肝纤维化治疗方法的发展

摘要

临床问题

纤维化是ECM的过度积累，是由慢性非溶解性炎症引起的。这种炎症会引发伤口愈合过程，减轻炎症组织的破坏，但也会导致疤痕组织的形成。肝纤维化主要由慢性乙型或丙型病毒性肝炎、自身免疫性和胆道疾病、酒精性脂肪性肝炎（ASH）和非酒精性脂肪肝炎（NASH）引起(1–5)。虽然轻度纤维化在很大程度上仍无症状，但其发展为肝硬化，即瘢痕组织替代功能性实质，伴有严重的结构和血管变形，是肝脏相关发病率和死亡率的主要原因。肝硬化的临床后遗症是（a）肝脏合成（功能）衰竭，包括止血、氮处理和解毒系统失效；（b） 门脉高压，继发腹水和食管或胃静脉曲张出血；（c） 对感染的高度易感性；（d）发生肝细胞癌（HCC）的高风险(2)。预防措施，如针对乙型或丙型肝炎的抗病毒治疗方案，已经在减少病毒性肝硬化和肝癌的负担，但其他原因，如NASH（与肥胖和2型糖尿病有关）正在成为中心问题。此外，许多患者最初在临床上出现晚期纤维化或肝硬化，这在很大程度上是不可逆的。因此，迫切需要预防肝硬化进展或诱导晚期纤维化和肝硬化逆转的抗纤维化药物(6–9).

肝纤维化的进展和逆转

研究揭示了决定纤维化进展（纤维化发生）和消退（纤维化溶解）的关键机制和细胞(1–19)。值得注意的是，肝纤维化与其他器官（如肺和肾）的纤维化有很多共同之处，这导致了跨器官界限研究的交叉受精。纤维化ECM的结构成分、生长因子、细胞因子、趋化因子和蛋白酶，以及与纤维化发生和纤维化溶解有关的中央信号级联，在这些不同的组织中几乎是相同的(18,20–22)。重要的是，纤维化不再被认为是静态的，而是持续重塑过程的结果。尽管如此，与肾脏和肺部相比，肝脏具有非凡的再生能力，即使在晚期纤维化的情况下也是如此。

纤维化与伤口愈合密切相关，可防止组织在炎症、凋亡、坏死和溶解酶释放过程中解体。纤维化通常在组织损伤消失后几天到几周内逆转，如晚期啮齿动物和人类肝纤维化(2,8,9,23–25)。然而，损伤持续时间越长（通常在较低水平），沉积的ECM越多。这种慢性损伤会导致越来越多的无细胞疤痕组织，甚至在消除致病因素后，潜在的可逆性也会急剧下降(26,27)。纤维溶解效率低下是由以下几个因素造成的：（a）由于非典型ECM和适当细胞环境的丧失，缺乏有序细胞重新增殖和再生的线索，（b）晚期血管重塑伴结构畸变，（c）ECM成分（如纤维胶原）的广泛交联使蛋白水解去除困难，以及（d）消化瘢痕组织的细胞元素消失。在这里，我们讨论了促进纤维化进展的细胞和分子途径，并强调了当前的临床试验以及监测纤维化的改进方法。

细胞靶点和多细胞纤维生成单位

活化的肌成纤维细胞代表了一系列主要来源于肝星状细胞和门静脉成纤维细胞的类似ECM生成细胞，是纤维化ECM的主要产生者和肝纤维化最下游的细胞效应器（图​（图1）。1)。纤维化中很少有肝肌成纤维细胞来源于骨髓源性纤维细胞(12)。此外，肝细胞和胆管上皮向肌成纤维细胞的完全上皮-间充质转化（EMT）可能是罕见的事件，而这些细胞的“不完全”EMT具有纤维生成表型是常见的(28)。肌成纤维细胞及其产物是抗纤维化治疗的主要靶点，原则上，抗纤维化治疗将解决所有类型的纤维化，包括晚期纤维化。

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图1

肌成纤维细胞及其成纤维激活。

静止的门静脉成纤维细胞和肝星状细胞上游的细胞和主要因子，诱导转化为成纤维性肌成纤维细胞。该示意图强调了治疗肝纤维化的几个主要靶点。值得注意的是，ECM本身可以作为纤维生成和纤维溶解的调节剂。因此，胶原原纤维被LOXL2交联，这有助于降低晚期纤维化的可逆性，以及胶原结合ECM受体（尤其是整合素α1β1、α2β1和α11β1）传递应力或应力松弛信号，以维持成纤维细胞的成纤维激活或诱导其纤溶活性。此处未显示纤维生成激活的其他次要因素（有关详细信息，请参阅正文）。腺苷2A受体；AT1R、血管紧张素1受体；CBR1，大麻素受体1；内皮素-1、内皮素-1；内皮素A受体；FXR，法尼类X受体；Hh（R）、刺猬（受体）；Int，整合素；溶血磷脂酸受体1；神经生长因子受体；PTX2，戊四氮2；TRAILR，TNF-相关凋亡诱导配体受体；YB-1，Y-box结合蛋白。

重要的是，位于肌成纤维细胞上游或与细胞单位内的成纤维激活紧密相关的额外细胞元素可为补充性和更具疾病特异性的抗纤维化方法提供基础。鉴于不同细胞类型之间的串扰通常是纤维原性激活的基础，联合治疗方法可能更有效。从概念上讲，根据其组成细胞类型，可以定义三个主要的多细胞功能单位：（a）周细胞/血管周细胞，即肝星状细胞、肝窦内皮细胞（LSEC）、巨噬细胞/枯否细胞和肝细胞；（b） 基质炎症-肌成纤维细胞、T细胞和巨噬细胞；和（c）门静脉/门静脉周围-胆管细胞/导管细胞、门静脉成纤维细胞和各种炎症细胞（参考文献。8和图​图2，2，A–C）。这些功能单元内相互作用的改变导致了主要的多细胞纤维生成途径。

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图2

纤维生成和纤维溶解的多细胞背景。

图中显示了在设计有效的抗纤维化策略时应在其复杂性中解决的假定主要细胞功能单元和分泌因子。(A类)血管单位。(B类)胆汁单位。(C类)炎症单位。(D类)影响巨噬细胞极化的细胞和因素。巨噬细胞（以及作为巨噬细胞前体的单核细胞）是炎症和组织重塑的主要调节剂。诱导M1或M2极化的细胞和因子也与成纤维Th17细胞的生成和中性粒细胞的募集有关。详见正文。B类和C类中未显示的突出显示因子A类和B类分别是。嗜碱性粒细胞；EO，嗜酸性粒细胞；肥大细胞；中性粒细胞；金属蛋白酶组织抑制剂。

成纤维效应器

胆汁祖细胞。

胆道纤维化的特征是胆道祖细胞（活化的胆管细胞）的增殖，这些祖细胞往往形成小簇或通常无功能的胆管结构，称为胆管反应。这些细胞复制导管板形成的早期发育程序，包括分泌一些因子，吸引并激活肝星状细胞/肌成纤维细胞增殖并沉积ECM。这种胆汁祖细胞反应被周围的肌成纤维细胞放大，也被释放维持导管细胞活性和增殖的分子的炎症细胞放大（图​（图3）。三)。除了婴儿纤维化（胆道闭锁、卡罗里氏病、先天性肝纤维化）和成人原发性胆汁性肝硬化（PBC）、原发性硬化性胆管炎（PSC）和继发性胆道纤维化外，所有其他病因的肝病一旦进展，就会发展为门脉纤维化，伴随着胆道祖细胞的增殖，特别是当肝细胞过度凋亡迫使干细胞生态位产生胆汁祖细胞时。这些胆汁祖细胞对氧化应激增强和肝细胞死亡更具抵抗力，如ASH、NASH或严重的移植后丙型肝炎诱导的死亡(55–60)。针对胆道纤维化祖细胞的药物是啮齿动物胆道和晚期非胆道纤维化的有效抗纤维化药物。例如胆道祖细胞特异性整合素αvβ6的拮抗剂（纤维连接蛋白和tenascin-C的受体，以及潜在TGF-β1的激活剂）(61–63)或抑制hedgehog通路，该通路主要在胆道纤维化和癌变中上调(56–59,64,65)。值得注意的是，抑制刺猬信号抑制磷脂翻转酶中的胆道纤维化，甚至逆转肝细胞癌(马里兰州2)基因敲除小鼠(65).

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图3

活化的胆管细胞是纤维化进展的驱动因素。

活化的胆管细胞即使不完全相同，也与胆道祖细胞有关。这些细胞在活动性胆道疾病和大规模肝细胞生长停滞或凋亡期间增殖，如严重的NASH、ASH或病毒性肝炎。胆汁祖细胞经常出现在更晚期的纤维化中（尤其是梅塔韦F2期或更高）。他们通过分泌促纤维生成因子、招募和激活肌成纤维细胞、Kupffer细胞、单核细胞和其他炎症细胞（如T细胞和NKT细胞）诱导门脉纤维化基质来复制导管板的形成。招募的肌成纤维细胞（和炎症细胞）分泌因子和ECM成分，维持这些纤维生成单位，并支持其分化为更成熟的胆道结构，这些胆道结构嵌入富含胶原蛋白的ECM中。

其他相关分子靶点

其他几个分子靶点也很有趣，其中一些已经进入临床研究。ECM交联主要由原纤维胶原组成，主要由赖氨酰氧化酶（LOXL2）介导。LOXL2可能在纤维化逆转过程中阻碍ECM降解，在一项关于CCL4诱导的肝纤维化的小型研究中发现了抗纤维化活性(98)。阻断LOXL2活性的人源化抗体目前在最大的肝纤维化临床研究中进行了评估（表​（表11而且​和22).

表1

以肝纤维化为主要终点的主要研究（病毒性肝炎、酒精性肝炎和胆道纤维化）

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表2

以肝纤维化为主要终点的研究（NASH和自身免疫性肝炎）

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TLR是细菌、病毒和外来抗原的传感器。TLR广泛表达，但在先天免疫系统的细胞上表现突出，创造了一个促炎环境并激活适应性免疫以促进病原体消除。作为肠道和体循环之间的主要接口，肝细胞配备了多种TLR，这些TLR在面临（微生物）危险信号时，对维持免疫耐受、引发炎症和修复至关重要(99)。肝纤维化与细菌脂多糖及其受体TLR4的激活存在直接联系。脂多糖在肠道通透性增强的情况下进入门脉肝循环，如ASH、NASH和其他肠道和肝脏疾病。LPS上调单核细胞和巨噬细胞/Kupffer细胞的趋化因子分泌，并下调抑制性TGF-β1假受体Bambi，其累积使肝星状细胞/肌成纤维细胞对成纤维激活敏感(99,100)。因此，防止TLR4过度激活或抑制TLR4是抑制纤维形成的有吸引力的策略。目前，只有肠外TLR4拮抗剂厄立特里亚四钠用于治疗脓毒症的研究(101)。其他有趣但很少探索的靶点包括TLR3，这是一种双链RNA传感器，其被polyI:C激活可通过激活NK细胞减轻肝纤维化(102)和TLR9，双链细菌DNA的受体，通过释放CCL2增强纤维生成免疫激活(103)。此外，除CCR2/CCL2外，肌成纤维细胞、T细胞和巨噬细胞上广泛表达的趋化因子系统抑制剂，主要是CXCL4和CCL5（及其受体分别为CXCR4和CCR5），已被证明可以减轻肝纤维化(104–106)。此外，最近与microRNAs（miRs）相关的数据爆炸式增长揭示了抑制（miR-29b）或促进纤维形成（miR-199、miR-200等）的miRs(107–109)。虽然这些miR似乎对肌成纤维细胞有一定的特异性，但其体内高效传递存在问题。

TGF-β及其下游介质结缔组织生长因子（CTGF）是肝星状细胞/肌成纤维细胞的有效促纤维化细胞因子(1,2,6,9,10,18,19)。然而，由于这种细胞因子对细胞分化、免疫调节（抑制过度T细胞活化）和调节伤口愈合（如动脉粥样硬化中的血管斑块稳定）至关重要，它们的一般性和非靶向性抑制会带来风险，尤其是对TGF-β中和剂而言(110).

临床前概念验证

在进入临床研究之前，需要在反映人类肝纤维化不同方面的补充啮齿动物模型中获得抗纤维化活性的最佳临床前证据(6)。此外，在从手术中获得的精确切割的人肝切片培养物中进行药物测试，可以首次转化为人体体内系统(111).

联合疗法

以多管齐下的方法治疗肝纤维化的联合疗法在未来的治疗中前景广阔，理想的靶向是细胞、可溶性介质、ECM及其受体之间的相互作用和/或相关的细胞内信号。靶向抗纤维化药物的组合尚未在临床前研究中进行彻底测试。在几种啮齿动物纤维化模型中，严格验证不同剂量的组合需要花费大量的费用和精力。然而，可以预期特定药物的组合会干扰纤维形成、诱导纤维溶解或处理不同的细胞类型。

只有随着改良的非侵入性生物标记物和技术的出现，以测量纤维化，尤其是纤维化发生，才能保证彻底疗效和低毒性的联合疗法的临床开发才是可行的。此外，只有使用这些生物标记物，才有可能对肝纤维化或肝硬化患者进行必要的个性化治疗，允许根据易于测量的治疗效果调整不同的药物及其剂量。

在临床试验中测试抗纤维化药物

最近进行的有效因果治疗的临床试验表明，晚期肝纤维化具有可逆性。也许最好的例子是一项对348名慢性乙型肝炎患者进行的研究，这些患者接受了强效抗病毒药物替诺福韦的治疗(112)。五年后，在研究开始时，91%的有明显纤维化的患者观察到纤维化的消退。252名患者中只有12名（5%）出现纤维化进展，而基线时患有肝硬化的96名患者中有71名（74%）在第五年不再肝硬化。此外，在第五年，除一名患者外，所有患者的Ishak纤维化评分都至少降低了两个单位（可能总共减少了六个单位），这一差异强烈排除了活检取样的可变性。虽然一些额外的人体研究也表明了替诺福韦的抗纤维化活性，但其他研究没有显示出效果。桌子​表11和​和22列出过去和当前以肝纤维化为主要终点的临床研究，以及补充表1（可在本文的网上获得补充材料；doi:2017年10月17日/JCI66028DS1)显示肝纤维化作为次要终点的研究。表​表3三重点介绍与肝脏相关的其他纤维化疾病的临床研究。针对主要多细胞纤维生成途径的临床研究如表所示​表4。4我们还总结了使用干细胞的试验，这种方法与药物治疗相结合很有吸引力（表​（表5）。5)。值得注意的是，开发工作主要集中于细胞外靶点，因为细胞内靶点不太容易获得，并且往往缺乏对纤维生成细胞的特异性。

表3

以纤维化为主要终点的肺、肾和其他纤维化研究

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表4

具有抗肝纤维化潜力的其他适应症的临床试验药物

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表5

肝纤维化和肝硬化的干细胞治疗

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评估纤维化

肝纤维化进展的评估远比肺或肾更困难，因为转氨酶与纤维化或纤维化发生无关，肝功能参数，如白蛋白或凝血酶原时间（蛋白质合成）通常仅在肝硬化中改变。肝活检仍是抗纤维药物研究的标准。然而，肝活检具有侵袭性和风险性(2,6,8,60,114)并且容易产生相当大的采样误差，其解释受到观测者之间的可变性的影响。即使在分层良好的队列中，鉴于纤维化进展通常较慢，传统的纤维化分期（Metavir，Ishak）可能需要大约200名患者在两到三年的时间内进行研究，以检测治疗组之间纤维化的20%-30%差异。然而，通过纳入目前纤维化进展的替代物，似乎可以在12个月或更短时间内对大约100名患者进行验证试验。

结论

我们对肝纤维化和逆转的细胞和分子机制有了显著的了解，甚至在临床前模型中逆转肝硬化似乎是可行的。目前，该领域已朝着临床翻译方向发展。由于抗纤维药物处理嵌入复杂多细胞网络中的机制，其疗效预计取决于上下文。联合疗法最有希望，但其开发和使用需要个性化的医学方法，这取决于新的非侵入性标记物和技术的开发和验证，以量化肝纤维化，尤其是纤维化形成。

补充材料

鸣谢

脚注

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