AIP1通过限制高脂血症诱导的炎症和血管内皮功能障碍抑制动脉粥样硬化

摘要

简介

在美国，由冠状动脉动脉粥样硬化引起的心肌梗死仍然是导致死亡的主要原因。动脉粥样硬化涉及动脉壁上的斑块形成，其特征是炎症、脂质积聚、平滑肌细胞增殖/新生内膜扩张、细胞死亡和纤维化^1,2脂蛋白在内皮下的滞留和积累可转化为致动脉粥样硬化的残余脂蛋白和低密度脂蛋白（LDL）^三,4对残留脂蛋白的关键早期炎症反应是血管内皮细胞（EC）的激活，这些脂蛋白的氧化修饰可能会增强EC的激活。活化的EC增加粘附分子和趋化因子的表达，进而促进免疫细胞的浸润，包括巨噬细胞、中性粒细胞、主细胞、树突状细胞和T细胞^2,5巨噬细胞吸收天然和氧化的低密度脂蛋白，成为脂溶性泡沫细胞，与其他细胞一起释放致动脉粥样硬化的细胞因子和其他活化剂，如活性氧（ROS），加剧EC功能障碍（特征是生物可利用的一氧化氮数量减少）和EC凋亡，促进动脉粥样硬化斑块的形成⁶因此，EC的表型变化可能是动脉粥样硬化发生和发展的早期事件^2,7,8确定对EC功能至关重要的基因和途径可能为动脉粥样硬化的治疗提供治疗靶点。

我们已经确定AIP1，一种在血管内皮中高度表达的蛋白，是一种新的信号支架蛋白，可介导炎症刺激引起的EC变化^9–14AIP1最初被鉴定为ASK1相互作用蛋白，在TNF诱导的JNK-MAPK信号传导中作为阳性调节物⁹它在N端半含有多个功能域，包括PH、C2、Ras-GAP（因此是Ras-GAP家族的新成员），而在C端半含有一个周期性结构域、富含脯氨酸的区域、一个卷曲线圈和亮氨酸拉链（CC/LZ），以及一个14-3-3的磷酸化氨基酸和Akt结合¹⁵此后，我们发现AIP1可以通过抑制RIP1和IKK激酶活性，作为TNF诱导的NF-κB活化的抑制剂^10,11已提出AIP1对TNFR1信号复合物进行差异调节。具体而言，AIP1抑制膜结合和IKK激活TNFR1复合物I，同时促进JNK激活复合物（我们称之为AIP1复合物）¹⁰有趣的是，我们已经证明AIP1抑制TLR4介导的EC中JNK和NF-κB信号通路的激活¹³我们进一步表明，AIP1作为一种新型Arf6-GAP，负调控TLR4-TIRAP-MyD88信号复合物的磷脂酰肌醇4，5-二磷酸（PIP2）依赖性组装。最近，我们发现血管平滑肌细胞中的AIP1抑制IFN-γ诱导的JAK2信号通路¹⁴因此，AIP1似乎是炎症信号的一般抑制因子。

为了支持我们的体外研究，来自AIP1-完整小鼠（AIP1）的分析^−/−)证明AIP1具有抗炎作用。AIP1基因^−/−小鼠的血管发育无明显缺陷。然而，AIP1^−/−在缺血后肢、炎症海绵和移植动脉硬化模型中，小鼠的炎症反应显著增强^12,14有趣的是，最近的一项人类全基因组关联研究（GWAS）发现了基因内含子1内的序列变异AIP1（DAB2IP）易患冠心病的基因（rs7025486），包括腹主动脉瘤、外周血管疾病、早期心肌梗死和肺栓塞¹⁶AIP1如何参与CAD，如动脉粥样硬化，尚不清楚。在本研究中，我们在ApoE-null小鼠模型中确定AIP1全局缺失对动脉粥样硬化进展的影响。ApoE-null或LDL受体null小鼠（其LDL清除受损）是最常用的动脉粥样硬化小鼠模型。此外，高脂血症加剧ApoE-null小鼠的炎症和EC功能障碍，这是动脉粥样硬化发展的重要早期事件^17–19我们目前的数据表明，AIP1通过限制高脂血症诱导的炎症和血管内皮功能障碍来抑制动脉粥样硬化的进展。

结果

AIP1的整体缺失促进ApoE中高脂血症诱导的动脉粥样硬化^−/−小鼠模型

为了研究AIP1在动脉粥样硬化形成中的功能作用，我们采用ApoE^−/−AIP1（AIP1）^−/−双敲除（DKO）和相应的ApoE^−/−小鼠吃含1.25%胆固醇的西式饮食10周。通过纵向打开主动脉，然后进行油红O染色，观察脂质丰富和动脉粥样硬化斑块。在10周时，AIP1缺失显著增加了ApoE中主动脉斑块的数量和大小^−/−老鼠(图1A). 整个主动脉弓、胸主动脉和腹部的病变面积较大(图1A–B). 我们还量化了主动脉根部横截面的病变面积。与ApoE相比，AIP1缺失增加了主动脉根部的病变面积^−/−老鼠(图1C用1D量化）。此外，在DKO的冠状动脉中检测到严重的动脉粥样硬化（如箭头所示图1C). 这种表型对于ApoE是非典型的^−/−小鼠，但在ApoE中有报道^−/−用西式饮食喂养10个月后的小鼠^20,21和ApoE中的^−/−缺乏低密度脂蛋白（LDL）受体等额外基因的小鼠²²，清道夫受体B1（SR-BI）²³或Akt1基因²⁴，或ApoE^−/−培养巨噬细胞表达尿激酶的小鼠²⁵.

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图1

AIP1缺失促进ApoE早期动脉粥样硬化进展^−/−小鼠

阿波（ApoE）^−/−和DKO成年小鼠喂食西式饮食10周。A类–B类.采集整个主动脉，纵向打开，然后面对面油红O染色。典型的显微照片如所示A类显示主动脉弓、胸主动脉和腹主动脉。粥样硬化瘤总数和各主动脉段的定量（%）如所示B类。数据为每组10只小鼠的平均值±SEM。*，第页<0.05，与ApoE相比^−/−和DKO集团。C类–D类。主动脉根部的横截面用油红O染色。典型的显微照片如所示C类.比例尺：100μm。动脉粥样硬化区域的量化如所示D类.每组10只小鼠，每只小鼠6个切片（每个切片间隔150μm）。数据为平均值±SEM，*，第页<0.05.

AIP1缺失增加高脂血症ApoE患者主动脉和无名动脉的病变扩张和巨噬细胞浸润^−/−小鼠

除了主动脉和冠状动脉病变外，我们还比较了无名动脉（鳃脑动脉）的病变。我们发现AIP1缺失在10周时显著增加了粥样斑块面积，管腔减少(图2A-B用于H&E和油红染色，定量在2C–D）。斑块面积增加与巨噬细胞（CD68）增加相关⁺)鳃头动脉浸润(图2E2F）和主动脉根部定量(补充图IA). AIP1缺失未显著改变平滑肌细胞数量(补充图IB). 因此，AIP1的基因缺失增加了主动脉和冠状动脉粥样化和巨噬细胞浸润，而不涉及平滑肌细胞。我们还通过全血计数测量了ApoE和DKO小鼠血液中循环单核细胞（渗入组织并成为巨噬细胞）。ApoE之间未检测到差异^−/−循环单核细胞中的DKO小鼠(补充图IC)表明DKO斑块中巨噬细胞数量增多可能是由于DKO小鼠血管壁中单核细胞浸润增强所致。

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图2

AIP1缺失增加ApoE无名动脉的病变扩张和巨噬细胞浸润^−/−小鼠

A类–C类苏木精和伊红（H&E）、油红-O、CD68（巨噬细胞标记物）染色的头臂动脉横截面的代表性组织学分析。比例尺：50μm。粥样斑块面积、管腔面积和CD68+面积的量化如所示D类–F类.每组5只小鼠，每只小鼠取6个切片（每个切片间隔150μm）。数据为平均值±SEM，*，第页<0.05.

AIP1缺失对高脂血症患者的体重、血清胆固醇和甘油三酯水平以及脂蛋白谱没有影响^−/−小鼠

由于脂质代谢对动脉粥样硬化有显著影响，我们接下来研究了AIP1对喂食10周周周周食物或西式饮食的小鼠的多种代谢参数的影响。我们没有检测到ApoE之间的明显差异^−/−和DKO对体重、血清胆固醇和甘油三酯水平的影响(图3A-C). 两组间VLDL、IDL/LDL和HDL的脂蛋白谱也相似(图3D-E). 这些数据表明，在DKO小鼠中，AIP1缺失增加的动脉粥样硬化病变的形成与血脂谱无关。

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图3

AIP1缺失对体重、血清胆固醇和甘油三酯水平以及载脂蛋白E的脂蛋白谱无影响^−/−小鼠

阿波（ApoE）^−/−和DKO成年小鼠喂食周粮或西式饮食10周。A类–C类测量空腹后的体重、血浆总胆固醇和甘油三酯水平。数据为平均值±SEM，n=8。D类–E类脂蛋白谱。载脂蛋白E血浆脂蛋白组分的脂质分布^−/−用2个Superose 6 HR 10/30色谱柱（Pharmacia）快速高效液相色谱（FPLC）凝胶过滤法对喂食（D）或饮食（E）的DKO小鼠进行评估。显示了VLDL、IDL/LDL和HDL的峰值。注：两种ApoE的西式饮食均降低了HDL^−/−和DKO小鼠。

AIP1缺失通过增强ApoE主动脉NF-κB信号增强高脂血症诱导的炎症细胞因子^−/−小鼠

炎症是动脉粥样硬化发生和发展的关键因素²我们测量了致动脉粥样硬化细胞因子，如TNF、IL-6和IL-12，以及动脉粥样硬化保护细胞因子IL-10^1,26在ApoE中，TNF、IL-6和IL-12（而不是IL-10）显著增加^−/−西式饮食10周后的小鼠血浆；这种增加在DKO小鼠中进一步增强(图4A). 促炎性细胞因子的表达增加可能是由于DKO主动脉粥样斑块中巨噬细胞数量增加，或转录因子NF-κB和JNK依赖性c-Jun/ATF2的激活增强，这些转录因子可驱动TNF、IL-6和IL-12的基因表达^27–30因此，我们用磷酸化p65-和p-JNK特异性抗体测量主动脉裂解物中NF-κB和JNK的活性。在喂食食物的主动脉中未检测到磷-65和磷-JNK（未显示）。然而，ApoE在主动脉中强烈诱导NF-κB（phopho-p65）和JNK的激活^−/−在西方型饮食的小鼠中，并且在DKO主动脉中进一步增强(图4B). 我们通过phopho-p65免疫荧光染色进一步确定了动脉粥样硬化斑块中表达活性NF-κB的细胞类型。与富含巨噬细胞的粥样斑块相比，DKO主动脉中磷酸化p65阳性细胞的数量增加，其中大多数在血管内皮中检测到(图4C用4D量化）。与ApoE相比，DKO中AIP1缺失也增加了NF-κB依赖性EC粘附分子ICAM-1^−/−老鼠(图4C用4D量化）。我们还通过qRT-PCR从ApoE和DKO主动脉检测了巨噬细胞募集趋化因子MCP-1、Rantes和fractalkine（CX3CL1）的NF-κB依赖性基因表达。饮食诱导的MCP-1、Rantes和fractalkine基因表达也因AIP1缺失而显著增强(图4E). 这些数据表明，AIP1缺失增加了动脉粥样硬化病变的形成，可能归因于DKO小鼠EC炎症反应的增强。

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图4

AIP1缺失增加斑块和全身炎症反应

阿波（ApoE）^−/−和DKO成年小鼠喂食周粮或西式饮食10周。A类AIP1缺失对促炎细胞因子产生的影响。ELISA法检测血浆TNF、IL-6、IL-12和IL-10。数据为平均值±SEM，每组8只小鼠。B类。斑块中的炎症反应。用磷酸化p65和p-JNK特异性抗体免疫印迹法检测动脉粥样硬化斑块中NF-κB和JNK信号。还测定了总AIP1和β-肌动蛋白。N=每组3只小鼠C类增强了DKO血管内皮中NF-κB信号和ICAM-1的表达。ApoE致头臂动脉病变中NF-κB活性和ICAM-1表达^−/−用抗p-P65和抗ICAM-1对DKO小鼠进行染色。CD31用于EC染色。面板中显示了具有代表性的图像C类.比例尺：50μm。内皮层和斑块内的巨噬细胞在D类。数据为每组6只小鼠的平均值±SEM。*，第页<0.05.E类巨噬细胞募集趋化因子MCP-1、Rantes和CX3CL1的转录物通过qRT-PCR定量，并归一化为ApoE和DKO主动脉的次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）。数据为每组5只小鼠的平均值±SEM。*，第页<0.05.

ApoE的骨髓细胞^−/−AIP1（AIP1）^−/−当移植给ApoE-KO受体时，供体不足以增强炎症反应和动脉粥样硬化

为了证实巨噬细胞中的AIP1依赖机制是否解释了DKO小鼠动脉粥样硬化的增加，我们进行了骨髓移植（BMT）实验。为了验证我们的BMT程序，我们移植了来自WT C57BL/6或AIP1-KO小鼠（CD45.2）的骨髓细胞⁺)辐射后的Pep3B受体（CD45.1⁺)正如我们之前所做的那样³¹在BMT 6周后，利用CD45.2和CD45.1表面标记物通过流式细胞术分析受体小鼠BM的植入率。植入率达到>95%（CD45.2的百分比⁺收件人中的单元格。WT和AIP1-KO骨髓细胞在受体BM重建中没有差异（n=4）。ApoE的骨髓细胞^−/−或DKO小鼠移植到8周龄致命照射的ApoE中^−/−老鼠。BMT后6周，我们通过使用AIP1 WT或KO等位基因特异性引物对外周血细胞进行基因分型，证实了骨髓的完全重建。结果表明，在DKO BMT至ApoE中检测到KO，但未检测到WT等位基因特异性PCR带^−/−收件人。用AIP1特异性抗体通过Western blot证实骨髓完全重建(图5A). 我们还使用基础ApoE的外周血进行了全血检测^−/、DKO和BMT ApoE小鼠。结果表明，BMT小鼠的骨髓在血红蛋白、红细胞压积、红细胞数、血小板、总白细胞以及中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞等单个细胞类型的测定中完全重建。更重要的是，未观察到外周血单核细胞和淋巴细胞的显著增加（与Basal相比与BMT输入补充表一). 我们没有观察到组织巨噬细胞浸润显著增加³²表明BMT程序并没有促进受体的炎症反应。然后用含1.25%胆固醇的西式饮食喂养BMT小鼠10周。如前所述，通过纵向打开主动脉，然后进行油红O染色，可观察到富含脂质和动脉粥样硬化斑块。整个主动脉弓、胸主动脉和腹部的病变以及主动脉根部的横截面在ApoE之间相似^−/−移植DKO骨髓细胞（BMT DKO to ApoE）和ApoE的小鼠^−/−移植ApoE的小鼠^−/−骨髓细胞（BMT ApoE至ApoE）(图5B–C主动脉；图5D–E主动脉根部）。两组间的血清细胞因子也相似(图5F). 这些数据表明，骨髓源性细胞（巨噬细胞）中AIP1的丢失不能解释DKO小鼠主动脉粥样硬化的增强。

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图5

在ApoE-KO受体中，AIP1-KO巨噬细胞不加速动脉粥样硬化形成并改变炎性细胞因子

A类骨髓移植（BMT）的特征。ApoE的骨髓细胞^−/−或DKO小鼠移植到ApoE^−/−受体小鼠。通过对AIP1基因（未显示）的外周血细胞进行基因分型，在BMT后六周内验证BMT成功。用抗AIP1蛋白免疫印迹法测定外周血细胞裂解物中AIP1的蛋白表达。采用无BMT的ApoE和DKO小鼠的外周血细胞作为对照。指示AIP1波段。ns：非特异性带。B类–C类给BMT小鼠喂食西式饮食10周，收获整个主动脉，纵向打开，然后面对面油红O染色。总动脉粥样硬化和每个主动脉段的定量（%）如所示B类，和代表性显微照片如所示C类显示主动脉弓、胸主动脉和腹主动脉。数据为每组8只小鼠的平均值±SEM。D类–E类。主动脉根部的横切面用油红-O染色。动脉粥样硬化区域的量化如图所示D类，和代表性显微照片如所示E类.每组8只小鼠，每只小鼠6个切片（每个切片间隔150μm）。数据为平均值±SEM。F类细胞因子浓度：采用10周西式饮食的BMT小鼠血浆中的TNF、IL-6、IL-10、IL-12。每组n=8只小鼠。ApoE组和DKO BMT组之间没有显著差异。

AIP1缺失增加动脉粥样硬化早期高脂血症诱导的EC功能障碍

血管内皮细胞是限制炎症的主要细胞类型，内皮细胞功能障碍被认为是动脉粥样硬化形成的早期步骤。为了确定增强的EC功能障碍是否是DKO小鼠动脉粥样硬化增强的潜在机制^−/−和DKO成年小鼠在服用西式饮食仅2周后，在几乎未检测到动脉粥样硬化病变的情况下进行血管功能检测。通过检测血管收缩剂苯麻黄碱（PE）和一氧化氮合酶抑制剂L-NAME的反应来测定分离主动脉环的血管反应性³³与ApoE相比，DKO小鼠的主动脉对PE更敏感^−/−老鼠(图6A). DKO小鼠的主动脉对PE反应更灵敏，因为需要3倍低浓度的PE才能引起分离的主动脉环收缩（EC₅₀=4×10⁻⁷在DKO与1.2×10⁻⁶在ApoE中^−/−). 确定这种差异是否是由于DKO与ApoE中eNOS衍生NO的基础释放所致^−/−用亚最大剂量的PE对血管、主动脉环进行预狭窄，并在狭窄峰值处加入NOS抑制剂L-NAME（100μM），以消除内源性NO张力。通过L-NAME去除基础NO后，两条血管对PE（EC）表现出相似的收缩反应₅₀=7.0×10⁻⁸针对DKO与EC₅₀=7.5×10⁻⁸对于ApoE^−/−)(图6B). 这些对血管运动的影响选择性地发生在内皮细胞中，因为两组对KCl的血管收缩反应和对NO供体药物SNP的血管舒张反应相似(图6C–D). 我们在饮食ApoE中没有观察到明显的差异^−/−和DKO小鼠(补充图二). 这些数据表明，西式饮食诱导ApoE中的EC功能障碍（基础NO活性降低）^−/−在动脉粥样硬化早期，AIP1缺失可进一步增强饮食诱导的EC功能障碍。

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图6

AIP1缺失增加动脉粥样硬化早期EC功能障碍

阿波（ApoE）^−/−和DKO成年小鼠用西式饮食喂养2周，并收获主动脉用于血管功能测定。A类在全剂量范围内（10⁻⁹-10⁻⁴M） 。显示了收缩力（mN）。B类主动脉环与一氧化氮合酶抑制剂L-NAME（100μM）孵育，以去除基础NO合成，然后与PE收缩，如交流。AIP1缺失对KCl引起的血管收缩没有影响。主动脉环用50 mM氯化钾收缩。D。AIP1缺失对no供体药物SNP的血管舒张没有影响。主动脉环与一氧化氮合酶抑制剂L-NAME孵育，以去除基础一氧化氮合成，然后用PE预牵引，如A、，然后用全剂量范围的SNP放松（10⁻⁹-10⁻⁶M） 。A–D中的数据为平均值±SEM，n=5只动物，每只动物8个主动脉环，*，第页<0.05表明，通过比较DKO和ApoE，具有统计学意义^−/−.

AIP1缺失强烈增强oxLDL诱导的血管内皮细胞炎症反应

我们之前已经证明，AIP1调节由促炎介质TNF、IL-1β和TLR配体诱导的EC中的细胞信号。具体而言，TLR配体（TLR4的LPS或TLR2的Pam3CSK4）诱导的MAPK和NF-κB信号通路的激活在AIP1-KO EC中增强¹³我们使用从WT（C57BL/6）和AIP1-KO小鼠分离的主动脉EC，确定AIP1是否通过oxLDL调节信号传导，oxLDL是一种来自LDL的主要促炎介质。分别通过phopho-p65和phopho-JNK测定oxLDL诱导主动脉EC中NF-κB和JNK的激活。此外，AIP1缺失强烈增强了oxLDL诱导的NF-κB信号传导，但对oxLDL诱发的JNK激活的影响较弱(图7A)与动脉粥样硬化主动脉的观察结果一致（参见图4). 相反，我们仅观察到AIP1缺失对oxLDL诱导的腹腔巨噬细胞NF-κB和JNK信号传导的微小影响(补充图IIIA). 值得注意的是，巨噬细胞中AIP1的表达与外周血细胞相似（参见图5A)，与主动脉EC相比非常低。qRT-PCR进一步证实了这一点(补充图IIIB). 然后，我们在ApoE中检测了oxLDL诱导的巨噬细胞募集粘附分子（ICAM-1和VCAM-1）和趋化因子（MCP-1和fractalkine）的基因表达^−/−oxLDL诱导的粘附分子和趋化因子的基因表达因AIP1缺失而显著增强(图7B).

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图7

EC中AIP1缺失显著增强oxLDL诱导的EC中NF-κB信号传导，但巨噬细胞中无此作用

1×10⁶用100μg/ml oxLDL处理WT（C57BL/6）和AIP1-KO小鼠主动脉EC，持续指定时间。用各自的抗体通过免疫印迹法测定磷酸和总p65和p-JNK1/2。还测定了总JNK1、AIP1和β-肌动蛋白。显示了三个独立实验的代表性斑点。给出了p-p65/p65比值的定量，未处理的WT为1.0*，第页与WT相比<0.05与AIP1-合格。B类用100μg/ml oxLDL处理WT和AIP1-KO小鼠主动脉EC 12小时。通过qRT-PCR定量EC粘附分子（ICAM-1和VCAM-1）和巨噬细胞募集趋化因子（MCP-1和fractalkine）的转录物，并将其标准化为次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（HPRT）。oxLDL诱导的基因表达（增加倍数）。数据是来自三个独立实验的平均值±SEM。*，第页<0.05.C类–D类AIP1缺失增强白细胞内皮粘附。将分离的WT和AIP1-KO小鼠主动脉EC接种在6孔板（5×10）中⁶细胞/孔）作为融合单层24小时，然后用100μg/ml oxLDL处理其他24小时。然后，用活细胞跟踪器CMFDA预染小鼠白血病单核巨噬细胞系RAW 264.7细胞，并将其加载到小鼠主动脉EC层（1×10⁶细胞/孔）1 h。然后用PBS洗涤去除非粘附细胞，粘附细胞进行免疫荧光显微镜检查，并对异硫氰酸荧光素（FITC）单位进行定量。面板中显示了具有代表性的图像C类，面板中有量化D类数据为三个独立实验的平均值±SEM。*，第页<0.05.

最后，我们进行了体外实验，以确定AIP1缺失对EC-白细胞粘附的影响，这是炎症细胞募集的关键早期步骤^2,34将荧光预先标记的小鼠单核细胞接种到融合的原代培养小鼠主动脉EC上，这些EC用oxLDL预处理。小鼠EC中AIP1缺失显著增强oxLDL诱导的单核细胞粘附(图7C用7D中的数量表示）。综上所述，这些数据表明，EC中AIP1的缺失主要归因于EC激活增强和巨噬细胞浸润，导致DKO小鼠动脉粥样硬化进程加快。

讨论

本研究的主要发现是，在ApoE-null小鼠动脉粥样硬化模型中，体内AIP1的整体缺失增强了高脂血症诱导的动脉粥样硬化进展。AIP1缺失可促进致动脉粥样硬化表型，但不会显著改变代谢参数，包括体重、总胆固醇水平或脂蛋白谱。机制研究表明，AIP1缺失显著增强了血管内皮细胞中LDL诱导的NF-κB/JNK促炎信号，但巨噬细胞中没有。这种增强的促炎信号有助于增强EC激活/功能障碍，增加损伤区域的巨噬细胞聚集，并加剧粥样斑块的生长。支持这一结论的是，来自AIP1缺陷供体的巨噬细胞不会增加ApoE-KO受体的炎症反应和动脉粥样硬化。因此，我们目前的研究揭示了AIP1在血管内皮细胞限制炎症、内皮细胞功能障碍和动脉粥样硬化中的关键作用。

我们目前的研究进一步支持了我们的总主题，即AIP1在血管系统中发挥关键的炎症细胞抑制剂的作用。我们之前已经在包括海绵肉芽肿模型在内的几种小鼠模型中检测了AIP1在炎症反应中的作用¹²和移植移植物动脉硬化模型¹⁴在海绵肉芽肿模型中，将聚乙烯醇（PVA）海绵植入小鼠皮下，宿主细胞侵入海绵并形成新组织，从而量化炎症和血管生成反应。AIP1全缺失增加巨噬细胞侵袭、异物反应和新生血管生成¹²然而，这些先前的研究集中于AIP1如何直接调节血管生成受体VEGFR2，而在AIP1-KO小鼠中观察到的巨噬细胞浸润增加的机制尚未进一步研究。移植物动脉硬化（也称为移植物血管病）是晚期心脏移植失败的主要原因，其特征是由于内膜内平滑肌细胞的募集和增殖导致动脉内膜增生，从而导致管腔阻塞和移植物缺血。来自人类研究和动物模型的证据表明，IFN-γ是一种由效应T细胞产生的促炎细胞因子，是平滑肌细胞增殖的关键介质。我们已经证明，AIP1缺失通过下调平滑肌细胞中IFN-γ-JAK2-STAT1/3依赖性迁移和增殖信号，促进内膜形成和移植物动脉硬化。有趣的是，AIP1介导的干扰素-γ信号传导抑制似乎是平滑肌细胞特异性的，因为我们没有观察到AIP1缺失对EC中IFN-γ信号传导的任何影响¹⁴因此，我们目前的研究表明AIP1在血管内皮细胞中具有特殊功能，主要负责限制动脉粥样硬化模型中低脂血症诱导的炎症反应和动脉粥样硬化病变进展。以下证据支持这一结论：1）虽然ApoE^−/−AIP1基因^−/−与ApoE相比，DKO小鼠表现出动脉粥样硬化病变增加，巨噬细胞浸润增加^−/−AIP1缺失对小鼠平滑肌细胞含量没有显著影响；2） AIP1缺失对高脂血症患者的体重、血清胆固醇和甘油三酯水平以及脂蛋白谱没有影响^−/−小鼠；3） AIP1缺失增加动脉粥样硬化早期高脂血症诱导的EC功能障碍；4） 最后，AIP1缺失通过ApoE中NF-κB信号的增强增强了高脂血症诱导的炎症细胞因子和巨噬细胞募集趋化因子^−/−小鼠主动脉和oxLDL在血管内皮细胞中诱导NF-κB信号传导，但在巨噬细胞中没有。这种血管内皮细胞特异性效应可能是由于AIP1在血管系统中丰富，但在巨噬细胞中非常低。我们最近培育出了EC-特异性AIP1敲除小鼠，这将有助于确定EC-表达的AIP1在限制动脉粥样硬化形成中的功能。

ApoE-null小鼠是一种广泛使用的动脉粥样硬化模型。这些小鼠的主动脉显示氧化应激和炎症增加，内皮功能下降^17–19,33动脉粥样硬化刺激物（如oxLDL）在EC中诱导NF-κB信号传导，从而驱动EC上粘附分子的表达，在动脉粥样硬化发生过程中介导单核细胞与EC的相互作用。事实上，我们观察到血管内皮细胞中AIP1的缺失增强了oxLDL诱导的NF-κB（和JNK）信号传导、粘附分子的基因表达、趋化因子和单核细胞粘附。值得注意的是，AIP1缺失对EC中oxLDL和TLR2/4信号传导的影响相似，提示AIP1在这些途径中具有共同的功能。一种可能的解释是oxLDL利用TLR2/4激活血管内皮细胞中的NF-κB和JNK通路³⁵OxLDL还利用独特的受体在EC中诱导细胞内信号传导。研究表明，凝集素样OxLDL-receptor-1（LOX-1）是一种在结构上不同于内皮表面清道夫受体的膜蛋白，参与了OxLDL-诱导的NF-κB活化、内皮功能障碍和动脉粥样硬化^36–38研究AIP1是否以及如何在LOX-1介导的信号传导中发挥作用将是一件有趣的事情。除NF-κB和JNK信号外，动脉粥样硬化刺激物（如oxLDL）也可诱导EC细胞内ROS的生成，进而可能导致EC功能障碍^39–41我们之前已经证明了ApoE^−/−小鼠表现出氧化应激增加，NO生物利用度降低和EC功能障碍，抗氧化蛋白线粒体硫氧还蛋白-2（Trx2）的EC特异性表达降低ROS，保护EC功能，并减少ApoE的动脉粥样硬化进展^−/−模型³³相反，目前的研究表明，AIP1缺失会在动脉粥样硬化早期增加高脂血症诱导的EC功能障碍（基础NO活性降低），并且AIP1可以限制动脉粥样硬化刺激诱导的血管内皮氧化应激。AIP1调节细胞内ROS的机制需要进一步研究。

综上所述，我们目前对动脉粥样硬化小鼠模型的研究为人类全基因组关联研究（GWAS）提供了证据，该研究认为AIP1是冠心病的易感基因¹⁶对动脉粥样硬化期间AIP1表达调控的未来分析应有助于确定AIP1是否是预防动脉粥样硬化和其他血管疾病的潜在治疗靶点。

补充材料

致谢

脚注

参考文献