胆碱能细胞中的刺猬信号

摘要

简介

胆管树中的细胞主要是目标被称为胆管疾病的各种病理过程。一旦受损，导管细胞就会发生反应，并开始在复杂的细胞串扰中发挥关键作用，这种串扰在不同的损伤后协调肝组织重塑(1). 这方面最重要的最新发现之一是，胆管细胞既能产生Hedgehog（Hh）配体，也能对其做出反应，Hedgehog（Hh）配体是胚胎发生过程中控制祖细胞命运和组织构建的发育形态原。对培养细胞、患病人类肝脏样本及其相应动物模型的研究揭示了Hh信号与健康肝脏以及肝损伤期间胆管细胞生物学的相关性，损伤损伤后的恢复阶段已经消散(表1). 因此，本综述的目的是总结关于Hh信号和胆管细胞的现有知识。

HEDGEHOG通路：从发育中汲取经验教训以理解成人组织重塑

在发育中的胚胎中，不同类型的细胞在不同的发育阶段产生Hh配体。例如，原始外胚层中的细胞合成并释放Hh配体，以指导原肠胚形成期间发生的细胞命运决定；在后来的发展中，在产生胸腺、骨髓、血管、皮肤、骨骼和各种内脏器官的干/祖细胞中也发现了类似的过程。(2,三)虽然尚未对发育中的肝脏进行Hh配体生成和Hh反应细胞的系统定位，但众所周知，腹面内胚层（包含最终成为肝祖细胞的细胞）产生Sonic hedgehog（Shh）配体对心脏场发出的肝脏特异性信号作出反应，以指示沿着肝脏的内胚层分化，而不是胰腺细胞的命运。(4)此外，在人类胚胎中，围绕导管板的未成熟肝细胞被证明会产生Hh配体，在小鼠肝脏发育第11.5天，Hh反应细胞沿着肝窦被证明存在。(5)此外，对克隆人干/祖细胞培养物的研究表明，Hh信号传导是此类细胞最佳生存能力所必需的，因为Hh信号拮抗剂环胺的治疗会引发胎儿祖细胞凋亡的急剧增加。(5)

在成人肝脏中，祖细胞被认为沿Hering管分布。后者是导管板的残余物，构成肝内胆道树的最近端。成年肝祖细胞是双能的，即能够产生最终分化为肝细胞或胆管细胞的后代。人类双能祖细胞被称为“成肝细胞”，而小鼠中的类似细胞根据其外观被指定为“卵形细胞”（具有卵形核的小细胞）。(6)在这篇综述中，我们将啮齿动物和人类的双能祖细胞都称为成肝细胞，而其异质、未成熟的后代则称为肝细胞衍生物。小肝细胞和未成熟导管细胞是成肝细胞衍生物的例子。(图1)

在单独的窗口中打开

在单独的窗口中打开

图1

成肝细胞、成肝细胞衍生物和成熟肝上皮细胞中的刺猬通路成分

（A–B）肝祖细胞产生子代，最终分化为肝细胞或胆管细胞。在这里，我们将啮齿动物和人类的双能祖细胞称为成肝细胞（低水平），其未成熟后代称为肝细胞衍生物（中等水平）。小肝细胞和未成熟导管细胞是成肝细胞的衍生物。成肝细胞和成肝细胞衍生物都表达Hh配体和Hh靶基因。（A） 在未损伤的肝脏中，成熟胆管细胞表现出Hh配体和Hh靶基因的弱表达，而这些因子在成熟肝细胞中从未表现出来（B）在损伤的肝脏，胆管细胞开始产生Hh配子并强烈表达Hh靶蛋白，而肝细胞获得释放Hh配物的能力。

通过免疫组织化学和/或肝细胞蛋白表达的Western blot分析，以及肝细胞mRNA的实时PCR分析，小鼠和人类的成肝细胞和成肝细胞衍生物均能产生Hh配体（例如，Sonic hedgehog–Shh或Indian hedgehog–Ihh）。这些细胞也可能传播（即对Hh配体启动的信号作出反应），因为类似的方法已经证明，它们表达Hh配子受体Patched（Ptc），以及胶质母细胞瘤（Gli）转录因子家族的成员。(7,8) (图1A)

Gli1、Gli2和Gli3是信号转导通路的下游靶点，当Hh配体与Patched结合时，Patched被激活，Patchet是控制Smoothened（Smo）激活的Hh配体膜跨越受体。在没有Hh配体的情况下，Smo活性会被Ptc抑制，但Hh配体与Ptc的结合会减轻这种抑制，并导致细胞内信号的传播，最终导致Gli因子的核定位，这些因子会反式激活（通常通过Gli1和Gli2）或反式再表达（通常通过截短形式的Gli3）Hh靶基因表达(9). 因此，Hh应答细胞可以通过对Gli2进行核染色，以及通过表达Gli2转录靶点的mRNA来识别，如Gli1、Hh相互作用蛋白（Hhip）或ptc。(图2)另一方面，由于其他信号通路也控制Hh调节基因的表达，并且Gli因子的功能可以通过转录后机制进行调节，因此通常需要各种互补方法来确认/反驳Hh启动信号在任何给定细胞中的功能重要性(10).

在单独的窗口中打开

图2

刺猬途径细胞内信号

（A）通道关闭。在没有Hedgehog配体（Hh）的情况下，Hh反应细胞表面的跨膜受体Patched（Ptc）保持共受体Smoothened（Smo）处于非活性状态。“游离”-Ptc沉默Smo依赖的下游细胞内信号，Hh调节的转录因子经历多重磷酸化，导致其失活和蛋白酶体降解。因此，Hh-调节转录因子的核转位被阻止，并且该途径被关闭路径打开。当细胞外微环境富含可溶性HH配体时，它们与受体PTC和这种相互作用SMO结合，SMO转化为其活性形式。SMO的激活抑制HH转录因子降解，导致细胞内信号级联，最终驱动Gli家族锌指转录因子的激活和核移位，从而诱导Hh靶基因的表达（例如Glis、Ptc、Smo和Hh相互作用蛋白、Hhip）。

如下文所述，通过阻断Hh配体和/或抑制Smo活化以影响成人肝祖细胞命运的显著变化的药理学和/或遗传学方法，已证明Hh途径在成人肝前体细胞和某些其他类型的成人肝细胞（例如肝星状细胞）中的生物学相关性。相反，现有证据表明完全成熟的肝细胞对Hh无反应(5) (图1A)尽管这些细胞在受伤时会上调Hh配体的生成(11) (图1B). 成熟胆管细胞的Hh反应性问题更难解决：技术问题困扰着在成年胆管树不同部位的成熟胆管细胞中实现Hh信号定向阻断的努力，而对less-specific策略产生的数据进行解释时，由于祖细胞通常位于成人肝脏的导管室，这一事实令人困惑。(图1A–B)

尽管存在这些挑战，但功能丧失和获得方法确实支持Hh途径激活在成人肝脏修复中的作用。在部分肝切除术（PH）后，Hh配体和各种Hh靶基因的表达增加，这对肝脏再生具有重要刺激作用。此外，PH后立即用环胺治疗啮齿动物，实际上消除了表达成肝细胞标记物的细胞在PH后的典型扩张，阻止了肝细胞和胆管细胞增殖的正常代偿性增加，并导致几乎所有小鼠在72小时内死亡(12)在啮齿类动物胆道结扎（BDL）后的胆汁淤积性肝损伤期间，Hh配体的肝脏表达显著增加，Hh通路活性上调。在这个模型中，Hh途径激活伴随着导管型祖细胞和肌成纤维细胞在肝脏的显著积聚。当胆道梗阻被逆转时，Hh配体的产生、通路的激活和其他反应均平行减弱。(13)此外，基因改变损害Hh信号沉默的小鼠表现出加重的导管和纤维生成反应。(7)毒物诱导的肝损伤后，Hh配体生成和Hh途径活性的类似损伤相关诱导已被证明。在这种模型中，肝祖细胞、肌成纤维细胞和肝纤维化的积累与Hh途径激活水平相关，并且在有导致Hh途径过度活性缺陷的动物中显著放大。(14–17)因此，在受伤的成年肝脏中，表征产生Hh配体并对其作出反应的细胞类型变得很重要。越来越多的实验证据表明，胆管细胞是这些反应的主要参与者。因此，审查的其余部分将对该信息进行总结。

胆母细胞：一种新发现的刺猬配子来源

儿童和成人健康和疾病肝脏的免疫组织化学分析表明，导管细胞能够产生Shh和Ihh配体。各种胆道应激源增加了Hh配体的生成，包括大胆管机械性梗阻（BDL）、干扰胆道转运的各种遗传疾病（PFIC-1、PFIC-2、Alagille综合征）、胆管细胞的推定/证实病毒感染（胆道闭锁）、，免疫介导的胆道疾病发作（原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎）。(7,8,18)当肝细胞被毒素（如乙醇、乙硫氨酸）损伤时，出现导管的细胞也会可变地产生Hh配体(11,19)，营养因素（蛋氨酸胆碱缺乏、肥胖相关肝病）(14–17)和/或病毒感染（如乙型肝炎、丙型肝炎）。(20)慢性病毒性肝炎相关肝硬化患者包裹肝癌结节的基质组织中，Hh配体的导管细胞生成增加。（参考）

通过实时PCR和Western blot/免疫细胞化学研究表明，正常大鼠胆管细胞-NRC1和小鼠603B等胆管细胞系以及从健康成年啮齿动物分离的初级胆管细胞分别表达Hh配体mRNA和蛋白质(7,21). 此外，这些细胞释放生物活性的Hh配体，这些配体能够在稳定转染了Gli-luciferase报告结构的其他细胞中激活Smo依赖性信号。(22)

调节Hh配体导管细胞生成的机制尚不清楚。与肝星状细胞一样(23)在培养的胆管细胞中，血小板衍生生长因子（PDGF）BB（一种由激活的胆管细胞产生的因子）刺激Shh的表达，PI3K和/或AKT抑制剂作用于PDGF-BB的下游以抑制这一过程。(13)体外用外源性PDGF-BB激活胆管细胞可诱导产生含有生物活性Ihh和Shh配体的外泌体。这些外泌体被释放，使胆汁细胞能够以旁分泌的方式触发邻近肝细胞的Hh信号传导。(22)已证明，在BDL等刺激原位胆管细胞的损伤后，血浆和胆汁会显著富集膜相关的Hh配体(22)增加了这种肝源性Hh配体也可能触发Hh应答细胞中的Hh信号传导的可能性，这些细胞位于胆道或肝静脉流出（例如肠、心脏或肺）的“下游”的其他组织中。在许多类型的肝损伤中，肌纤维母细胞位于导管型细胞附近，跨孔共培养系统表明，肌纤维成纤维细胞产生可溶性因子，激活导管细胞中的Hh信号，表明旁分泌机制也可能增加Hh靶基因的胆管细胞表达。抗体中和研究表明，这种肌纤维母细胞衍生因子包括Hh配体，但也可能涉及其他因子（例如TGF-β）(7,13)

软骨细胞纤毛和对刺猬信号的反应

直到最近，Hh通路信号转导的范式还假设了两个不同分区之间的串扰：1）Hh配体生成细胞（通常为上皮细胞）和2）Hh应答细胞（通常是间充质细胞）。(9)然而，现在有证据支持另一种模型，在该模型中，至少一些配体产生的上皮细胞本身具有Hh反应性。如上所述，胆管细胞似乎能够产生Hh配体并对其作出反应。对啮齿类动物和人类的初级导管细胞、细胞系和肝组织的检查表明，胆管细胞不仅产生Hh配体，而且拥有传递Hh信号所需的所有机制，包括Ptc、Smo和Gli家族转录因子。此外，各种在体外和体内Hh通路活性的操纵改变了导管细胞中Hh靶基因的表达和/或Gli依赖性转录活性，证明这些细胞确实对Hh有反应。

有趣的是，像其他对Hh敏感的脊椎动物细胞一样，胆管细胞具有功能性的初级纤毛(24)突起于细胞膜，作为Hh-信号中心。(25,26)越来越多的证据表明，Smo在其激活过程中定位于初级纤毛，而Ptc在没有Hh配体的情况下抑制了这一事件。(27,28)Hh阻遏物Gli3也定位于纤毛，因此，纤毛功能障碍可导致Gli3异常定位，进而抑制Hh信号。(29)还证明了初级纤毛中Smo的Hh依赖性激活、Gli2转运和Gli2介导的转录激活之间的联系：重组Shh配体导致Smo和Gli1分别积聚在纤毛膜和睫状尖端内，这些事件发生在Gli2进入细胞核并激活靶基因之前，并且是必需的。(30)越来越多的证据表明，各种遗传性睫状体缺陷和获得性睫状病变会不同程度地干扰（即激活或抑制）Hh信号，进一步支持了初级纤毛在调节Hh反应细胞中Hh通路活性方面的重要性(31,32). 虽然睫状体事件在胆管细胞Hh信号转导中的作用尚未得到证实，但最近一项优雅的研究证明，胆汁中的外泌体与初级纤毛相互作用，调节胆管细胞增殖，从而支持了这一概念。(33)

HEDGEHOG信号传导：获得受损胆管细胞“反应性”表型的关键

Hh信号转导对胆管细胞表型的影响在过去几年中得到了广泛的研究。在健康成人肝脏中（几乎检测不到Hh信号），胆管细胞的增殖指数很低，因此被认为处于有丝分裂休眠状态。然而，在胆道损伤后，存活的胆管细胞开始增殖并获得所谓的“反应性表型”。(1)这些反应性导管上皮细胞具有以下特征：1）活性增强（凋亡/增殖减少），导致导管细胞数量增加；2） 增加趋化因子/细胞因子的分泌，以招募免疫细胞并促进炎症；3） 通过诱导上皮细胞向间充质细胞转化（EMT）和/或阻断上皮分化而丧失上皮特征；4）产生促成纤维因子，激活并吸引产生基质的肌纤维母细胞，促进胆道纤维化。导管细胞室的扩张（即反应性导管细胞和募集的免疫细胞和肌原纤维细胞）被称为损伤的导管反应(图3). 反应性胆道上皮细胞被认为是胆道纤维化的起搏器。如上所述，反应性胆管细胞（PDGF-BB）产生的至少一种因子导致肌成纤维细胞和胆管细胞产生Hh配体。而后者反过来又有力地放大了反应性胆管细胞表型的各个方面。因此，一旦在微环境中释放，Hh配体会驱动导管细胞中反应性表型的获得/保持，因此，Hh途径的激活在决定导致胆管细胞激活（即导管反应）的所有条件的结果中起着关键作用。目前已知后者包括儿童和成人的各种胆道疾病，以及各种类型的肝实质损伤。

在单独的窗口中打开

图3

Hedgehog通路与胆管细胞反应表型

当损伤发生时，胆管细胞获得所谓的“反应性表型”，该表型具有4个关键特征：（1）凋亡减少/增殖增加（导致导管细胞数量增加）；（2） 增强趋化因子和细胞因子的分泌（招募免疫细胞促进导管周围炎症）；（3） 产生促成纤维因子，如PDGFBB（驱动产生基质的肌成纤维细胞的积累和激活）；（4） 上皮特征的丧失和更多间充质表型的获得，即电子皮质醇到-M（M）本质的T型转移，EMT（阻断上皮分化并导致胆道纤维化）。这些反应性胆管细胞和他们招募的细胞产生Hh配体。Hh配体反过来通过作为a）促纤维生成、b）促炎症、c）营养和d）EMT诱导信号反馈和重新增强反应性导管表型。因此，富含Hh的微环境使导管反应永久化。由于Hh途径驱动胆管细胞中反应性表型的获得/永存，因此现在被认为是所有以胆管细胞激活和导管反应为特征的疾病中的关键因素。

HEDGEHOG信号与胆囊瘤

有证据表明Hh信号调节胆管细胞凋亡和存活之间的微妙平衡，可以想象Hh通路参与胆管癌的发病机制。事实上，Hh信号的生物学意义现在已被其他几种癌症所接受。几年前，在一些胆管癌细胞系中发现了Hh的转录活性。(34)然而，这一发现的潜在意义直到最近才被证明，TRAIL及其至少一个死亡受体（即DR4）的表达受Gli-family转录因子控制，才变得明显。Hh-诱导转录因子Gli3激活DR4启动子并抑制DR4转录。(35)Gli3还通过直接抑制miR-29b的转录，增强抗凋亡因子Mcl-1在胆管细胞中的积累，miR-29b是一种通常促进Mcl-1降解的因子。(36)因此，Hh途径的激活可能有助于促进胆管癌细胞的存活。有证据表明，此类细胞DR4表达减少，Mcl-1积累增加，支持这一概念。

结论

在过去的五到六年中，积累了大量证据，证明Hh信号调节胆管细胞对各种生理和病理条件的广泛反应。因此，Hh途径值得纳入调控胆管细胞活性和分化的复杂信号网络。Hh信号对获得免疫调节和促纤维生成表型特别重要，这是损伤肝脏中反应性导管细胞的典型表现。其他信号通路和转录后机制如何调节导管细胞中Hh通路的激活尚不清楚。这一领域的进一步研究可能会为胆管疾病和胆管癌的治疗确定新的治疗靶点。

脚注

工具书类