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肝病学。作者手稿；PMC 2014年5月1日提供。
以最终编辑形式发布为：
肝病学。2013年5月；57(5): 1814–1825.
在线发布2013年4月1日。 数字对象标识：10.1002/hep.26230
预防性维修识别码：项目经理3637920
NIHMSID公司：NIHMS433111标准
PMID：23300059

刺猬途径与儿童非酒精性脂肪肝

Marzena Swiderska综合征,1 铃木雅子,1 辛西娅·盖伊,2 杰弗里·施维默,三 马纳尔·阿卜杜勒马利克,1 乔尔·莱文,4和安娜·梅·迪尔1
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补充资料

摘要

目前尚不清楚为什么儿童和成人非酒精性脂肪肝的组织学有时不同。在成年人中，门静脉炎症和纤维化的严重程度与Hedgehog通路的活性相关。刺猬（Hedgehog，Hh）信号调节器官发生，但在成人肝脏中沉默，直到损伤重新诱导Hh配体产生。在青春期，肝脏发育完成，儿童肝脏通常会失去产生Hh配体和/或对其作出反应的细胞。我们假设脂肪肝损伤通过增加Hh配体的产生来干扰这一过程，并推测儿童对Hh配体物的肝脏反应可能因年龄、性别和/或青春期状态而异。我们使用56例非酒精性肝病（NAFLD）儿童的未染色肝活检切片，进行免疫组化，以评估Hh通路的激活，并将结果与活检时获得的临床信息相关联。纤维化阶段通常与Hh途径活性相关，如Hh配体生成细胞（P<0.0001）和Hh反应细胞（胶质瘤相关癌基因2阳性[Gli2]）的数量（P=0.0013）所示。Gli2（+）细胞的数量也与门脉炎性分级相关（P=0.0012）。观察到Hh-配体产生的两种不同的带状模式，即门静脉/门静脉周围和小叶。门脉/门脉周围Hh-配体的产生与男性相关。男性和青春期前也与导管增生（P<0.05）、门脉Gli2（+）细胞数量增加（P<0.017）和门脉纤维化有关。结论：青春期前男性肝脏的门/门周（祖细胞）室具有较高的Hh通路活性。这可能解释了儿童NAFLD独特的组织学特征，因为Hedgehog信号促进纤维导管反应。

关键词：非酒精性脂肪性肝炎、导管增生、声波刺猬、胶质母细胞瘤家族转录因子2、角蛋白7

简介

随着肥胖人数的增加，非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）在儿童和青少年中迅速出现，现已成为美国儿科人群中最常见的慢性肝病病因(1,2). 值得关注的是，最近的几项研究表明，尽管儿童脂肪肝损伤相对较短，但晚期NAFLD（即桥接纤维化和/或肝硬化）仍可能发生在儿童身上(三–6).

儿童NAFLD的组织学特征通常与成人不同。儿童肝细胞气球样变少，门脉炎症和纤维化多，表现出明显的脂肪性肝炎模式（即儿童型、1区为主型或2型）(4,7). 我们最近报道，儿童青春期阶段和/或性别的差异可能是NAFLD患儿组织学差异的原因(8). 然而，解释NAFLD儿童不同组织学模式的潜在机制尚不明确。

越来越多的证据支持Hedgehog（Hh）通路放松调控在成人NAFLD发病和进展中的作用。Hh是发育过程中协调器官发生的形态发生信号通路。Hh配体家族成员（Sonic Hh[SHh]、Indian Hh和Desert Hh）通过参与Patched（Ptc）激活Hh信号传导，Patched是Hh应答细胞表面的跨膜受体。Hh配体与Ptc的结合可防止Ptc抑制Smoothened（Smo）。激活的Smo控制胶质母细胞瘤（Gli）家族转录因子（Gli1、Gli2和Gli3）的细胞聚集和核定位，这些转录因子调节调节Hh应答细胞增殖、分化和存活的Hh调节基因的表达(9). Hh途径在健康成人肝脏中通常是沉默的，但当损伤刺激Hh配体的产生时会重新激活(9,10). Hh配体暴露的增加触发了参与伤口愈合反应的各种细胞类型的生长，包括常驻肝免疫细胞、星状细胞和祖细胞。虽然Hh信号对受损的成人肝脏再生是必要的，但当通路激活过度和/或延长时，会导致慢性炎症、纤维化和癌症(10,11). 我们的研究小组证明，在患有非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的成人中，膨胀的肝细胞产生Hh配体(12)，并报告了成人NAFLD中Hh配体的肝脏含量、Hh应答细胞（Gli2-阳性细胞）的数量以及炎症和纤维化的严重程度之间的显著相关性(13). 儿童NAFLD是否涉及类似机制尚不清楚。

儿童的肝脏通常比成人含有更多的Hh产生细胞和Hh反应细胞(14)与Hh调节器官发生的证据一致。这向我们表明，儿童可能特别容易受到刺激Hh配体产生的侮辱。此外，因为人类肝脏的发育直到青春期才完成(15,16)我们假设儿童多年来一直处于Hh易感状态，只有在青春期和肝脏成熟期Hh通路活性下调时，儿童才会恢复到成人的易感水平。这种推理使我们假设年龄、性别和/或青春期状态可能影响儿童的Hh途径活性，从而调节脂肪肝损伤的肝脏反应，从而影响NAFLD的组织学特征。为了评估这一假设，我们在一个特征明确的儿科人群中调查了Hh通路活性与NAFLD临床病理特征之间的关系。

材料和方法

研究设计和人群

我们使用加州大学圣地亚哥分校儿科胃肠病学和营养部56名连续诊断为NAFLD的患者的核心肝活检切片和临床数据进行了横断面分析。所有病例均符合以下标准：1）<18岁，2)根据病史、实验室检查和组织学评估，没有其他肝脏疾病或其他脂肪肝原因，三)肝活检样本>20mm和4）肝活检时有临床信息。每次活检均获得一个福尔马林固定石蜡包埋的未染色切片，以及苏木精-伊红（H&E）染色和Masson三色染色的玻片。还获得了肝活检时的年龄、性别、Tanner分期和体重指数（BMI）的信息。

本研究仅使用加州大学圣地亚哥分校（UCSD）提供的未经鉴定的幻灯片和临床信息进行，未直接涉及人类受试者[45 CFR 46.102（f）]。之前的UCSD研究得到了机构审查委员会（IRB）的批准，并获得了知情同意。该研究由杜克IRB批准。

NAFLD的组织学评价

根据非酒精性脂肪性肝炎临床研究网络（NASH CRN）评分系统，由一名肝脏病理学家（CG）使用H&E和Masson的三色染色切片对NAFLD的组织学特征进行评分(17). 由于每个类别的研究受试者人数有限，将等级（G）和阶段（S）结合起来进行分析，如下所示：脂肪变性等级、G0-1、G2和G3或G0-1和G2-3；小叶炎症分级，G0-1和G2（无G3）；肝细胞气球化分级，G0和G1-2；门脉炎症，G0、G1和G2或G0–1和G2；和纤维化阶段，S0、S1-2和S3-4或S0-2和S3-4。还使用以下诊断类别记录了总体诊断：脂肪变性（NAFLD，但非NASH），疑似脂肪性肝炎（SH）成人模式，也称为3区或1型模式，疑似SH儿童模式，也指1区或2型模式，明确SH成人模式和明确SH儿童模式。

免疫组织化学染色和评价

最初，56张载玻片中有30张被染色为SHh（N=20）、vimentin（Vim，N=6）或α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA，N=4），其余载玻片被同时染色为Gli2和角蛋白7（Gli2/K7，N=26）。为了支持样本量，对2个Gli2/K7共染载玻片进行了额外的Vim染色，2个Gli 2/K7共同染色载玻片额外的α-SMA染色，5个SHh染色载玻片额外的K7染色。因此，总共评估了20张载玻片的SHh、26张Gli2、31张K7、8张Vim和6张α-SMA。这种方法是必要的，因为可用幻灯片的数量有限。为了确定哪些玻片用于哪种染色，根据组织学严重程度对病例进行分组，然后从每个组中随机选择玻片进行免疫组织化学（Ihc），以便在每种组织学严重性类别中具有大致相等的病例数。Ihc方法和抗体的详细信息已公布(18,19).

SHh、Vim和αSMA的阳性染色半定量为低倍视野（x100倍放大）中总表面积的百分比，并分为5个等级：G1（小于20%）、G2（20-39%）、G3（40-59%）、G4（60-79%）和G5（≥80%）。在5个随机选择的高倍视野（HPFs，x200倍放大）中计算Gli2核阳性和K7细胞阳性。计算每个HPF的K7+、Gli2+、K7+/Gli2-和K7+/Gli2+细胞的平均计数，并用于分析。

此外，肝脏病理学家（CG）评估SHh和Gli2/K7染色的强度和组织学位置。在排除碎片样本后，在该子分析中使用了16张SHh载玻片、18张Gli2载玻片和25张K7载玻片。对以下特征进行评分：1）具有SHh+门脉周围肝细胞的门脉百分比（[具有SHh+门脉周围肝脏的门脉数量/活检中的门脉总数]×100）；2） 门脉周围肝细胞SHh染色强度（G0，无；G1，最小；G2，轻度；G3，中度）；3） SHh+气球状肝细胞数量（每×100倍放大视野中SHh+球状肝细胞的平均数量）；4） Gli2+阳性门脉细胞反映染色强度和数量的复合（G0，无；G1，最小；G2，轻度；G3，中度）；5） 反映位置的Gli2+肝细胞（门静脉周围与中央）以及染色强度和数量的复合物（G0-3）；和6）门脉和门脉周围区域的K7+导管细胞/祖细胞反映了染色强度和数量的复合（G0，无；G1，最小；G2，轻度；G3，中度）。对这些评分特征进行分析，以评估H&E和三色组织学特征与临床信息（年龄、性别、青春期和BMI）之间的相关性。

为了绘制正常肝脏成熟过程中Hh通路活性、祖细胞和相关基质细胞的变化，对印度Hh（IHh）、Gli2、性别决定区Y-box 9（Sox9）、甲胎蛋白（AFP）、，在胚胎第13天和第14天以及出生后第3周和第12周（n=3只小鼠/时间点）从健康雄性小鼠获得的库存福尔马林固定/石蜡包埋肝脏切片上进行aSMA。Ihc方法和抗体的详细信息已公布(18,19). 结果的量化如补充图形图例.

统计分析

临床特征报告为连续变量的平均值±SD、中位数和四分位范围（IQR，25第个和75第个)对于得分变量，或作为与分类变量条件的比例。

组织学特征与年龄、性别和青春期阶段（Tanner阶段1，青春期前；阶段2-4，青春期；阶段5，青春期后）之间的关联性使用Chi-square测试、Kruskal-Wallis测试或ANOVA结合Tukey测试进行评估。由于患者数量较少，青春期和青春期后被合并为一类。

为了评估Ihc评分与组织学特征之间的相关性，我们进行了Wilcoxon秩和检验、Kruskal-Wallis检验、Chi-square检验或Fisher精确检验。为了进行事后比较，使用了Wilcoxon秩和检验。为了调整其他因素，还使用了多重序数或线性回归模型。对于SHh+、Gli2+和K7+细胞的强度和位置的子分析，由于样本量有限，我们以描述性的方式提供了数据。

对于所有分析，我们使用了JMP统计软件8.0版（SAS institute Inc.，Cary，NC），并认为当P值等于或小于0.05时，差异具有统计学意义，但事后比较除外，在比较中，字母水平调整了0.05/若干对。全部P（P）给出的值是双向的。

结果

研究人群的临床特征

本研究人群的临床特征总结如下表1研究人群的平均年龄和BMI分别为13±2岁和34±8 kg/m2分别是。75%是男孩。196%的人处于青春期前（Tanner 1期），65.2%处于青春期（Tanner2-4期），15.2%处于青春期后（Tanner-5期）。组织学特征的分布也总结在表1简言之，严重脂肪变性（G3）的患病率为39.3%，严重小叶炎症（G2-3）的发病率为8.9%，肝细胞气球状增生（G1-2）的发病概率为23.2%，轻度以上的门脉炎症（G2）的发病几率为23.6%，晚期纤维化的发病率是37.8%。单纯性脂肪变性20例（35.7%）。其余36例（64.3%）有SH特征。26例组织学可疑SH，其中9例（35%）为儿童型，17例（65%）为成人型。10例确诊为明确的SH，其中2例（20%）表现为小儿型；其余8例确诊SH（80%）为成人型。因此，我们队列中的少数患者存在单纯性脂肪变性。较大的亚组具有SH特征，其中大约三分之一的患者表现出儿童型SH，其余三分之二的患者表现为更经典的成人型SH。

表1

研究人群的临床特征

摘要统计信息
年龄，年13±2
性别，男性%75%
坦纳氏期Tanner 1期，19.6%；Tanner 2～4期，65.2%；Tanner第5阶段，15.2%
体重指数34±8
脂肪变性G0:1.8%；G1:37.5%；G2:21.4%；G3:39.3%
小叶炎症G0:3.6%；G1:87.5%；G2:8.9%；G3:0%
肝细胞膨胀G0:76.8%；G1:17.9%；G2:5.3%
门脉炎症G0:30.9%；G1:45.5%；G2:23.6岁
诊断类别脂肪变性：35.7%；可疑SH:46.5%；SH成人型：14.3%；SH儿科模式：2:3.6%
纤维化S0:30.2%；S1:24.5%；S2:7.5%；S3:34.0%；S4:3.8%
NAS得分3[2, 4]

G： 组织学分级；SH：脂肪性肝炎；S： 阶段

在比较男孩和女孩的组织学特征的严重程度时，我们注意到男孩的脂肪变性分级和纤维化阶段明显较高（Wilcoxon秩和检验：脂肪变性P=0.037，纤维化P=0.02）。无论性别如何，年龄均与门脉炎症相关（ANOVA:P=0.0005）；G1-2型门脉炎患者比无门脉炎（G0）患者年轻（Tukey检验：p<0.05）。尽管单变量分析未显示青春期阶段与组织学特征之间的显著相关性，但在青春期早期，门脉炎的分级有升高的趋势（Wilcoxon秩和检验，P=0.08）。

SHh表达与组织学特征严重程度的关系

在可用队列中，SHh分级中位数为2.5[2，4]（N=20）。单变量分析显示SHh分级与纤维化阶段显著相关（P=0.0008，图1A-D)脂肪变性分级（P=0.022，图1D). 与无纤维化（S0，P=0.0007）和轻度至中度纤维化（S1-2，P=0.009）患者相比，晚期纤维化患者（S3-4）的SHh分级更高(图1A-D). 中度脂肪变性（G2）患者的SHh分级高于无至轻度脂肪变性患者（G0-1，P=0.0091，图1D). 在包括脂肪变性分级、纤维化分期和性别在内的有序logistic回归模型中，SHh分级和纤维化分期之间的相关性仍然显著（P=0.002），但脂肪变性分级没有显著相关性（P=0.241）。SHh表达与小叶炎症、肝细胞膨胀或门脉炎症分级之间没有显著相关性。

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SHh免疫组化与纤维化分期和脂肪变性分级增加相关

S0患者SHh免疫组织化学（棕色）的显微照片（A）、S1（B）和S3（C）纤维化显示门脉和门脉周围SHh+细胞数量增加，纤维化程度增加。绘制SHh染色与纤维化或脂肪变性严重程度之间的关系（D） ●●●●。纤维化程度与SHh分级相关。P=0.0008（克鲁斯卡尔·沃利斯试验）。*：P＜0.017（此比较中调整后的α水平）。脂肪变性分级的严重程度与SHh分级也相关。P=0.022（克鲁斯卡尔·沃利斯试验）。*：P<0.017（在这些比较中调整了α水平）。在校正了纤维化分期和性别后，与纤维化分期而非脂肪变性分级的相关性仍然显著（多元有序logistic回归，似然比检验：脂肪变性P=0.24，纤维化P=0.006）。

Gli2和K7表达与组织学特征严重程度的相关性

已知肝祖细胞具有Hh反应性。因此，我们对肝脏切片进行染色，以获取祖细胞标记物角蛋白7（K7）和Gli2（Hh-反应性标记物）。每个HPF中Gli2+和K7+细胞的中位数分别为227[121,380]和17[14,25]（两种染色的N=26）。平均而言，44%的K7+细胞对Gli2也呈阳性反应（范围为11–73%）。Gli2+细胞计数与纤维化阶段相关（P=0.0013）；晚期纤维化患者（S3–4）的Gli2+细胞数量高于无纤维化患者（S0，P=0.004）和轻度至中度纤维化患者（S1–2，P=0.04）(图2A-D). Gli2+细胞的数量也与门脉炎症的严重程度显著相关（P=0.0012，图2D)与肝细胞气球化的严重程度相关（P=0.073）。在包括门脉炎性分级、纤维化分期和性别的有序logistic回归模型中，门脉炎和纤维化与Gli2+细胞数量呈独立相关性（多元线性回归模型，效应检验：门脉炎P=0.022，纤维化P=0.045）。Gli2+细胞与脂肪变性或小叶炎症分级之间没有显著相关性，而与球囊化分级之间存在临界正相关（P=0.074）。

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Gli2和K7免疫组化与纤维化分期相关

S0患者Gli2（棕色，Hh反应细胞）和K7（蓝色，祖细胞）的免疫组织化学（A） ，S1（第一阶段）（B）和S3（C）纤维化显示随着纤维化阶段的增加，Gli2和K7阳性的门脉（PT）细胞数量增加。绘制了Gli2+细胞数量与纤维化阶段或门脉炎症严重程度之间的关系（D） ●●●●。纤维化程度与Gli2+细胞数量相关。P=0.0013（克鲁斯卡尔·沃利斯试验）。*：P<0.017（比较中调整的α水平）。门静脉炎症的严重程度和Gli2+细胞的数量也相关。P=0.0012（克鲁斯卡尔·沃利斯试验）。*：P<0.017（本次比较中调整的α水平）。纤维化分期和门脉炎症分级与模型中Gli2+细胞的数量独立相关，包括性别、纤维化分期和门脉炎症分级（多元线性回归，效应检验：门脉炎症P=0.022，纤维化P=0.045）。

K7+细胞计数与门脉炎的严重程度显著正相关（P=0.0185），并与肝细胞气球化的严重程度相关（P=0.074）。在包括门脉炎性分级和气球状变的多元线性回归模型中，门脉炎（而非肝细胞气球状变）往往与K7+细胞的数量相关（效应检验：门脉炎P=0.082，肝细胞气球样变P=0.546）。此外，与无至中度纤维化相比，晚期纤维化（S3–4）倾向于与更多K7+细胞相关（S0–2，P=0.064）。K7+细胞的数量与脂肪变性或小叶炎症的分级之间没有显著相关性。

K7+细胞中Gli2+细胞的百分比（Gli2+/K7+的百分比）与任何组织学特征的严重程度均无显著相关性。

Vim和αSMA表达与组织学特征严重程度的关系

由于Hh信号促进纤维生成，因此对剩余可用的肝脏切片进行Vim染色，Vim是间充质细胞的通用标记，α-SMA是肌成纤维细胞的标记。Vim和αSMA染色的中位数等级分别为3[IQR 1.8，4.3]（N=8）和3[IGR 1.3，4.5]（N=6）。Vim的表达与晚期纤维化显著相关（P=0.038）。α-SMA表达与纤维化和门脉炎症呈临界相关性（P=0.0603）。

SHh和Gli2/K7 Ihc染色强度与组织学位置的相关性分析

SHh阳性表现为三种相对离散的模式：SHh+气球状肝细胞、SHh+胆管和小管，以及SHh+门脉周围非气球状肝组织(图3A-D). SHh+膨胀肝细胞、门脉周围非膨胀肝细胞和胆管/导管细胞分别占46.7%、62.5%和86.7%。有趣的是，SHh+膨胀肝细胞和SHh+门脉周围非膨胀肝细胞的存在是相互排斥的(图3C-E，是否存在这些SHh+模式的卡方检验，P=0.03）。也就是说，大多数SHh+膨胀肝细胞的病例显示没有SHh+门脉周围肝细胞。更具体地说，在8例SHh+肝细胞膨胀的患者中，只有2例显示SHh+门脉周围肝细胞，在这2例患者中，不到25%的门管区显示门脉周围肝癌SHh阳性。相反，大多数SHh+门脉周围肝细胞的病例显示没有SHh+气球状肝细胞。在2例SHh+门脉周围肝细胞和SHh+气球状肝细胞的病例中，每放大100倍可发现3个或更少的SHh+球状肝细胞。另一方面，SHh+胆管/导管细胞倾向于与SHh+门脉周围肝细胞相关，并且在SHh+气球状肝细胞普遍存在的肝脏中很少发现SHh+肝细胞（如SHh+门脉周围肝）。SHh+门脉周围肝细胞染色强度与显示SHh+肝细胞的门管区百分比显著正相关（P<0.0009），与SHh+膨胀肝细胞的数量负相关(图3F-G).

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SHh染色模式

气球状肝细胞（箭头）强烈表达SHh（A） ●●●●。大多数导管细胞（星号）和一些门周肝细胞（箭头）也表达SHh（B） ●●●●。肝细胞膨胀的病例（箭头）通常显示没有SHh+门脉周围肝细胞（C） ●●●●。与中央静脉（CV）周围的肝细胞相比，无气球样变的病例门脉周围肝细胞（箭头所示）中典型地表现出强烈的SHh表达（D） ●●●●。SHh+门脉周围肝细胞的PT百分比与SHh+膨胀肝细胞的数量呈负相关（E） ●●●●。SHh+门脉周围肝细胞的强度也与SHh+膨胀肝细胞的数量呈负相关（F） ●●●●。SHh+门周肝细胞的强度与显示SHh+门周肝细胞的门束百分比显著正相关（G） ●●●●。

在所有检查的病例中均观察到门静脉束细胞中的Gli2+染色（N=18）。Gli2+门静脉道染色分级分布为：G1，27.8%；G2为38.9%，G3为33.3%。K7+导管细胞（即肝祖细胞）也在所有评估病例中得到鉴定（N=25）。K7+阳性等级分布为：G1，27.8%；G2为27.8%，G3为44.4%。Gli2+染色和K7+染色随纤维化阶段增加(图4 A-B).Gli2门静脉道染色分级与K7染色分级之间存在显著正相关（P<0.017，图4C). 18例患者中有13例的Gli2+细胞也位于肝小叶中，呈3区为主的模式(图4D，N=4），或区域1主导模式(图4E，N=1）或1区和3区正电性的组合（N=8）。小叶中的Gli2染色模式与任何组织学特征均无相关性。

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Gli2和K7染色模式

较高的纤维化阶段显示K7+细胞（祖细胞/导管细胞，蓝色）和Gli2+细胞（Hh-反应细胞，棕色）数量较多（A-B）。Gli2+PT细胞分级与K7+PT细胞等级之间存在显著正相关（P<0.017）（C）在小叶实质中也发现了Gli2+肝细胞（箭头），并显示出3区显性模式（D）或1区主导模式（E）或Gli2染色的组合模式。

在少数病例（N=5）中，我们共同染色SHh配体和肝祖细胞标记物K7。SHh阳性和K7阳性之间存在有趣的关系。所有K7染色超过最小值的病例（n=4）均显示SHh+胆管细胞和轻度至中度SHh+门脉周围肝细胞，而1例K7最小值阳性的病例未显示任何SHh+胆道细胞或门脉周围的肝细胞。因此，汇总数据将Hh配体的门脉/门脉周围生成与门脉/门脉周围祖细胞龛中未成熟肝细胞的积累联系起来（例如，导管板残留）。

由于很难从健康儿童身上获取肝组织来绘制Hh途径活性的发育相关变化，我们在发育过程中的不同时间点从健康雄性小鼠身上获取肝脏切片进行了此分析。在导管板形成时（胚胎第13-14天，已知肝细胞高度增殖），断奶时（出生后第3周，小鼠处于青春期前，肝脏的增殖明显减少），采集样本，在成年早期（出生后第12周，此时小鼠性成熟，肝细胞获得健康成年人典型的低增殖活性）(20). 免疫组织化学显示，随着发育进程，Hh配体生成细胞、Gli2（+）Hh反应细胞、肌成纤维细胞（αSMA阳性细胞）和祖细胞（Sox9和AFP阳性细胞）的数量均显著减少(补充图1–2). 这些结果支持这样一个概念，即当肝祖细胞室缩小到成年大小时，Hh途径活性通常会被沉默。

SHh和Gli2/K7 Ihc染色的组织学定位和强度与性别和青春期的相关性分析

SHh+门脉周围非膨胀肝细胞、SHh+膨胀肝细胞，Gli2+门脉细胞和K7+细胞与性别和青春期相关(表2). 男孩具有较高的SHh+门脉周围肝细胞的门脉百分比（P<0.05），较高的SHh+门脉附近肝细胞染色强度（P<0.04），较高级别的K7+细胞（P<0.005）和较低的SHh/气球状肝细胞数量（P<0.004）。这些结果表明，男孩和女孩对脂肪肝损伤的祖细胞反应不同，男孩表现出门脉/门脉周围祖细胞室更强劲的扩张，尽管实质损伤似乎较轻（表现为肝细胞较少膨胀）。无论性别如何，青春期前的儿童表现出更高级别的K7+阳性（P＜0.008），并且倾向于表现出更高级别的Gli2阳性（P＝0.055）。这些发现与其他证据一致，即儿童肝脏比成人肝脏含有更多的Hh应答祖细胞(14)并提示从儿童肝祖细胞室到成年肝祖细胞室内的“转换”发生在青春期。青春期前儿童的SHh+膨胀肝细胞数量也较低（P=0.056）。事实上，青春期前（N=4）没有出现SHh+肝细胞膨胀的病例，而青春期或青春期后的11例中有6例出现SHh=肝细胞膨胀。尽管由于样本量较小，无法在该人群中评估调整性别和青春期阶段的独立相关性，但这些发现支持这样一个概念，即在脂肪肝损伤期间，幼儿能够有效地动员Hh反应性肝祖细胞。

表2

SHH、GLI2和K7染色与性别和青春期的关系

N个性别青春期
女孩男孩P值青春期前青春期后P值
SHH+胆管*152[0, 2]2[1, 2]NS公司2[2, 2]2[1, 2]NS公司
%门脉周围SHH+肝细胞160%[0%, 0%]50% [6%, 94%]0.04556.5%[0%, 100%]25%[0%, 86%]NS公司
门脉周围肝细胞SHH+染色强度*160[0, 0]1[0.5, 2]0.0382[0, 2]1[0, 2]NS公司
K7增殖评分*251[1, 1.25]2[2, 3]0.0053[3, 3]2[1, 2]0.009
门脉细胞中GLI2活性*181.5[1, 2]2[1.75, 3]0.1283[2.25, 3]2[1, 2.25]0.055
SHH+膨胀的肝细胞155[0.08, 8.6]0[0, 2.2]0.0350[0, 0]2.1[0, 3]0.056

数据表示为中位数[四分位范围]。NS（不显著）：P>0.1

*组织学评分（见方法）

SHh和Gli2/K7 Ihc染色的组织定位和强度与常规组织学特征的相关性分析

在成人NAFLD患者中，出现导管的祖细胞通常沿着纤维间隔与纤维炎细胞混合，这种纤维导管反应的强度与肝纤维化的严重程度相关(21). 因此，我们评估了Ihc模式与常规组织学特征的分级/阶段之间的关系。由于本次分析的样本量有限，我们结合历史等级/阶段来创建二进制变量，并比较了Ihc的模式。门静脉束显示SHh+门脉周围肝细胞的百分比与晚期纤维化（S3-4）呈正相关（26.9%±32.7%vs.63.7%±44.0%，P=0.076），与肝细胞膨胀呈负相关（53.0%±41.6%vs.6.3%±12.5%，P=0.053）。相反，SHh+气球状肝细胞的数量与晚期纤维化（S3-4）呈负相关（2.7±3.0 vs.0.4±0.9，P=0.054），与常规H&E染色发现的肝细胞气球状相关（0.4±0.9vs.4.8±2.7，P<0.002）。因此，在儿童（如成人）中，导管（即祖细胞）反应的强度与纤维化的严重程度相关。然而，虽然成人通常需要实质性的实质性损伤（由膨胀的肝细胞堆积证明）来激发以祖细胞为基础的创伤愈合反应，但肝脏尚未完全成熟的儿童对更轻微的肝脏损伤会产生强大的创伤愈合响应。与这一概念一致，在Ihc染色的模式和强度与脂肪变性、门脉炎症或小叶炎症的分级之间没有观察到显著（或边界）的相关性。此外，与单纯脂肪变性和可疑脂肪性肝炎患者相比，明确成人型SH（N=2）患者的SHh+膨胀肝细胞数量更高（5.6±4.2 vs.0.5±1.0 vs.1.3±1.9）。同样的两例SH成人型患者没有SHh+门脉周围肝细胞，而在脂肪变性和可疑SH的病例中，大约一半的门管区显示SHh+肝细胞（0%对48.0%±46.5%对46.8%±41%）。

讨论

我们使用一组特征良好的NAFLD患儿的肝脏切片，对SHh配体生成细胞、Hh-responsive（Gli2+）细胞、K7-表达的导管祖细胞以及以Vim或a-SMA（纤维生成指标）标记的细胞进行免疫组化评估，并评估其与NAFLD组织学特征的临床特征和严重程度的相关性。正如我们之前在成人NAFLD中报道的那样(13)在儿童NAFLD中，Hh通路总活性（由配体生成细胞（SHh+）和Hh反应性（Gli2+）祖细胞和基质细胞证明）与纤维化阶段平行增加，Gli2+细胞的数量与门脉炎症的严重程度相关。儿童的新数据补充了NAFLD成人的发现(13)以及通过研究NAFLD的培养细胞和动物模型产生的类似数据(10,11)，并共同强烈支持脂肪肝损伤期间Hh途径的激活是NAFLD中驱动纤维炎症修复反应的主要机制之一的概念。因此，NAFLD结果的差异可能是由于个体之间或特定个体在不同时间点Hh途径激活的差异造成的。

一些NAFLD儿童出现门脉型纤维炎反应（称为儿童型或2型NAFLD），而其他儿童则表现出成人NAFLD的典型特征。脂肪肝损伤反应的这些差异的基础尚不清楚，尽管已经注意到患有NAFLD的年轻男孩特别可能表现为基于1区的病理学(7). 我们的结果确定了Hh途径中成熟相关差异在这种变异性中的作用。健康成人肝脏中的Hh途径活性通常较低，但在胚胎发生期间活性较强。这里我们证明，在小鼠肝脏发育过程中，随着器官发生的完成，Hh信号逐渐下调。因此，产生和/或对Hh产生反应的细胞在成年期主要局限于组织祖细胞室。成人的主要肝祖细胞室位于胎肝导管板（称为Hering管）残余物的门周(20,21,22). 人类肝脏祖细胞对Hh有反应，在健康成年人的肝脏中发现了罕见的Gli2阳性细胞(10). 健康儿童的肝脏比健康成人的肝脏含有更多的Hh反应细胞(14). 我们的新发现支持了这样一个概念，即从儿童期补体的Hh应答肝祖细胞向成人期补体Hh应答祖细胞的转变发生在青春期。我们的新证据支持了这一解释，即在健康的青春期前雄性小鼠中，Hh应答祖细胞在断奶后性成熟期下降到成年水平。这也与人类肝脏发育在青春期完成这一事实相一致(15,16).

我们发现的一个重要的、与疾病相关的暗示是，Hh介导的、基于祖细胞的肝损伤修复反应在青春期前儿童中比在成人中更为强烈。Hh通路的激活已被证明可以刺激未成熟的导管型祖细胞和肌成纤维细胞的生长（纤维导管反应）以及随后的肝纤维化。在成人中，这些Hh介导的修复反应的强度通常与肝损伤的严重程度相平行，因为受伤的肝细胞产生Hh配体，并在死亡时释放它们。因此，NAFLD成人的肝细胞膨胀、Hh途径活性、门脉炎症和肝纤维化都与NAFLD密切相关(13). 然而，在患有NAFLD的幼儿中，我们证明了祖细胞室（导管细胞和门脉周围肝细胞）中的细胞产生Hh配体，并表明大量Hh反应性（Gli2阳性）即使实质性肝损伤相对较轻（如相对罕见的膨胀肝细胞所示），细胞也会聚集在那里。这些发现表明，相对原始的儿童祖细胞室在脂肪肝损伤时很容易被激活。与成人一样，儿童的Hh途径激活引发门脉炎症和纤维导管反应，导致纤维瘢痕的局部积聚。在青春期前的儿童中，这种门脉反应是脂肪肝损害的主要表现，导致2型NAFLD。随着青春期的进展和肝脏成熟的完成，祖细胞室逐渐具备成人特征。因此，青春期后期的儿童表现出类似成年人的NAFLD模式。我们的数据还表明，男性对这一过程有影响，因为Hh介导的修复反应在NAFLD男孩中更为强烈。

这一儿童NAFLD进展的新模型预测，青春期前儿童对肝损伤具有独特的动员创伤愈合反应的能力，因此，与成年人相比，更容易受到这些过程（例如纤维化）的不利后果的影响。这可以解释为什么在许多类型的儿童肝损伤中晚期纤维化/肝硬化发生得相对较快。需要更多的研究来检验这个问题，特别是考虑到最近对小鼠肝星状细胞（HSC）的研究。肝损伤通常会刺激常驻HSC成为肌纤维母细胞（MF）。这种MF-HSC是许多类型肝损伤中胶原基质的主要生成者。虽然早期研究表明，肝损伤的缓解导致MF-HSC的凋亡(23,24)最近的研究表明，当损伤消失时，一些MF-HSC存活并恢复到更静止的表型。然而，当肝脏遭受随后的损伤时，这些“恢复的”MF-HSC似乎已“启动”以重新获得成肌纤维细胞、成纤维特性(23,24). 因为Hh途径激活刺激MF-HSC的积累(10,11)Hh介导的修复反应在儿童中往往具有攻击性，即使是儿童期的短暂肝损伤也可能扩大肌成纤维细胞的数量，从而增加终身肝纤维化的风险。鉴于儿童非酒精性脂肪肝正在流行，这一预测具有不祥的公共卫生影响，并强调了努力预防、诊断和治疗儿童肥胖及其终末器官后果的重要性。

​

表3

SHH、GLI2和K7染色与NAFLD组织学特征的相关性

N个气球等级纤维化阶段
G0级G1–2号机组P值第0–2页S3–4级P值
SHH+胆管/小管152[1, 2]1[0, 2]NS公司2[0.5, 2]1.5[1, 2]NS公司
%PTs伴SHH+门周肝细胞1653%[3%, 97%]0%[0%, 19%]0.06112.5%[0%, 55%]89%[13%, 100%]0.086
门周肝细胞SHH+染色强度的研究161.5[0.3, 2]0[0, 0.8]0.0610.5[0, 1.8]2[1, 2]NS公司
K7增殖评分252[1, 3]2.5[1.3, 3]NS公司1[1, 2.5]2[2, 3]NS公司
PT细胞中GLI2活性182[1, 3]2[2, 3]NS公司2[1, 2.3]2[1.8, 3]NS公司
SHH+膨胀的肝细胞150[0, 0.08]4[2.8, 7.8]0.0032.5[0, 4.5]0[0, 0.5]0.063

未发现脂肪变性、门脉炎症和小叶炎症相关。NS（不显著）：p>0.1

G、 等级；S、 阶段；PT，门静脉束

补充材料

补充图S1

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补充图S2

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Supp人物图例

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致谢

资金来源：

Anna Mae Diehl博士由NIH支持（UO1DK061713、R01-DK053792和R01-DK077794）

Jeffrey Schwimmer博士得到NIH（U01DK061734）的支持

Manal Abdelmalek博士得到NIH（UO1DK061713）的支持

Joel Lavine博士得到美国国立卫生研究院的支持（U01DK061734和UL1TR000040）

缩写词表

NAFLD公司非酒精性脂肪肝
小时刺猬
已修补私人投资公司
平滑（Smo）平滑（Smo）
格利胶质母细胞瘤家族转录因子
Gli2公司胶质母细胞瘤2转录因子
健康与环境苏木精和曙红
体重指数体重指数（体重kg/身高平方米）
加州大学圣地亚哥分校加州大学圣地亚哥分校
内部评级委员会机构审查委员会
NASH CRN公司NASH临床研究网络
克组织学分级
S公司纤维化阶段
美国国立卫生研究院非酒精性脂肪性肝炎
上海脂肪性肝炎
SHh公司声波刺猬
维姆波形蛋白
α-SMAα-平滑肌肌动蛋白
K7公司角蛋白7
Ihc公司免疫组织化学
高性能过滤器高功率场
IHh公司印度刺猬
Sox9指数性别决定区Y框9
甲胎蛋白甲胎蛋白
IQR公司四分位范围
磅门静脉束
个人简历中央静脉

脚注

利益冲突：作者报告没有利益冲突。

财务披露：作者没有财务披露。

作者贡献：

Marzena Swiderska-Syn公司优化并执行肝活检切片的免疫组织化学，进行免疫组织化学评价，为数据分析、手稿撰写和最终提交的手稿批判性审查做出贡献。

铃木雅子有助于形成研究思路、分析和解释数据、撰写手稿和批判性审阅最终提交的手稿。

辛西娅·D·盖伊为研究思路的形成做出了贡献，进行了组织化学和免疫组织化学评价、组织学数据的解释、数据的分析和解释、手稿的撰写以及最后提交的手稿的批判性审查。

杰弗里·施维默有助于研究思路的形成、数据采集、数据解释、手稿撰写和最终提交稿的批判性审查。

Manal F阿卜杜勒马利克帮助解释数据、撰写手稿和对最终提交的手稿进行批判性审查。

乔尔·拉文有助于研究思路的形成、数据采集、数据解释、手稿撰写和最终提交稿的批判性审查。

安娜·梅·迪尔有助于形成研究思路，资助和监督数据采集，进行数据分析和解释，协助撰写手稿，批判性审查和修订重要知识内容的手稿。

参考文献

1Angulo P.非酒精性脂肪肝。N英格兰医学杂志。2002;346:1221–1231.[公共医学][谷歌学者]
2Schwimmer JB、Deutsch R、Kahen T、Lavine JE、Stanley C、Behling C.儿童和青少年脂肪肝的患病率。儿科。2006;118:1388–1393.[公共医学][谷歌学者]
三。Feldstein AE、Charatcharoenwitthaya P、Treeprasertsuk S、Benson JT、Enders FB、Angulo P。儿童非酒精性脂肪肝自然病史：长达20年的随访研究。内脏。2009;58:1538–1544. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
4Carter-Kent C、Yerian LM、Brunt EM、Angulo P、Kohli R、Ling SC等。儿童非酒精性脂肪性肝炎：一项多中心临床病理研究。肝病学。2009;50:1113–1120. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
5Molleston JP、White F、Teckman J、Fitzgerald JF。患有脂肪性肝炎的肥胖儿童在儿童期可发展为肝硬化。美国胃肠病杂志。2002;97:2460–2462.[公共医学][谷歌学者]
6Rashid M，Roberts EA。儿童非酒精性脂肪性肝炎。儿科胃肠病学营养学杂志。2000;30:48–53.[公共医学][谷歌学者]
7Schwimmer JB、Behling C、Newbury R、Deutsch R、Nievergelt C、Schork NJ等。儿童非酒精性脂肪肝的组织病理学。肝病学。2005;42:641–649.[公共医学][谷歌学者]
8铃木A、Abdelmalek MF、Schwimmer JB、Lavine JE、Scheimann AO、Unalp-Arida A等。青春期与非酒精性脂肪肝特征的相关性。临床胃肠肝素。2012;10:786–794. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
9Omenetti A，Choi S，Michelotti G，Diehl AM。肝脏中的刺猬信号。肝素杂志。2011;54:366–373. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
10Choi SS，Omenetti A，Syn WK，Diehl AM。Hedgehog信号在纤维化肝修复中的作用。国际生物化学与细胞生物学杂志。2011;43:238–244. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
11Bohinc BN，Diehl AM。NASH疾病进展机制：新范式。临床肝病。2012;16:549–565.[公共医学][谷歌学者]
12Rangwala F、Guy CD、Lu J、Suzuki A、Burchette JL、Abdelmalek MF等。通过膨胀的肝细胞增加声音刺猬的产量。病理学杂志。2011;224:401–410. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
13.Guy CD、Suzuki A、Zdanowicz M、Abdelmalek MF、Burchette J、Unalp A等。Hedgehog途径激活与人类非酒精性脂肪性肝病损伤和纤维化的组织学严重程度平行。肝病学。2012;55:1711–1721. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
14Omenetti A、Bass LM、Anders RA、Clemente MG、Francis H、Guy CD等。胆道闭锁中的Hedgehog活动、上皮-间充质转化和胆道畸形。肝病学。2011;53:1246–1258. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
15Libbrecht L、Spinner NB、Moore EC、Cassiman D、Van Damme-Lombaerts R、Roskams T。Alagille综合征患者的外周胆管缺乏和肝内胆汁淤积：进一步证据支持出生后胆管缺乏分支和延伸。美国外科病理学杂志。2005;29:820–826.[公共医学][谷歌学者]
16Balcha HH，Admassi D.埃塞俄比亚亚的斯亚贝巴黑狮医院13岁以下埃塞俄比亚儿童的正常肝脏大小测量。埃塞俄比亚医学杂志。2012;50:153–158.[公共医学][谷歌学者]
17Kleiner DE、Brunt EM、Van Natta M、Behling C、Contos MJ、Cummings OW等。非酒精性脂肪肝组织学评分系统的设计与验证。肝病学。2005;41:1313–1321.[公共医学][谷歌学者]
18Jung Y，McCall SJ，Li YX，Diehl AM。胆管和基质细胞在原发性胆汁性肝硬化中表达刺猬配体和/或刺猬靶基因。肝病学。2007;45:1091–1096.[公共医学][谷歌学者]
19Omenetti A、Syn WK、Jung Y、Francis H、Porrello A、Witek RP等。刺猬信号的修复相关激活促进胆管细胞趋化因子的产生。肝病学。2009;50:518–527. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
20Carpentier R、Suner RE、van Hul N、Kopp JL、Beaudry JB、Cordi S等。胚胎导管板细胞产生胆管细胞、门脉周围肝细胞和成人肝祖细胞。胃肠病学。2011;141:1432–1438.1438 e1431-1434。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
21Richardson MM、Jonsson JR、Powell EE、Brunt EM、Neuschwander-Tetri BA、Bhathal PS等。非酒精性脂肪性肝炎的进展性纤维化：与再生改变和导管反应的关系。胃肠病学。2007;133:80–90.[公共医学][谷歌学者]
22Syn WK、Jung Y、Omenetti A、Abdelmalek M、Guy CD、Yang L等。非酒精性脂肪性肝病中的Hedgehogmediated上皮-间充质转化和纤维生成修复。胃肠病学。2009;137：1478–1488 e1478。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
23Friedman SL.肝纤维化的挑战。Nat Rev胃肠肝素。2010;7:425–436.[公共医学][谷歌学者]
24Kisseleva T、Cong M、Paik Y、Scholten D、Jiang C、Benner C等。肝纤维化消退过程中，肌成纤维细胞恢复为非活性表型。美国国家科学院院刊。2012;109:9448–9453. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]