时队列的非扩张携带者中，重复频率为2至24个单位（g.26724GGGCC[2_24]；相对于反向补体AL451123.12号机组;图2A） 欧洲队列中有2到21个单位。最短等位基因比参考基因组少一个单位（NCBIbuild37–hg19；图1). 正常重复等位基因的频率分布呈三峰分布(图2A） ●●●●。使用R包MCLUST中实现的估计-最大化算法，这三个组可以通过4个和7个单位（2-3个单位，4-6个单位，7-24个单位）的截止值来定义，良好分类的概率为0.9944。

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一个：正常重复长度在佛兰德斯-比利时患者和对照个体中的分布。G的直方图4C类2在弗兰德斯-比利时患者中，重复单位小于60个重复，不包括已知致病基因突变或病理性G基因突变的患者4C类2扩张，与控制个体相比。B类：正常重复长度与rs2814707等位基因的相关性。G的直方图4C类2610个对照个体中的重复单位rs2814707 C等位基因纯合子和53个rs2814707T等位基因纯合子。

中间重复长度与9号染色体危险单体型

在法兰德斯-比利时队列中，我们先前计算出疾病与rs2814707风险T等位基因的显著相关性(P（P）=0.008）【Gijselinck等人。，2012]标记染色体9p风险单倍型。重复扩张携带者在归因风险中所占比例最大，但T等位基因纯合的非扩张携带器中仍存在残余关联信号（OR=1.75；95%CI 1.02–3.01；P（P）= 0.042; 补充。表S4)【Gijselinck等人。，2012]. 我们使用了三种不同的PCR基因分型检测来检测病理性G4C类2扩增，使得残余关联不太可能用缺失的突变携带者来解释。此外，我们还分析了C9或72对493例患者的所有外显子进行测序，并对413例患者进行基于外显子的假定缺失/重复分析，以检测其他突变。除了一个患者特有的错义突变（c.196A>T纳米_018325.3[p.Thr66Ser]）没有明确的硅内有害作用，没有发现其他致病性突变。当我们比较罕见的T等位基因和常见的C等位基因之间正常重复长度的分布时，我们观察到至少7个重复单位的等位基因与T-等位基因密切相关(P（P）< 0.001;图2B） 对应于等位基因组3的三峰频率分布。我们将该组（7–24个单位）定义为中间重复等位基因。排除中间等位基因纯合子个体后，当我们重新计算rs2814707与疾病的遗传关联时，残留关联消失(P（P）= 0.121; 补充。表S4). 然而，我们无法证明这些中间等位基因与疾病的直接关联（补充。表S5). 尽管与对照个体（22.6%；补充。表S5). 此外，纯合子中间重复序列携带者在患者组中的频率稍高（6.1%对4.6%）。

我们无法观察到支持中间重复不稳定并可能触发病理性G4C类2扩张，由于20个家系中年轻一代的指数患者中间重复等位基因高达22个单位，没有表现出更长的中间重复等位数或病理扩张。

报告者基因分析

评估重复长度对C9或72启动子活性，我们测量了含有C9或72启动子片段包含2、9、17和24个单位。我们证明，与包含2个单位的野生型等位基因相比，具有9、17和24个单位的片段之间的RLA显著降低(P（P）<0.001），在含有启动子的24个单位中最大减少52%(图3). 这些数据表明，中间重复等位基因导致C9或72启动子活性与野生型等位基因的比较。

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的转录活性C9或72具有不同重复长度等位基因的启动子。条形图表示相对高斯（Gaussia）/海萤荧光素酶活性（RLA）C9或72与野生型等位基因相比，构建了2个单位，用于增加重复单位的数量。数值代表36个独立测量值相对于2个单位野生型等位基因的平均值（±SDEV）。使用Mann–Whitney计算表达差异的显著性U型测试。P（P）值显示在条形图上方。

讨论

在本研究中，我们评估了病理性G的地理分布4C类2在一个新成立的欧洲EOD联盟内确定的来自意大利、德国、葡萄牙、瑞典、西班牙、捷克共和国、保加利亚、奥地利和比利时的泛欧FTLD患者扩展队列。病理性G的患病率4C类2整个欧洲队列（73/845，8.64%）以及仅FTLD（50/781，6.40%）和FTLD–ALS（23/64，35.94%）亚组的扩增频率与其他亚组相似，我们在关于C9或72[Dejesus-Hernandez等人。，2011; Gijselinck等人。，2012; Renton等人。，2011].

欧洲人群中的FTLD综合征4C类2扩张型携带者最常见的特征是行为障碍（95.7%），这与我们在比利时的一项深入的基因型-表型相关性研究中的观察结果一致C9或72运营商[Van Langenhove等人。，2012年b]. 32%的扩张携带者也出现了伴随的ALS症状。此外，我们观察到发病年龄和疾病持续时间的范围很广，这表明遗传和/或环境（表观遗传）疾病修饰物[Van Langenhove等人。，2012年b]. 13 G的4C类2扩张载体、死后神经病理学诊断证实了TDP-43内含物的脑沉积，解释了30.23%（13/43）的TDP-43阳性患者。因为高达70%的TDP病理患者在治疗后仍未解决C9或72分析后，我们对其他TDP-43相关基因进行了突变分析GRN公司,VCP公司、和TARDBP公司。这揭示了另外一个TARDBP公司巴塞罗那脑库患者的p.Ile383Val突变。有趣的是，这种位于蛋白C末端的突变以前在一个美国ALS家族中被报道过一次[卢瑟福等人。，2008]然而，在这名西班牙患者诊断为SD的患者中，发病年龄为60岁，死亡年龄为75岁，父亲患有痴呆症，没有记录到MND的临床或病理症状。总的来说，在43名TDP-43病理患者中，67.44%（29/43）的患者仍未被已知基因解决。在17例家族性TDP患者中，这占58.82%（10/17）的患者没有已知突变，表明至少有一个，但可能更多的其他TDP-43相关基因尚未发现。十一C9或72TDP-43阳性病理携带者被提交进一步的组织病理学评估。尽管C9或72已证明比最初预期的更加多样化（报告包括强烈的TDP蛋白病，令人联想到FTLD-TDP A型[Murray等人。，2011; Snowden等人。，2012; Stewart等人。，2012]，完全没有TDP-43病理学【Gijselinck等人。，2012; Murray等人。，2011]（在Cruts等人，Trends Neurosci，正在修订），我们研究中的患者都符合TDP蛋白病B型的标准[Mackenzie等人。，2010]尽管损伤负荷相对较低。11名患者中有8名同时出现AD病理，但AD分期相对较轻（Braak I–III期为神经原纤维缠结病理，B期为β-淀粉样蛋白病理），这一发现可能与年龄有关，而不是与C9或72扩展。在5例p62抗体染色的病例中，100%在海马齿状回、海马CA4和CA23锥体神经元以及小脑颗粒皮质层中显示免疫反应性NCI。由于这种病变负荷远比TDP-43病变明显，可以假设p62病理学的存在是C9或72-相关FTLD[Al-Sarraj等人。，2011]. 在最近的另一次大规模筛查中C9或72重复Majounie等人的扩展(2012)据报道，共有4448名ALS患者和1425名FTLD患者来自欧洲和美国白种人，与其他种族背景的小组患者进行比较。与本研究相关的是，Majounie研究包括来自英国、荷兰、法国、芬兰、德国、撒丁岛和瑞典的FTLD患者。除了少数德语(n个=29）和瑞典语(n个=7）患者，我们的研究中没有这些国家的代表，反之亦然。此外，在丹麦进行的一项研究确定了10个C9或7282名丹麦FTLD患者队列中的扩张携带者[Lindquist等人。，2012]. 为了更具代表性地了解C9或72在西欧的重复扩张中，我们对欧洲EOD联合研究中的FTLD队列进行了荟萃分析(n个=845），我们之前报道的法兰德斯-比利时队列(n个=360）【Gijselinck等人。，2012]，Majounie研究(n个=1381）[Majounie等人。，2012]和林德奎斯特研究(n个=82）[Lindquist等人。，2012]. 这导致了来自15个欧洲国家的2668名FTLD患者的患病率(表3，患者组小于20的国家未纳入荟萃分析）。The overall frequency of theC9或72病理学G4C类2西欧的FTLD总扩张率为9.98%，家族性FTLD扩张率为18.52%，散发性FTLDs扩张率为6.26%。从各国分布来看，比利时、意大利、荷兰、葡萄牙和英国的平均总流行率为6.09%至10.29%。丹麦的患病率略有上升，为12.20%，而法国的患病率大约是平均患病率18.00%的两倍。与9号染色体的斯堪的纳维亚创始人效应假说一致-C9或72单倍型[Mok等人。，2011]，频率最高的是芬兰（29.33%），最高的是瑞典（20.73%）。然而，与此假设和创始人单倍型流行的预期南北轴相反C9或72西班牙达到25.49%。另一个极端是，德国的患病率仅为4.82%。值得注意的是，爱尔兰、卢森堡、瑞士、波兰、挪威和希腊尚未参与此西欧元分析。

我们使用两种不同的分析方法精确地确定了法兰德斯-比利时和欧洲队列中重复等位基因的正常范围，并观察到了2到24个单位之间的范围。等位基因频率呈三峰分布，长尾巴包含罕见的较长等位基因。这种三态分布的第3组中的等位基因（中间等位基因；7-24个单位）几乎只存在于rs2814707 T等位基因标记的9号染色体风险单倍型上。我们提出了这样一个问题：这些等位基因是否可能是FTLD疾病易感性的风险因素，或者对基因表达有轻微影响。虽然中间重复等位基因与法兰德斯-比利时队列中的疾病没有显著相关性，但与对照个体相比，患者的频率略有增加，这解释了我们观察到的rs2814707 T等位基因纯合子携带者的残余相关性（OR=1.75；95%CI 1.02–3.01；P（P）=0.042）。该队列中包括16名FTLD-ALS患者，无病理扩张。尽管这是一个小群体，但值得注意的是，32个等位基因中有7个（21.9%）至少有10个单位，这显著高于对照个体的7.2%（OR=3.685；95%CI 1.560–8.706；P（P）= 0.003). 这表明中间等位基因可能对涉及ALS的疾病有风险影响。因为收集欧洲队列是为了进行重复扩展的频率研究，所以我们没有种族匹配的对照个体进行关联研究。

与较短重复序列携带者相比，中间重复序列的法兰德斯-比利时和欧洲患者携带者（7-24）没有显示出更早的发病年龄（2-6；数据未显示）。此外，病理性G4C类2扩展[Gijselinck等人。，2012]与亨廷顿病患者的研究结果相比，不能用野生型等位基因中重复单位数量的修正效应来解释（数据未显示）[Aziz等人。，2009].

G的机制4C类2中间重复序列可能有助于疾病的发病机制尚不清楚。在本研究中，我们进行了报告基因表达研究，以根据中间重复序列的大小评估其对C9或72启动子活性。我们提供了令人信服的证据，证明C9或72随着重复单位数量的增加，启动子显著减少，与野生型等位基因上的2个单位相比，含有启动子的24个单位最多减少52%(图3). 为了更好地区分转录活性明显下降的截止点，应该研究更多不同长度的等位基因，尽管从这些数据可以清楚地看出，中间等位基因影响正常转录活性C9或72发起人。通过克隆中间等位基因，我们没有达到致病性扩展等位基因中预期的几乎0的表达水平。因此，单位数大于24的个体需要更好地解释正常和扩展等位基因之间的灰色地带。这些体外数据证实了G4C类2重复序列位于C9或72正如我们之前所建议的[Gijselinck等人。，2012]. 它也支持基于50%减少C9或72病理性扩张携带者大脑中阻止突变等位基因表达的水平[Gijselinck等人。，2012]. 然而，在本研究中，除了一个没有明确致病性的患者特异性错义突变（p.Thr66Ser）外，我们没有发现其他指向功能丧失机制的简单序列突变或缺失/重复。因此，其他分子机制也可能导致疾病，包括RNA结合蛋白的隔离和RNA毒性[Dejesus-Hernandez等人。，2011]这也可能导致mRNA水平下降。这两种潜在的疾病机制并不是相互排斥的，它们还可能共同导致额叶皮层（FTLD）或脊髓（ALS）神经元群的退化。

通过什么机制G4C类2重复性扩大到病理大小范围尚待发现。在我们的第一次C9或72法兰德斯-比利时队列研究[Gijselinck等人。，2012]，我们发现大多数病理性G4C类2扩增位于由SNP rs2814707的罕见T等位基因标记的相同风险单倍型上，并且与FTLD和ALS密切相关。这些观察结果在欧洲研究中得到了证实，100%的欧洲病理性G4C类2扩张携带至少一个T等位基因。有人提出，这种紧密的遗传联系可能是由该风险单倍型上的单一创始者突变所解释的[Mok等人。，2011; Majounie等人。，2012]. 另一种假设是，这种风险单倍型的特定基因组背景使G4C类2重复次数不太稳定，更容易扩大到病理大小范围。在这方面，我们和其他人[Dejesus-Hernandez等人。，2011]表明G4C类2在同一风险单倍型中，中间重复序列的表达也极为显著，这表明这些中间重复序列更容易出现复制滑动和不稳定的遗传，从而引发病理扩张。之前在其他重复扩张性疾病中也观察到中间等位基因与特定SNP等位基因具有相同的连锁不平衡，例如脆性X综合征[Gunter等人。，1998]. 病理性G的出现4C类2本研究和以往研究中明显散发患者的扩张[Dejesus-Hernandez等人。，2011; Gijselinck等人。，2012; Renton等人。，2011]，似乎支持这一假设。然而，我们无法观察到G的增加4C类2重复长度或从头开始扩展在年轻一代的指数患者家系中，中间重复长度可达22个单位。因此，中间等位基因可能被认为是在可能的多代中进一步逐步扩展的易感等位基因，而不是预突变。一项使用零星ALS三人组的研究也没有显示出两代人之间重复不稳定的证据【Pamphlett等人。，2012].

此外，我们在法兰德斯-比利时和欧洲队列的患者中观察到病理性G4C类2扩展，G附近富含GC-的LCS中短indels的频率明显较高4C类2重复（24/84，28.57%）与非携带者（5/404，1.24%；P（P）<0.001）和对照组（4/752，0.53%；P（P）< 0.001). 值得注意的是，在23.81%（20/84）的重复扩展载体中，与G相邻的GTGGT基序缺失4C类2重复包含在indel中(图1)相比之下，非携带者为0.25%，对照组为0.13%(表1). 此GTGGT缺失连接了两个GC丰富序列，增加了LCS的总GC含量。这已经在CAG扩张性疾病中得到报道，其中重复序列的扩张性随着周围DNA序列GC含量的增加而增加【Brock等人。，1999; 内斯特和蒙克顿，2011]. 此外，删除GTGGT会创建一个长连续的不完美G4C类2重复，这可能更容易导致复制延迟。因此，GTGGT序列可能是G的重要稳定剂4C类2重复。这类似于不稳定脆性X等位基因中AGG散布的丢失[Kunst和Warren，1994; Larsen等人。，2000]. 此外，LCS中GTGGT缺失的所有携带者至少有一个rs2814707 T等位基因，10 bp缺失与G基因共传递4C类2两个扩张携带者亲属的扩张，这表明它可能位于风险单倍型上，并可能触发扩张。然而，应该注意的是，并非所有的病理性G4C类2扩展也有一个LCS indel，因此我们不能排除这些indel是扩展的紧密邻域破坏基因组区域稳定的结果。值得注意的是，在非膨胀载体中发现的indels大多不影响GTGGT序列，而是通过删除100%GC-rich序列来稳定重复序列。一名无重复扩增的FTLD患者的GTGGT缺失位于一个具有5个单位的短等位基因上，该等位基因可能不稳定，不足以扩增。中间等位基因上的GTGGT缺失很可能不稳定，因此无法观察到。

更好地理解导致G4C类2不稳定性对于评估疾病风险和提高临床效益至关重要。进一步说明G4C类2扩张导致疾病对于揭示疾病过程中的生物途径和关键分子作为未来治疗的靶点至关重要。

致谢

作者感谢来自欧洲EOD联盟和BENNEU联盟的参与者对本研究的贡献。此外，我们感谢VIB基因服务设施的工作人员(http://www.vibgeneticservicefacility.be)以支持遗传分析。IWT向T.V.L.和S.P.提供博士研究金，FWO向I.G.和J.V.d.Z提供博士后研究金。

显露陈述：作者报告说，与报告的调查结果没有利益冲突。

附录

为本文数据提供信息的欧洲EOD联盟成员：

比利时安特卫普VIB分子遗传学系神经变性脑疾病组：朱莉·范德泽（Julie van der Zee）、伊尔塞·吉塞林克（Ilse Gijselinck）、卢比娜·迪伦（Lubina Dillen）、蒂姆·范兰格霍夫（Tim van Langenhove）、杰西·登斯（Jessie Theuns）、斯特芬妮·菲尔特詹斯（Stéphanie Philtjens）、克里斯特尔·斯莱格斯（Kristel Sleegers）、韦勒·巴努默（Veerle Bäumer）、吉塔·梅；神经基因组学组：阿尔贝娜·乔丹诺娃

比利时安特卫普大学博恩·邦格研究所神经遗传学实验室：朱莉·范德泽（Julie van der Zee）、伊尔塞·吉塞林克（Ilse Gijselinck）、卢比娜·迪伦（Lubina Dillen）、蒂姆·范兰格霍夫（Tim van Langenhove）、斯特凡妮·菲尔特詹斯（Stéphanie Philtjens）、杰西·登斯（Jessie Theuns）、克里斯特尔·斯莱格斯（Kristel Sleegers）、韦勒·巴库默；神经化学与行为实验室：塞巴斯蒂安·恩格尔博格斯（Sebastian Engelborghs）、彼得·德德恩（Peter P.De Deyn）；神经生物学实验室：帕特里克·克拉斯

比利时安特卫普Middelheim和Hoge Beuken医院网络神经和记忆诊所：塞巴斯蒂安·恩格尔博格斯（Sebastian Engelborghs）、彼得·德德恩（Peter P.De Deyn）

比利时鲁汶鲁汶大学大脑与情感实验室：马修·范登布尔克；认知神经学实验室：Rik Vandenberghe

比利时鲁汶大学医院，鲁汶Gasthuisberg，精神病学系：马修·范登布尔克；神经病学系：Rik Vandenberghe

意大利布雷西亚布雷西亚大学神经科衰老脑和神经退行性疾病中心：芭芭拉·博罗尼、亚历山德罗·帕多瓦尼、西尔瓦娜·阿切蒂

德国慕尼黑慕尼黑科技大学精神病学和心理治疗系：Robert Perneczky，Janine Diehl-Schmid

德国图宾根赫蒂临床脑研究所和神经病学中心神经变性系：Matthis Synofzik、Walter Maetzler、Jennifer Müller vom Hagen、Ludger Schöls

德国图宾根大学德国神经退行性疾病研究中心：马蒂斯·西诺夫齐克（Matthis Synofzik）、沃尔特·马兹勒（Walter Maetzler）、詹妮弗·米勒（Jennifer Müller vom Hagen）、卢杰·舍尔斯（Ludger Schöls）；德国波恩大学：Michael T.Heneka、Frank Jessen、Alfredo Ramirez、Delia Kurzwelly、Carmen Sachtleben、Wolfgang Mairer

葡萄牙里斯本里斯本大学医学院分子医学研究所：亚历山大·德门登萨（Alexandre de Mendonça）、加布里埃尔·米尔顿伯格（Gabriel Miltenberger-Miltenyi）、索尼娅·佩雷拉（Sónia Pereira）、克拉拉·菲尔莫（Clara Firmo）

葡萄牙里斯本里斯本大学医学院：何塞·皮门特尔

西班牙巴塞罗那医院诊所神经内科阿尔茨海默病和其他认知障碍科：拉奎尔·桑切斯·瓦莱、阿尔伯特·拉多、安娜·安东内尔、何塞·莫里尼埃沃

西班牙巴塞罗那August Pi i Sunyer生物研究所（IDIBAPS）Biobanc医院诊所：Ellen Gelpi

瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡研究所KI’Alzheimer病研究中心，神经生物学、护理科学和社会部：Caroline Graff、Huei-Hsin Chiang、Marie Westerlund；NVS部门：夏洛特·福赛尔（Charlotte Forsell）、莉娜·利利乌斯（Lena Lillius）

瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡大学医院遗传科老年医学部：卡罗琳·格拉夫（Caroline Graff）、安妮·金胡特（Anne Kinhult Stáhlbom）、哈坎·通伯格（Hákan Thonberg）；临床细胞学与病理科：Inger Nennesmo

哥德堡大学萨勒格伦斯卡学院神经科学和生理研究所精神病学和神经化学系：Anne Börjesson-Hanson

意大利佛罗伦萨大学神经病学和精神病学系：Benedetta Nacmias、Silvia Bagnoli、Sandro Sorbi、Valentina Bessi、Irene Piaceri

葡萄牙科英布拉科英布拉科英布拉里奥大学中心医院神经病学系：Isabel Santana，Beatriz Santiago

葡萄牙科英布拉科英布拉斯大学医学院：伊莎贝尔·桑塔纳、玛丽亚·海伦娜·里贝罗；神经科学和细胞生物学中心：玛丽亚·罗萨里奥·阿尔梅达（Maria Rosário Almeida）、卡塔丽娜·奥利维拉（Catarina Oliveira）

葡萄牙波尔图波尔图医科大学圣约昂医院神经病学中心和临床神经科学与心理健康系：卡罗来纳州加雷特市Joáo Massano

葡萄牙亚速尔群岛Angra do Heroísmo医院：Paula Pires

流行病学神经成像和远程医学实验室&阿尔茨海默病和精神病国家中心，IRCCS Centro San Giovanni di Dio，FBF，Brescia，Italy：乔瓦尼·弗里索尼、奥拉齐奥·萨内蒂、克里斯蒂安·博维奇尼

保加利亚索非亚索非亚医科大学神经病学系：Stayko Sarafov，Ivailo Tournev；生物化学系分子医学中心：Albena Jordanova

保加利亚索非亚新保加利亚大学认知科学与心理学系：伊瓦伊洛·图涅夫

奥地利维也纳医科大学神经病学研究所：Gabor G.Kovacs，Thomas Ströbel

德国波恩大学临床神经科学部神经病学系：Michael T.Heneka、Frank Jessen、Alfredo Ramirez、Delia Kurzwelly、Carmen Sachtleben、Wolfgang Mairer；精神病学系：弗兰克·杰森

捷克共和国布拉格Thomayer医院病理和分子医学部：Radoslav Matej，Eva Parobkova

德国慕尼黑大学路德维希·马克西米利安神经病学系：阿德里安·丹尼尔；Zentrum für神经病理学与朊福松：托马斯·阿兹伯格

意大利维罗纳大学神经、神经心理、形态学和运动科学系神经病理科：Gian Maria Fabrizi，Silvia Testi

维罗纳综合大学神经科Completsa di Neuropatologia d'U手术室：塞尔吉奥·费拉里（Sergio Ferrari）、蒂齐亚娜·卡瓦拉罗（Tiziana Cavallaro）

比利时列日列日大学回旋加速器研究中心和神经病学系：埃里克·萨尔蒙

比利时根特大学根特医院和根特大学神经病学系：Patrick Santens

比利时Edegem安特卫普大学医院神经内科：帕特里克·克拉斯

补充材料

免责声明：补充材料已经过同行审查，但未进行复制。

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