骨桥蛋白是SOX9的新下游靶点，对人类肝纤维化进展具有诊断意义

摘要

肝纤维化的特征是细胞外基质（ECM）过度沉积。其中一种主要的细胞类型是肝星状细胞（HSC）。^1,2作为对损伤的反应，HSC被激活为增殖性肌成纤维细胞，迁移到周围的薄壁细胞，并分泌组织损伤ECM，其主要成分是1型胶原（COL1）。此外，ECM含有促进细胞增殖、迁移和分化的复杂蛋白质混合物。具有这种作用的一种ECM成分是基质细胞糖磷酸蛋白，即骨桥蛋白（OPN），也称为分泌性磷酸蛋白1。

OPN在广泛的组织和体液中被检测到，在发育过程中（例如，在骨骼、胆管形成和血管重塑过程中）、免疫系统调节和伤口修复中发挥生理作用。^三然而，它也与癌症和炎症相关的病理过程有关。^三,4OPN介导如此多种细胞功能的能力可能与其广泛的翻译后修饰以及通过几个整合素和CD44变体受体发出信号的能力有关。^三,5

OPN导致皮肤伤口结疤⁶与肺、肾和心脏纤维化有关。^7-9以前在活化的HSC中检测到它，在那里它被认为是介导细胞迁移。¹⁰最近，OPN水平被强调为肝脏疾病的潜在生物标志物，其水平与疾病的严重程度相关，^11-13据报道，它可以促进非酒精性脂肪性肝炎的纤维化进展。¹⁴后一项研究以及其他研究，¹⁵已证明对OPN公司Hedgehog（Hh）信号传导的表达，由胶质母细胞瘤（GLI）转录因子家族成员GLI1介导，与OPN公司发起人。¹⁵有三种GLI转录因子，通过父转录物的选择性剪接产生不同激活物和阻遏物形式的GLI2和GLI3。¹⁶

之前，我们已经证明，转录因子，性别决定区Y-box 9（SOX9），在活化的HSC中外显表达，在HSC中负责COL1的生成。¹⁷在发育过程中，SOX9对编码ECM蛋白的许多基因的表达具有不同的调节作用。¹⁸SOX9还与影响皮肤、肾脏和心脏的纤维化病理相关。^18-23

在本研究中，我们发现OPN和SOX9共同定位于健康肝脏中的胆道细胞和纤维化组织的相同区域。在HSC激活期间，当GLI1似乎不太可能调节时，两者都显著增加OPN公司相反，我们证明SOX9位于GLI2的下游，负责OPN公司表达式。这些数据支持SOX9在肝纤维化进展过程中作为关键纤维化ECM成分的调节器发挥作用，并表明操纵SOX9或其下游靶点可能是开发抗纤维化治疗的一种手段。此外，SOX9的其他ECM靶点的识别可能作为肝病纤维化严重程度的生物标记物具有额外的用途，类似于最近关于OPN的研究。^11,12

材料和方法

结果

SOX9和OPN在人和鼠胆道和肝纤维化中的表达

在胎儿和成人肝脏的胆道上皮细胞的圆形细胞核中检测到SOX9，并证明其与OPN的细胞共定位(图1和支持图1). 先前的数据已独立确定OPN^11,12,14和SOX9¹⁷在动物模型的肝纤维化区域。在大鼠和小鼠肝纤维化模型中，Sox9核定位于结蛋白阳性细胞，证实其存在于HSC中(图2A） 。Opn以Sox9定位于纤维化区域具有细长细胞核的纺锤形HSC以及胆道细胞(图2B） 。体外，在缺乏Sox9的静止rHSC中几乎未检测到Opn(图3A、 B和支持图2A、B). 然而，据其他人报道，^10,14Opn（操作）当rHSC在组织培养塑料上被激活2周后，表达被诱导至60倍，其蛋白增加，与Sox9的诱导和Col1的连续增加平行(图3A、 B）。使用人类细胞系LX2、在体外星状细胞模型。²⁶在模拟星状细胞活化的高血清条件下，OPN与SOX9一起增加(图3C-E）。证实了OPN细胞与SOX9在活化的rHSC和hHSC中的共定位在体外使用免疫荧光（IF）。核SOX9被OPN或α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）包围(图4). 这些数据让我们怀疑SOX9是否能够调节OPN公司.

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图1

健康肝脏中SOX9和OPN的IHC。大鼠和人类（受孕18周[wpc]和成年期）健康肝脏的连续5μm切片进行SOX9和OPN（棕色）染色，并用托洛定蓝进行复染。注意，仅在胆道上皮细胞的圆形细胞核（SOX9）和细胞质（OPN）中检测到。尺寸条代表50μm。

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图2

纤维化肝脏中SOX9、OPN和结蛋白的IHC。（A） 大鼠和小鼠纤维化组织中的双重IF在胆道细胞（星号）和结蛋白细胞质染色细胞（绿色）（白色箭头）中显示核Sox9（红色）。（B） 用Sox9和Opn（棕色）染色的纤维化大鼠和小鼠肝脏连续5μm组织切片用甲苯胺蓝复染。请注意，Sox9和Opn在具有更多纺锤形细胞核的细胞（箭头）以及胆道细胞（星号）中的位置类似。尺寸条代表100μm。

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图3

激活HSC中SOX9和OPN的表达。（A-E）通过qPCR（A和C）和免疫印迹（B、D和E）（在[A]中，Sox9指数上调了8.0倍）。在（B）中，Sox9、Opn和Col1的诱导是在培养物中rHSC激活期间显示的（相对于静止状态；第0天）。（B）和（D）的代表性免疫印迹图像分别显示为插图（B）或单个图像（E）。所有免疫印迹定量均归一化为β-肌动蛋白*P（P）< 0.05; †P（P）与静止的第0天细胞（A和B）或0%血清（C和D）相比。

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图4

激活的hHSC和rHSC中SOX9和OPN的表达。在大鼠和人类激活的HSC（aHSC）中，IF显示核SOX9（红色）和细胞质α-SMA（绿色；左侧面板）或OPN（绿色；右侧面板）。尺寸条代表20μm。

Sox9负责激活HSC中Opn的表达

确定Sox9是否监管Opn（操作）表达，我们在激活的rHSC中使用siRNA废除Sox9。Sox9减少了70%-80%，导致操作转录本及其编码蛋白(图5A、 B）。在LX2 HSC线路中检测到类似结果(图5C） ●●●●。生物信息学分析操作网络5′侧翼区域在转录起始位点上游识别出一个保守的SOX9结合基序～3千碱基对(图5D） ●●●●。ChIP证明Sox9在激活的rHSC和人类LX2细胞中都在该位点富集(图5E；阴性对照数据GAPDH公司如支持中所示图3). 这些数据表明OPN是SOX9的一个新的下游靶点。因为其他人认为Hh途径与肝纤维化有关³³作为监管机构OPN公司表达式，^14,15因为在不同的情况下，Hh信号下游已经报告了SOX9，¹⁸我们很好奇地研究，作为测定OPN生成的一种手段，SOX9是否可能由星形细胞中的Hh调节。

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图5

SOX9对HSC中OPN的调节。（A-C）消除激活的rHSC（A和B）和LX2细胞（C）中Sox9的siRNA，以防干扰mRNA（A）和蛋白质（B和C）的siRNA控制。免疫印迹示例如（B）和（C）所示*p<0.05**P（P）< 0.01; †P（P）< 0.005; ‡P（P）<0.001，与对照组相比。（D） 上游线路操作网络具有保守SOX9-结合基序的增强子区域以黑色突出显示（显示的人类序列相对于转录起始点为−3886到−3842碱基对）。用星号（*）表示的保守核苷酸。核心SOX结合基序是CAAT，通过额外的侧翼核苷酸对SOX9具有更强的结合亲和力。⁴⁹（E） 保守上游SOX9-结合元件的ChIP分析OPN公司高血清培养的LX2细胞和活化的rHSC中的增强因子。阴性对照为免疫球蛋白G（IgG），阳性对照为输入（稀释10倍）。

Hh信号调节SOX9及其下游靶点OPN

血清激活的LX2细胞和在培养中激活的rHSC与Hh拮抗剂、CYC或激动剂SAG孵育10天(图6A-D和支持图4A、B). 在两种星状细胞模型中，响应CYC，SOX9和OPN蛋白均显著降低45%-60%，SAG处理后增加了约2-3倍。这些数据表明，星形细胞中的Hh信号对OPN和SOX9都有正向调节。为了揭示SOX9作为Hh对OPN产生影响的介质的作用，我们在SAG增强Hh信号后在LX2细胞中使用siRNA(图6E和支持图4C). 与二甲基亚砜（DMSO）对照组相比，SAG诱导SOX9和OPN蛋白增加，而二甲基亚磺酸盐（DMSO）对照组不受对照siRNA的影响。然而，siRNA消除SOX9阻止Hh激动剂使OPN水平增加到DMSO对照值以上。为了进行相反的实验，瞬时转染含有人SOX9标准执行编码序列以过度表达SOX9标准在LX2电池中（支持图4D). SOX9的过度表达挽救了CYC对OPN生成的抑制作用(图6F） ●●●●。总的来说，这些数据表明SOX9是星形细胞Hh信号下游OPN生成的正调节因子。

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图6

Hh调节HSC中SOX9和OPN的表达。用Hh拮抗剂CYC或Hh激动剂SAG治疗24小时后，通过活化rHSC和LX2细胞的免疫印迹定量（A-D）SOX9和OPN蛋白水平。（E） 在LX2细胞中，用SAG处理24小时并用siRNA或干扰对照击倒SOX9（87%）后，SOX9和OPN的蛋白质水平。（F） 在有或无CYC的LX2细胞中SOX9过度表达后OPN蛋白的定量。插图中显示的免疫印迹图像示例。在所有实验中，将表达变化与载体处理细胞（DMSO）进行比较，在（F）的情况下，将EV控制。针对β-肌动蛋白的实验标准化*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01; †P（P）< 0.005; ‡P（P）<0.001，与对照组相比。

Hh介体GLI2调节SOX9表达

已知GLI转录因子家族介导Hh信号传导的作用。¹⁶为了确定哪种GLI因子可能负责Hh对SOX9表达的影响，我们首先研究了静止和激活rHSC中家族成员的表达。通过qPCR，胶质细胞1在静止HSC中检测不到，激活后未发生改变(图7A） ●●●●。相反，Gli2公司和Gli3公司激活细胞中的mRNA分别增加了约6倍和约50倍。尽管通过分析，GLI3公司似乎更可能成为监管的候选者SOX9标准在星状细胞中，mRNA的检测并不代表蛋白质水平，特别是考虑到GLI2和GLI3的阻遏物或激活物形式的潜力。我们可以获得几种商业和公开的抗体^29,34,35; 然而，我们发现它们在通过免疫印迹检测或区分不同形式方面没有帮助。因此，我们研究了GLI2和GLI3对SOX9标准和OPN公司用siRNA在LX2细胞中表达(图7B、 C）。减少GLI2型转录物显著减少约67%SOX9标准和OPN公司表达分别为～43%和～64%(图7B） ●●●●。相比之下，尽管在GLI3公司siRNA表达（～86%），SOX9标准表达受到的影响较小OPN公司未更改(图7C） ●●●●。此外，组成活性GLI2（GLI2ΔN）的过度表达能够至少部分缓解CYC对SOX9和OPN生成的拮抗作用(图8A、 B和支持图5A). 相反，在CYC存在下过度表达GLI3激活物形式（GLI3A）对SOX9或OPN的产生几乎没有或没有积极影响(图8C、 D和支持图5B). 这些数据表明GLI2是SOX9标准HSC表达。与这些结果一致，在活化的rHSC中检测到针对Gli2的核免疫反应在体外CCl后纤维化区域₄治疗体内(图8E） ●●●●。有趣的是，与Sox9和Opn类似的胆道上皮细胞的圆形细胞核中也检测到Gli2(图8E、 箭头）。相反，尽管在人类胎儿发育期间在对照脑组织中检测到Gli3的核免疫反应，但在纤维化大鼠组织中这种染色并不明显（数据未显示）。

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图7

Gli2介导HSC中Sox9和Opn的表达。（A） 的表达式格利qPCR检测静止和活化rHSC中的因子。（B和C）用于LX2细胞中GLI2（B，67%敲除）和GLI3（C，86%敲除*P（P）< 0.05; †P（P）< 0.005; ‡P（P）<0.001，与干扰siRNA处理相比。

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图8

Gli2过度表达可缓解CYC对HSC中Sox9和Opn表达的拮抗作用。（A-D）在存在或不存在CYC的LX2细胞中过表达组成活性GLI2（GLI2ΔN；A和B）或活性GLI3（GLI3A；C和D）后SOX9和OPN蛋白的定量。（E） IF在活化的rHSC（aHSC）中显示核Gli2（红色）和细胞质α-Sma（绿色），在CCl中显示亮场IHC显示核Gll2（棕色染色）₄-治疗纤维化大鼠肝脏。箭头表示胆管中Gli2的表达*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01; †P（P）< 0.005, ‡P（P）<0.001，与EV转染相比。尺寸条代表20μm。

讨论

OPN被认为是一种重要的介质，炎症反应最终导致各种器官的瘢痕形成和纤维化，^6-10,14其在循环中的存在可能被用作疾病进展的生物标志物。^11-13此前，我们证明了转录因子SOX9在肝纤维化模型中的新作用。在转化生长因子-β（TGF-β）信号转导的影响下，SOX9在活化的HSC中表达，并在HSC中生成纤维前胶原COL1。¹⁷在这项研究中，我们通过调节OPN公司表达式。在肝脏中，SOX9和OPN共同定位于纤维化区域。rHSC激活期间OPN产生的开始，Sox9废除后激活HSC的减少，以及Sox9与上游的结合OPN公司增强子元件推断转录因子是OPN公司在肝纤维化过程中表达。

在我们的肝纤维化模型中，SOX9对Hh信号有反应。尽管Hh的确切角色体内在肝纤维化期间仍不完全了解，^36,37成人组织损伤后，信号通路被重新激活³⁸并且HSC可以产生Hh配体并对其作出反应。^30,39几条证据表明SOX9位于Hh信号的下游。SOX9在软骨形成过程中以及在神经干细胞、皮肤和肠道中被Hh配体上调。¹⁸锌指转录因子GLI家族在哺乳动物中介导Hh信号传导。¹⁶GLI1通常被认为是转录激活物，而GLI2和GLI3在蛋白水解裂解后具有额外的潜在N末端阻遏物功能。有几个保守的GLI结合基序对SOX9标准在其延伸的5′侧翼区域表达（高达1.1 Mb）。^18,40而Gli1似乎对Sox9指数软骨形成过程中的表达⁴¹以及SOX9对OPN公司在恶性黑色素瘤中的表达，¹⁵转录因子在我们的肝纤维化模型中检测不到。相反，Gli2在小鼠胰腺β细胞脱分化过程中增加了Sox9。⁴²在这里，我们证明了GLI2在调节SOX9标准和OPN公司在肝纤维化模型中。这与其他人检测到的肝脏Gli2一致。³³然而，与GLI2对OPN公司，我们的集体数据表明，GLI2通过SOX9在其OPN生产调节中发挥重要作用。这种机制还可能扩展到上调SOX9标准由于GLI2是由TGF-β在多种细胞类型中诱导的，包括成纤维细胞、角质形成细胞和癌细胞。⁴³

在健康肝脏中，SOX9和OPN均位于胆管。SOX9是正常胆道形成和功能所必需的。^44,45从我们的数据来看，SOX9似乎也可能负责健康胆管细胞产生OPN。此外，基于SOX9在调节COL1中的额外作用¹⁷和胶原蛋白4型（COL4），²³SOX9可能通过调节所有这些ECM成分，作为原发性胆汁性肝硬化（PBC）和原发性硬化性胆管炎病理学的一部分，在慢性胆汁淤积性肝损伤中发挥重要作用。有趣的是，TGF-β和Hh信号转导（包括Gli2）都会上调SOX9，这与PBC的纤维化反应有关，^46,47其中COL1、COL4和OPN均增加。⁴⁸

总之，这些数据扩大了SOX9在调节ECM成分中的作用，并开始通过与肝和其他部位（如皮肤、肾脏、肺和主要血管）的纤维化和相关病理相关的信号通路，深入了解其调节。¹⁸最后，考虑到血清OPN作为HBV或HCV患者肝损伤严重程度的生物标志物的潜在用途，^11,12SOX9作用的额外下游ECM靶点可能有助于分期和预测肝纤维化的严重程度。

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