体外Wnt驱动再生诱导单个Lgr5+肝干细胞的扩增

摘要

静止的干细胞被认为存在于胆管中⁹基于Sox9和Foxl1的谱系追踪已经证明了这种细胞的存在^10–13在成人肝脏中，Wnt通路仅在围绕中央静脉的肝细胞（静脉周围肝细胞）中活跃¹⁴在胆管中，Wnt信号在肝损伤后变得活跃¹⁵因此，通用Wnt报告人的活动Axin2-LacZ¹⁶仅在静脉周围肝细胞中检测到，并且在CCl诱导肝损伤时上调₄注射¹⁷(补充图1a–b). 损伤后第3-6天出现最大表达(补充图1c). 通过微阵列分析，我们注意到Wnt6（>2倍）、若干响应蛋白（3-6倍）和许多以前在肠隐窝细胞中表现出特征的Wnt靶基因的诱导⁸，包括Lgr5级（≥2倍）。值得注意的是，静脉周围肝细胞Wnt靶基因(Glul、Slc1a2、Rhbg、Cyp1a2)¹⁴下调，意味着Wnt激活发生在静脉周围肝细胞外(补充图1d;补充表1).

未经处理的Lgr5-LacZ公司敲除小鼠¹,Lgr5-LacZ公司表达基本上无法检测(图1a). CCl时₄治疗后，小细胞组出现明显的报告活性（第5-6天达到峰值）(图1b和补充图2a–c). 这些Lgr5⁺表达的细胞Sox9指数，一个相对广泛的导管祖细胞标记^10,12–13，但没有成熟的肝细胞或星状细胞标记物(补充图2d–f). CCl基因表达谱₄-诱导Lgr5⁺细胞与胆管细胞密切相关，但与肝细胞无关(补充图1g). 与胆道图谱的比较显示，肝脏Lgr5中富集了多个Wnt靶基因和多个肠道Lgr5干细胞基因⁺单元格(¹⁸; (补充图2g和补充表2–三).

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图1

肝损伤导致Lgr5⁺双潜能肝祖细胞

a–b,Lgr5-LacZ公司小鼠IP注射玉米油（n=6）（a）或玉米油中单剂量CCl4（1ml/kg）（n=6）（b）六天后，处死小鼠，收集肝脏进行β-半乳糖染色。一，未受损肝脏不表达Lgr5-LacZ公司。 b条,CCl4上，强Lgr5-LacZ公司在导管附近的小细胞中检测到表达。比较Lgr5-LacZ⁺细胞（箭头）与相邻肝细胞（星号，*）。比例尺，200μm（顶部面板）和30μm（底部面板）。c（c）,Lgr5-ires-CreERT2型小鼠与Rosa26R-LacZ公司Cre报告鼠。后代接受CCl4的单次IP注射，2天后用三苯氧胺（3mg/只小鼠）诱导CreERT2活性，如方案所示。显示CCl4损伤时Lgr5细胞谱系追踪的代表性图片（n=8）。比较LacZ之间的大小差异⁺三苯氧胺诱导后第2天和第4天的细胞（箭头）和肝细胞（星号*）。每一天的精彩程度都是一样的。比例尺，500μm（顶部面板）和50μm（底部面板）。d日,Lgr5-ires-CreERT2型x个Rosa26-LacZ公司用DDC喂养后代（n=3），4和6天后用三苯氧胺诱导CreERT2活性，如方案所示。显示阳性肝细胞的典型图片(d日′）和阳性导管细胞(d日″). 坦，他莫昔芬。比例尺，200μm(d日)，25微米(d日′）和50μm(d日″).

然后，我们的目标是通过谱系追踪来可视化Lgr5的后代。这个Lgr5-EGFP-ires-CreERT2型等位基因¹在肝脏中永久沉默。因此，我们生成了一个新的Lgr5级插入等位基因爱尔兰CoreERT2进入其3′UTR(补充图3a)我们把这些老鼠和R26R-LacZ公司记者¹⁹单次三苯氧胺注射后，在肠道中很容易检测到追踪事件，验证了该等位基因(补充图3b). 成年后代接受CCl治疗₄5天后，三苯氧胺激活了Cre活性。三苯氧胺诱导两天后⁺细胞可见，从第7天起演变为完全成熟的肝细胞(图1c). 自CCl以来₄诱导中心静脉损伤，我们还测试了两种“卵圆细胞反应”模型：MCDE（补充乙硫氨酸的甲硫氨酸胆碱缺乏饮食）²⁰和DDC（3,5-二乙氧羰基-1,4-二氢可待因）²¹在这两种模型中，很容易检测到肝细胞和胆管的追踪(图2d和补充图3d–f). 在没有肝损伤的情况下，在具有相同基因型的小鼠肝脏中未检测到任何追踪事件(补充图3c). 报告了类似的跟踪数据福克斯1^13,11.

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图2

体外从成人肝组织中扩增单个Lgr5细胞

a–c， Lgr5-LacZ公司小鼠注射玉米油或CCl4（IP）图1六天后，将肝组织分离为单细胞，装载荧光CMFDGβ-半乳糖苷酶底物，并通过FACS进行分析。分选的分离Lgr5-LacZ+细胞以1个单细胞的比例培养Lgr5-LacZ公司⁺阳性细胞/微孔（克隆），如补充方法.一，表示所用协议的方案。b条，CCl4处理（CCl4+）和非处理（无CCl4）肝脏分离单个细胞的典型FACS图。通过细胞大小（FSC vs SSC）和PI排除进行顺序选择后，对细胞进行门控。可行CMFDG⁺圆周率⁻对细胞进行筛选和排序。显示了代表性单元格。c（c），串行DIC图像显示单个Lgr5-LacZ公司⁺单元格。原始放大倍数：40倍（0-5天）、20倍（7-11天）、10倍（19天）和4倍（1个月后）。P、 通道。

鉴于Wnt依赖性Lgr5干细胞标记物的表达，我们推断在我们先前定义的器官样培养条件下，成人肝祖细胞可能会从导管室中扩增出来^2,4以前建立的肝脏培养方法通常会产生随着时间推移而衰老的细胞群^{10,13,22–24}除非细胞被转化。为了建立肝祖细胞培养，将胆管碎片嵌入含有“通用”类器官培养因子EGF和Rspo1的Matrigel中⁴添加FGF10、HGF和烟酰胺（膨胀介质，EM）。几乎所有碎片都形成了囊肿，并生长成更大的肝脏器官样体(补充图4a–b)，表示Lgr5级和导管标记(补充图4c). 没有EGF、Rspo1或烟酰胺，培养物在1-2代内恶化(补充图4d). 通过每周1:8的传代，培养物已经保存了12个多月。然后我们从Lgr5-LacZ启动单细胞（克隆）培养⁺单元格，FACS排序自Lgr5-LacZ公司单剂量CCl后的小鼠₄(图2a-b). 在我们定义的EM条件下培养的分选细胞迅速分裂并形成囊状结构，通过每周1:8的传代维持了8个月以上(图2c和补充图5e). 克隆培养和批量培养的核型分析表明，大多数细胞（约85%）的染色体数目正常，即使在8个月时也是如此(补充图4e)，与年轻成年小鼠肝脏中约25%的非整倍体水平一致²⁵重要的是，来自Lgr5-LacZ公司⁺细胞也可以在培养基中扩增4个月以上(补充图5a–e).

为了评估Lgr5细胞的谱系潜能，我们对克隆类器官进行了基因表达谱分析。微阵列分析显示克隆类器官与成人肝脏相似。Lgr5级和祖细胞标记，如Sox9指数,抄送44和舞会1¹⁰受到高度监管。克隆类器官表达多个肝细胞系标记物和胆管标记物，这意味着单个Lgr5细胞具有双潜能(补充图6a–f). 成熟肝细胞标记物仅弱表达或缺失(补充图7a，EM柱）。

标记分析表明，培养条件偏向于诱导胆汁细胞命运。诱导肝细胞成熟在体外，我们定义了分化介质（DM）。抑制Notch和TGFβ信号传导与胆道细胞命运决定有关体内^26–27诱导了约200个基因的表达。这些包括Tbx3，PPARγ，和骨形态发生蛋白2，对肝脏成熟至关重要^27–29以及成熟肝细胞标记物，如Cyp3a11、Fah、G6p基因和阿尔布(补充图7a–b). 我们还观察到一组参与胆固醇和脂质代谢的基因以及编码p450细胞色素的基因的诱导(补充图7c–d). 因此，祖细胞轮廓被关闭，这可以通过下调Lgr5级(补充图7a，DM列）。免疫荧光染色显示Hnf4a和白蛋白、基底膜蛋白Mrp4和紧密连接蛋白Zo-1的表达(图3a–d). 高达33%的细胞OC2-2F8肝细胞标记物阳性，流式细胞术分析显示高粒度，这是成熟肝细胞的特征(图3d和补充图7e). 还检测到肝细胞成熟的标志性双晶核(补充图7f). 值得注意的是，由于仍存在Krt19阳性细胞斑块，导管表型并未完全消除(图4d). 对分化后的类有机物进行了多项肝细胞功能测试。大约90%的细胞能够摄取低密度脂蛋白(图4e–f)和积累的糖原(图4g). 大量的白蛋白被分泌到培养基中(图4h)而肝细胞色素p450功能被诱导(图4i). 然而，这些在体外与新分离的肝细胞相比，肝细胞的功能仍然不太明显。

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图3

单细胞来源的肝类器官获得肝细胞命运并显示肝细胞功能体外试验。

a–i克隆Lgr5衍生培养物在扩张培养基（EM）中生长，并在分析之前转移到分化培养基（DM）中8–14天。分析了两种独立的克隆培养物。a–d共焦图像（z-stack投影）用于肝细胞特异性标记。一、HNF4α（红色）、白蛋白（ALB）（绿色）和EpCAM（灰色）。b条，MRP4（绿色）。c（c），ZO-1（洋红色）。d日、ALB（红色）KRT19（洋红色）和肝细胞表面标记物OC2-2F8（绿色，OC2-2F7标记物的完整描述补充图8). 用Hoechst对细胞核进行复染。e–f，使用Dil-ac-LDL荧光底物（红色）分析EM培养物中的LDL摄取(e（电子）)或DM(（f）)持续14天。只有保存在DM中的培养物含有底物（红色）。用DRAQ5对细胞核进行反染色。比例尺，50μm。克，通过PAS染色测定EM或DM中生长10天的类有机物中的糖原积累。图表显示PAS弱阳性或强阳性细胞的百分比。结果显示为10个EM或10个DM非依赖性有机物的10个独立切片的平均值±SEM。小时在EM或DM中保存8天（DM-8d）或13天（DM-13d）的克隆培养物的24h上清液中测定白蛋白（Alb.）分泌。结果以每细胞白蛋白pg表示。我，在DM中保存13天的培养物中测量Cyp3a活性。结果表示为每毫升百万个细胞的RLU。h–i分别以MEF、肝细胞（Hep.）和HepG2细胞作为阴性和阳性对照。分析了每种情况下的三种硅酸盐。结果显示为3个独立实验的平均值±SEM。***，p<0.0001。

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图4

克隆性肝器官移植后的肝细胞岛FAH公司^−/−-突变小鼠

来自3个独立克隆的单细胞衍生肝器官在EM下扩增并分化9天，然后移植到法赫^−/−/抹布2^−/−/Il2Rγ^−/−(FRG公司)老鼠。克隆I（n=8）、克隆II（n=6）、克隆III（n=5）。a、，显示移植协议的方案。b–d，肝实质内典型阳性移植物。b条，法赫⁺区域（克隆III）。移植细胞对Krt19呈阴性(c、，导管标记）和HNF4α阳性(日期：，肝细胞标记物）。比例尺，400μm(b条)和100微米(b条′–d日).e、，移植阳性小鼠的Kaplan-Meier生存曲线（棕色曲线，移植物+，n=5）、移植无移植证据的小鼠（蓝色曲线，移生物-，n=9）和非移植对照小鼠（黑色曲线，非移植，n=4）。Plot以线性比例显示累积存活率。Kaplan-Meier生存分析比较了两组的总体生存率。对数秩检验用于比较存活率的差异。*，log-rank=0.02（移植物+与移植物），log-rank=0.007（移植物+与不是透明的）。

然后我们将来自3个独立克隆的类有机物移植到延胡索乙酰乙酸水解酶（FAH）^−/−突变小鼠，一种I型酪氨酸血症肝病模型。FAH缺乏会导致肝衰竭，除非给小鼠服用NTBC（2-（2-硝基-4-三氟-甲基苯甲酰基）-1,3-环己二酮）³⁰.来自单个Lgr5的有机物⁺细胞在EM中扩增，在DM中分化9天，并在小鼠脾内注射细胞悬液(图4a). 移植后2–3个月，我们通过FAH染色对15只受体小鼠的全肝连续切片进行植入分析。我们找到了FAH⁺结节(图4b和补充的。图9a–d)在5只移植了克隆I的小鼠中，有2只和5只移植有克隆III的小鼠中（分别占肝实质的约1%和2/5），对于克隆II，我们仅在所分析的5只小鼠中的1只检测到FAH+肝细胞，其面积占肝总体积的0.1%。

组织学结果通过供体细胞基因的PCR分析得到证实LacZ公司(补充图9e). 组织学上，FAH⁺斑块由肝细胞形态、HNF4α阳性和Krt19负极(图4c–d). 这表明，体内细胞获得了完全成熟的肝细胞表型，同时沉默了任何剩余的导管表达。未观察到器官样细胞与宿主肝细胞融合(补充图9f). 比较而言，卵圆细胞移植（MIC1-C3⁺/133⁺/26⁻/CD45型⁻/11亿⁻/31⁻)仅在20例中的2例中导致微量植入（<总肝脏的0.1%）法赫^−/−老鼠¹⁰我们比较了移植小鼠（移植物+）与非移植小鼠（移植小鼠，FAH染色阴性，移植物-）和非移植对照小鼠的存活率(图4e). 我们观察到，与移植物组（log rank=0.02）和非移植组（logr rank=0.007）相比，移植物+组的存活率显著增加，这表明移植细胞有助于肝功能体内不同于新鲜分离肝细胞移植后获得的典型结果，其中>30%的肝细胞重新增殖，功能恢复接近100%³⁰，我们没有观察到酶缺陷的完全修复，这与移植区域对整个肝脏体积的贡献有限一致。这种抢救将取决于进一步优化分化和移植方案。比较正常肝细胞和Lgr5衍生细胞的竞争性移植试验可能揭示后者的进一步表型特征。重要的是，在任何受体小鼠中均未检测到发育异常或间变性生长。

总之，我们报告了成人肝脏损伤导致Lgr5级胆管附近的小细胞。通过谱系追踪，这些细胞在修复期产生大量肝细胞和胆管细胞。小Lgr5⁺细胞表达多个Wnt靶基因和肠Lgr5的其他标记⁺干细胞。然而，它们具有双功能肝祖细胞的特征。因此，Lgr5级不仅标记了Wnt驱动的干细胞，这些干细胞可以驱动组成（肠、胃）或间歇（毛囊）生理组织自我更新，而且还定义了一类干细胞/祖细胞，在组织损伤时被激活。Wnt驱动的再生反应可以被利用在体外膨胀新隔离的管道碎片，甚至单个Lgr5⁺细胞变成可移植的类器官。Rspo1-Lgr5轴对长期生长和观察到的生成类有机物的遗传和表型稳定性至关重要。因此，Rspo1-Lgr5轴允许成人干细胞像胚胎干细胞一样在培养中广泛扩增。我们的观察结果可能是利用从实体器官获得的成人干细胞/祖细胞制定再生策略的基础。由于这些方法可以基于在体外单个成体Lgr5祖细胞的扩增、特异性和安全的基因修饰可能成为可行的。

方法总结

补充材料

致谢

脚注

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