α转录上调₂δ-1升高动脉平滑肌细胞CA_V（V）1.2遗传性高血压的通道表面表达与脑血管收缩

摘要

介绍

高血压与动脉收缩力升高有关，动脉收缩力会增加全身血压，限制器官血流，导致终末器官损伤。¹高血压也是多种脑疾病的主要预测因素，包括中风、阿尔茨海默病和痴呆。高血压的一个特征性病理改变是血管平滑肌细胞（肌细胞）电压依赖性钙离子的升高²⁺大量涌入。^2,三依赖电压的L型Ca²⁺（钙_V（V）1.2）通道是主要的Ca²⁺动脉肌细胞的进入途径，对多种刺激物（包括血管内压力、膜电位和血管收缩剂）的收缩性调节至关重要。^4–8高血压相关的钙升高_V（V）1.2电流导致细胞内Ca增加²⁺浓度（[Ca²⁺]_我)和血管收缩。^9–11然而，升高动脉肌细胞钙的分子机制_V（V）1.2导致血管收缩的高血压电流尚不清楚。

钙_V（V）1.2通道是包含成孔α₁带辅助α₂δ和β亚基。¹²四个α₂δ（1至4）亚单位亚型已被鉴定，每种亚单位亚单位都由不同的基因编码。^13,14α₂δ亚单位翻译后裂解为高度糖基化的细胞外α₂和较小的δ亚单位，它们随后通过二硫键结合形成单一功能蛋白。^14,15α₂δ亚基是由双层跨膜δ亚基结合的膜。最近，α₂δ-1被确定为对钙的功能性运输至关重要_V（V）1.2α₁动脉肌细胞质膜（表面）的亚单位。¹⁶迄今为止，还没有研究调查Ca的病理或疾病相关分子变化_V（V）1.2辅助亚单位，包括α₂δ亚单位，在阻力大小动脉的肌细胞中。此外，尚不清楚动脉肌细胞表面钙的亚单位组成_V（V）1.2通道在疾病中发生改变。考虑到动脉肌细胞Ca_V（V）1.2高血压期间电流升高，导致血管收缩，我们测定了钙的亚单位组成_V（V）1.2通道并调查α的参与₂这种病理改变中的δ亚单位。^9–11阐明控制α的分子机制₂钙的δ亚基调节_V（V）1.2高血压中的通道可能导致开发治疗心血管疾病的新方法。

在这里，我们使用高血压的遗传模型，即自发性高血压大鼠（SHR），来研究动脉肌细胞α₂高血压的δ亚单位。我们发现，在高血压期间，α₂δ-1表达增加质膜Ca_V（V）1.2导致血管收缩的动脉肌细胞电流。我们还确定了α₂δ-1作为一种新的治疗靶点诱导高血压脑血管扩张。

方法

结果

遗传性高血压的年龄依赖性发展与动脉肌细胞α升高相关₂δ-1和Ca_V（V）1.2α₁亚单位表达

动脉肌细胞Ca的病理改变_V（V）利用大鼠高血压遗传模型研究了1.2个亚基。6周龄时，WKY和SHR大鼠的舒张压、收缩压和平均动脉压相似(图S1). 相反，在12周龄时，SHR大鼠的舒张压、收缩压和平均动脉压分别比WKY大鼠高约63、65和72 mmHg(图S1).

四个不同的α₂δ亚型已被描述，α₂δ-1是血压正常的Sprague-Dawley（SD）大鼠脑动脉心肌细胞中唯一表达的亚型。^14,16我们检验了高血压与α变化相关的假说₂阻力大小动脉肌细胞δ亚型表达。RT-PCR仅检测到α₂12周龄WKY和高血压SHR大鼠纯脑动脉心肌细胞中δ-1的表达(图1A). 相反，相同的引物扩增了所有α₂WKY和SHR全脑δ亚型(图1A).

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图1

α₂δ-1和Ca_V（V）1.2α₁高血压患者亚单位mRNA和蛋白水平升高。A、 说明α转录物RT-PCR扩增的代表性凝胶（共3个实验）₂12周龄WKY和SHR大鼠离体动脉肌细胞和全脑δ-1至-4。B、 α的平均定量PCR数据₂δ-1和Ca_V（V）1.2α₁6周龄SHR大鼠（n=8）和12周龄SHR6大鼠（n=6）动脉中的mRNA分别归一化为Rps5和年龄匹配的WKY对照组。C、 举例说明α的Western blot₂δ-1和Ca_V（V）1.2α₁来自6周龄和12周龄WKY和SHR大鼠全动脉裂解液的蛋白质。以75kDa对印迹进行物理切割，以便探测肌动蛋白和α₂δ-1/Ca_V（V）1.2α₁.D，表明α的平均数据₂δ-1和Ca_V（V）1.2α₁高血压患者的蛋白质水平升高与6周时的mRNA/蛋白质相比，表示P<0.05，#表示与Ca相比，P<0.05_V（V）1.2α₁12周时的信使核糖核酸/蛋白质（每个年龄的每个蛋白质n＝8）。

进行定量PCR以比较α₂δ-1和Ca_V（V）1.2α₁6周龄和12周龄WKY和SHR脑动脉中的信息水平。筛选了8个不同的参考基因，以鉴定WKY和SHR脑动脉中mRNA水平相似的基因(表S1). WKY和SHR动脉中Rps5 mRNA水平相似，因此，Rps5被用作这些实验的参考基因(表S2). 定量PCR显示平均α₂δ-1和Ca_V（V）1.2α₁6周龄WKY和SHR动脉的mRNA水平相似(图1B). 相反，α₂δ-1和Ca_V（V）12周龄SHR的1.2 mRNAs分别是WKY动脉的2.1倍和1.5倍(图1B). 年龄依赖性高血压的发展也与α₂δ-1比Ca_V（V）1.2α₁信使核糖核酸(图1B). 这些数据表明，高血压与α₂δ-1和Ca_V（V）1.2α₁亚单位mRNA，但与其他α的出现无关₂δ亚型，在动脉肌细胞中。

接下来，我们研究了遗传性高血压的年龄依赖性发展是否与α₂δ-1和Ca_V（V）1.2α₁脑动脉中的蛋白质。α₂δ-1和Ca_V（V）1.2α₁6周龄WKY和SHR动脉的蛋白质水平相似(图1C、D). 6至12周的年龄不会改变α₂δ-1和Ca_V（V）1.2α₁WKY大鼠动脉中的蛋白质，但SHR动脉中的这些蛋白质增加了约2.1倍和1.4倍(图S2). 12周龄时，α₂δ-1和Ca_V（V）1.2α₁SHR中的蛋白质比年龄匹配的WKY动脉高约2.5倍和1.7倍(图1C、D). 与信息水平一致，高血压的年龄依赖性发展也增加了α₂δ-1大于Ca_V（V）1.2α₁蛋白质(图1C、D,S2系列).

总之，这些数据表明遗传性高血压与α₂δ-1和Ca_V（V）1.2α₁大脑动脉肌细胞。α₂δ-1和Ca_V（V）1.2α₁蛋白质的含量高于其各自的mRNA(图1B-D,S2系列)表明翻译后事件中高血压相关的变化也有助于钙的增加_V（V）1.2高血压时通道亚单位的表达。此外，在高血压期间，α₂δ-1比Ca_V（V）1.2α₁.

高血压与α表面升高有关₂δ-1和Ca_V（V）1.2α₁动脉中的蛋白质

α₂δ-1诱导钙的膜转运_V（V）1.2α₁SD大鼠动脉肌细胞亚单位。¹⁶因此，我们检验了以下假设：α₂δ-1导致表面Ca升高_V（V）1.2在高血压中的表达。表面（质膜）和细胞内α₂δ-1和Ca_V（V）1.2α₁用生物素化法测定年龄匹配的WKY和高血压SHR脑动脉中的蛋白质。表面放大α₂δ-1和Ca_V（V）1.2α₁SHR中的蛋白质分别比WKY大鼠动脉高约2.6倍和2倍(图2A、B). 总α的较大百分比₂δ-1和Ca_V（V）1.2α₁位于SHR的质膜上，而非WKY动脉(图2A、C). 在WKY动脉中₂δ-1（~85%）比Ca_V（V）1.2α₁（~77%）位于表面。相反，在SHR动脉中，α₂δ-1（~93%）和Ca_V（V）1.2α₁位于表面的（~92%）相似(图2A、C). 这些数据表明，在高血压期间，α₂δ-1和Ca_V（V）1.2α₁总蛋白转化为动脉肌细胞中这些亚单位的表面表达增加。此外，高血压与α分布的改变有关₂δ-1和Ca_V（V）1.2α₁细胞内和表面间的蛋白质。

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图2

动脉表面α₂δ-1和Ca_V（V）1.2α₁高血压患者亚单位升高。A、 典型的Western blot显示两种α的表面表达增加₂δ-1和Ca_V（V）1.2α₁12周龄WKY和SHR动脉中的蛋白质。在75 kDa下物理切割Blot，以便探测α₂δ-1和Ca_V（V）1.2α₁.B，平均值数据表明，α₂δ-1和Ca_V（V）1.2α₁高血压时动脉中的亚单位较高。C、 说明总（表面+细胞内）α百分比的平均数据₂δ-1和Ca_V（V）1.2α₁位于表面的蛋白质*表示与年龄匹配的WKY大鼠动脉中的相同蛋白质相比P<0.05，#表示与WKYα相比P<0.05₂δ-1（WKY和SHR分别为5–9）。

普瑞巴林减少钙的表面运输_V（V）1.2通道亚单位在高血压大鼠动脉中比正常大鼠动脉更有效

普瑞巴林，α₂δ-1/2配体，减少钙的表面转运_V（V）神经元和动脉肌细胞中的1.2、2.1和2.2通道。^{14,16,18–20}接下来，我们研究了普瑞巴林对α₂δ-1和Ca_V（V）1.2α₁WKY和SHR脑动脉亚单位表面表达和亚单位细胞分布。在这些实验中，动脉在加入或不加入普瑞巴林的情况下培养24小时。普瑞巴林（24小时）未改变α的总蛋白₂δ-1（%对照：WKY，115±9；SHR，118±20）或Ca_V（V）1.2α₁（%对照：WKY，116±10；SHR，109±14）(图3AWKY n=4-5，SHR n=5，P>0.05）。相反，普瑞巴林降低了表面α₂δ-1和Ca_V（V）1.2和WKY和SHR动脉中这些蛋白的细胞内水平增加(图3A、B、C,第3章). 普瑞巴林降低的质膜α₂δ-1和Ca_V（V）1.2α₁高血压SHR患者的SHR动脉分别是WKY对照动脉的3.1倍和1.9倍(图3C). 评估普瑞巴林对α的调节₂δ-1和Ca_V（V）1.2计算细胞分布、表面蛋白与细胞内蛋白的比值。与中显示的数据一致图2C，α的比例较大₂δ-1和Ca_V（V）SHR的质膜上存在1.2个亚单位，而WKY动脉中存在1.2个(图3D). 普瑞巴林诱导细胞内α₂δ-1和Ca_V（V）SHR中1.2倍于WKY动脉(图3D).

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图3

普瑞巴林降低α₂δ-1和Ca_V（V）1.2α₁与对照组相比，高血压大鼠动脉中的通道蛋白更有效。A、 代表性蛋白质印迹显示普瑞巴林不会改变总（全动脉）α₂δ-1和Ca_V（V）1.2α₁WKY和SHR动脉中的蛋白质。B、 说明普瑞巴林（24小时）诱导的表面和细胞内α₂δ-1和Ca_V（V）1.2α₁蛋白质。在75 kDa下切割斑点，以便探测α₂δ-1和Ca_V（V）1.2α₁.C，普瑞巴林还原表面α₂δ-1和Ca_V（V）1.2α₁SHR中的蛋白质多于WKY动脉中的蛋白质。D、 说明α的平均数据₂δ-1和Ca_V（V）1.2α₁WKY和SHR动脉中的亚单位分布及普瑞巴林的调节。E、 表面α₂δ-1至Ca_V（V）1.2α₁普瑞巴林的调节作用。所有数据中普瑞巴林浓度为100μmol/L。*表示与未经治疗的WKY相比P<0.05，#表示与未治疗的SHR大鼠动脉相比P<0.05。

高血压与α₂δ-1比Ca_V（V）1.2α₁动脉中的蛋白质(图2A、B). 我们计算了表面α的能带强度比₂δ-1至Ca_V（V）1.2α₁普瑞巴林的调节。虽然该方法无法确定亚单位化学计量比，但每个通道中装载的总蛋白是相同的，可以从相同的印迹比较SHR和WKY动脉中的该比率。平均表面α₂δ-1:Ca_V（V）1.2α₁SHR动脉和WKY动脉的频带强度比分别为~1.38和~1.06，SHR的频带强度比约为1.3倍(图3E). 普瑞巴林降低了表面α₂δ-1至Ca_V（V）1.2α₁SHR大鼠动脉的带强度比为~0.91，但WKY大鼠动脉中的带强度比率没有改变(图3E).

总之，这些数据表明普瑞巴林阻断α₂δ-1和Ca_V（V）1.2α₁亚单位在高血压大鼠动脉中比正常大鼠动脉更有效。高血压期间，表面α₂δ-1蛋白的升高程度高于钙_V（V）1.2α₁蛋白质，导致质膜α比率增加₂δ-1至Ca_V（V）1.2α₁亚单位。普瑞巴林逆转了α表面的高度₂δ-1至Ca_V（V）1.2α₁亚单位。这些数据还表明α₂δ-1对表面钙的上调至关重要_V（V）1.2遗传性高血压时动脉肌细胞的通道。

α₂δ-1靶向逆转钙的高血压相关修饰_V（V）1.2动脉肌细胞的电流密度和失活

研究升高的α对功能的影响₂δ-1的表达及α的影响₂δ-1靶向，Ca_V（V）在年龄匹配的WKY和高血压SHR脑动脉肌细胞中测量1.2电流。平均峰值Ca_V（V）1.2电流密度（Ba²⁺作为电荷载体）在高血压SHR中为约5.3 pA/pF，而在WKY细胞中为约2.4 pA/pF，或约2.2倍(图4A、B和表1). 普瑞巴林（24小时）降低钙峰值_V（V）1.2 SHR细胞中的电流密度为~2.2 pA/pF，或约59%，WKY细胞中为~1.6 pA/pF，或约32%(图4A、B和表1). 普瑞巴林降低峰值钙_V（V）1.2 SHR肌细胞的电流密度与未处理WKY细胞的电流密度之比(图4A、B和表1). 电池电容与峰值钙的关系_V（V）调查了1.2电流(图4C). 当数据与线性函数拟合时，SHR的斜率为−5.41，WKY细胞的斜率为−2.40，或高出2.3倍(图4C). 普瑞巴林使SHR和WKY细胞的斜率分别降低约58%和25%(图4C). 未经处理的WKY和普瑞巴林处理的SHR细胞的斜率相似(图4C，P>0.05）。WKY细胞（16.3±0.8 pF）和SHR细胞（SHR 17.1±1.3 pF）的平均细胞电容相似，普瑞巴林未改变（WKY，18.8±1 pF；SHR 15.8±0.8 P F；比较时P>0.05），表明电流密度和斜率因Ca的变化而增加_V（V）1.2通道(图4B、C).

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图4

普瑞巴林逆转钙升高_V（V）1.2高血压大鼠动脉平滑肌细胞电流。A、 代表性Ca_V（V）1.2对照组和普瑞巴林处理的WKY和SHR动脉平滑肌细胞（10 mmol/L Ba）的电流密度记录²⁺作为电荷载体）。B、 WKY细胞（n=17）、普瑞巴林处理的WKY（n=13）、SHR（n=16）和普瑞巴林处理的SHR（n=18）细胞的平均电流密度-电压关系。C、 Ca峰值线性拟合散点图_V（V）1.2 WKY（n=17）、预加巴林处理的WKY细胞（n=13）、SHR（n=16）和预加巴林处理的SHR细胞（n=18）中的电流与细胞电容的关系。WKY：斜率=−2.40，r=−0.76，p=3.3×10-4。WKY+普瑞巴林：斜率=−1.79，r=−0.90，p=7.5×10-4。SHR：斜率=−5.41，r=−0.77，p=3.5×10-4。SHR+普瑞巴林：斜率=−2.25，r=−0.72，p=1.1×10-4。D、 电压依赖性钙_V（V）1.2在WKY（n=13）、普瑞巴林处理的WKY细胞（n=9）、SHR细胞（n=12）和普瑞巴林处理的SHR细胞中的电流激活。E、 WKY细胞（n=17）、普瑞巴林处理的WKY（n=13）、SHR（n=16）和普瑞巴林处理的SHR（n=18）细胞的电压依赖性电流失活*表示WKY在指示电位下的显著性（P<0.05）。F、 钙的时间进程图解_V（V）1.2电流（+20 mV）和急性普瑞巴林（100μmol/L）的抑制作用。WKY（对照n=8，普瑞巴林n=9），SHR（对照n=14，普瑞巴林n=6）细胞。箭头（不适用于对照）指示添加普瑞巴林的位置。所有数据中普瑞巴林浓度均为100μmol/L。*表示与未治疗的WKY相比P<0.05，#表示与普瑞巴灵治疗的WK相比P<0.05；§表示与未处理的SHR相比P<0.05。

表1

动脉肌细胞钙的特性_V（V）1.2电流。括号中的数字表示实验数字。

	WKY公司	WKY+普瑞巴林	SHR公司	SHR+普瑞巴林
四、关系
峰值电流密度（pA/pF）	2.40±0.15 (17)	1.65±0.13 (13)*	5.33±0.38 (16)*,#	2.23±0.14 (16)
峰值电压（mV）	10.25±0.74 (17)	12.31±1.45 (13)	11.09±1.03 (16)	11.26±0.89 (18)
电压相关激活
V（V）1/2实际（毫伏）	9.24±1.88 (12)	10.70±3.72 (9)	11.62±1.80 (12)	11.18±3.29 (5)
坡度	13.09±1.55 (12)	14.56±1.66 (9)	12.74±2.84 (12)	10.51±1.09 (5)
电压依赖性失活
V（V）1/2不正确（毫伏）	−14.23±1.57 (8)	−17.20±1.28 (13)	−11.33±1.90 (16)	−14.71±1.15 (11)
坡度	6.44±0.76 (8)	8.58±1.16 (13)	7.86±0.70 (16)	8.09±0.69 (11)

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^*与WKY和

^#与SHR+普瑞巴林相比，P<0.05。

半最大Ca的电压依赖性_V（V）1.2电流激活（V_1/2实际)未经治疗的对照组和普瑞巴林处理的WKY和SHR动脉肌细胞的斜率（k）相似(图4D和表1). 半最大失活的电压依赖性（V_1/2不正确)未经处理的对照组和普瑞巴林处理的WKY和SHR细胞中的k也相似(图4E和表1). 相反，未经处理的SHR细胞显示出非激活性钙_V（V）1.2电流，比WKY细胞大约2倍(图4A、E). 普瑞巴林（24小时）降低SHR细胞中的非激活电流，使其与WKY细胞相似(图4A、E). 钙_V（V）1.2对照组和普瑞巴林处理的WKY和SHR细胞的电流失活率（τ）相似(图S4).

除了作为α的抑制剂₂δ-1诱导钙_V（V）1.2通道贩运，普瑞巴林是一种弱钙_V（V）1.2不会直接改变Ca的通道孔阻滞剂_V（V）1.2正常血压SD大鼠动脉肌细胞的电流电压依赖性。¹⁶确定钙的减少_V（V）1.2普瑞巴林处理的WKY和SHR大鼠心肌细胞的电流振幅是由钙引起的_V（V）1.2孔块，我们测量了Ca_V（V）1.2急性浴敷普瑞巴林对未处理细胞的电流调节。急性普瑞巴林降低钙_V（V）1.2 WKY电池电流增加约12%(图4F). 相反，普瑞巴林降低钙_V（V）SHR心肌细胞的1.2电流约为WKY细胞的23%或1.9倍(图4F). 急性普瑞巴林诱导钙_V（V）1.2在WKY（约32%抑制）和SHR（约59%抑制）细胞中，电流抑制均显著小于普瑞巴林处理24小时后所诱导的电流抑制(图4B、C、F). 结合中所示的生化数据图3这些数据表明，急性和慢性普瑞巴林抑制钙_V（V）1.2通过动脉肌细胞不同机制的电流。

总的来说，数据表明遗传性高血压与α₂δ-1的表达刺激Ca的表面表达_V（V）1.2α₁亚单位，导致钙_V（V）1.2电流升高和非激活电流增加。α₂δ-1靶向降低高血压相关α₂δ-1诱导Ca升高_V（V）1.2α₁表面表达，导致钙减少_V（V）1.2电流密度。α₂δ-1靶向还可恢复Ca_V（V）1.2电流失活。

α₂δ-1靶向逆转高血压患者血压升高和去极化诱导的血管收缩

α高血压相关改变的功能意义₂通过测量动脉收缩力来研究δ-1信号传导。在含或不含普瑞巴林孵育24小时的WKY和SHR脑动脉中测量血管内压力（20–100 mmHg）的直径调节。在整个压力范围内，SHR动脉比WKY动脉产生更多肌源性张力(图5A、B). 普瑞巴林降低WKY和SHR动脉的肌张力，SHR比WKY动脉的肌紧张度降低更多（例如，60 mmHg时肌紧张度减少%：SHR，约41%；WKY，约28%），SHR动脉张力降低到未经治疗的WKY血管的水平(图5A、B). 尼莫地平（1μmol/L），一种电压依赖性钙²⁺研究了通道阻滞剂、完全扩张对照和普瑞巴林处理的WKY和SHR动脉在所有压力下（20–100 mmHg），表明肌源性张力是由钙引起的_V（V）1.2通道激活(图5B). WKY（249±11μm）和高血压SHR（242±9μm）脑动脉的被动动脉直径相似（在60 mmHg下给出的值，n=10，每个，P>0.05）。

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图5

普瑞巴林逆转高血压患者升高的压力诱导的血管收缩。A、 说明WKY（黑色）和SHR（红色）动脉血管内压力增加时稳态肌源性张力的典型轨迹。水平黑色条表示镀液K增加⁺从6到60 mmol/L.B普瑞巴林（24小时，100μmol/L）降低高血压大鼠动脉中由压力（20–100 mmHg）诱导的肌源性张力（填充符号）比对照组更明显。尼莫地平（1μmol/L，空符号）可消除肌源性色调。平均数据（n:WKY，6-10；WKY+普瑞巴林，6-9；SHR，6-10，SHR+普瑞巴林，6-7）。*与未治疗的WKY相比，表示P<0.05，#表示SHR+普瑞巴林与未治疗SHR相比，P<0.05。

提高细胞外钾⁺诱导去极化，激活电压门控钙²⁺通道，Ca²⁺内流和血管收缩。⁴作为研究α的功能影响的替代方法₂δ-1靶向，我们研究了K⁺-WKY和SHR动脉中诱导的血管收缩。增加细胞外钾⁺从6到20、40或60 mmol/L诱导的分级血管收缩在SHR中大于WKY脑动脉(图6A、B). 普瑞巴林降低K⁺-SHR引起的血管收缩多于WKY动脉(图6A、B). 例如，普瑞巴林降低了平均60 mmol/L K⁺-SHR和WKY的收缩率分别为54%和37%(图6B). 这些数据表明α₂δ-1靶向降低高血压SHR中压力和去极化诱导的血管收缩比对照WKY大鼠动脉更有效。

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图6

普瑞巴林逆转高血压患者升高的去极化诱导的血管收缩。A、 说明直径对细胞外钾增加反应的代表性痕迹⁺.B，普瑞巴林（24小时，100μmol/L）降低去极化（20、40和60 mmol/L K⁺)-与对照组相比，高血压大鼠的动脉收缩更明显。平均数据（n:WKY，6；WKY+普瑞巴林，6；SHR，6；SHR+普瑞巴林，6）。*与未治疗的WKY相比，表示P<0.05，#表示SHR+普瑞巴林与未治疗SHR相比，P<0.05。

讨论

迄今为止，没有研究调查钙的参与_V（V）1.2动脉肌细胞Ca病理升高中的通道辅助亚单位_V（V）1.2高血压的电流和血管收缩。在这里，我们首次证明遗传性高血压与α转录和翻译后上调相关₂阻力大小动脉肌细胞δ-1亚单位。附加α₂δ-1亚基增加钙的表面转运_V（V）1.2α₁亚单位，在高血压中也升高。表面α随之增加₂δ-1和Ca_V（V）1.2α₁蛋白质升高钙_V（V）1.2电流密度，产生非激活电流，导致血管收缩。我们还证明了α₂δ-1靶向使心肌细胞α正常化₂δ-1和Ca_V（V）1.2α₁表面表达，重建Ca_V（V）1.2电流密度和失活，并将高血压大鼠动脉收缩力降低至对照组水平。这些数据表明α₂δ-1升高Ca_V（V）1.2电流和Ca_V（V）高血压期间1.2依赖性血管收缩，并证明α₂δ-1靶向治疗是逆转这些病理改变并诱导脑血管扩张的可行治疗策略。

我们的数据表明，遗传性高血压的发展与α₂δ-1和Ca_V（V）1.2α₁在动脉肌细胞中。相反，其他α₂δ亚型在高血压期间没有出现，这种改变可能导致病理性Ca_V（V）1.2当前修改。以前的研究已经描述了钙_V（V）1.2α₁高血压SHR的肠系膜动脉和主动脉中的mRNA和蛋白质含量高于WKY对照组。^21,22相反，血管紧张素II和低氧诱导的高血压并不改变钙_V（V）1.2α₁mRNA，但Ca升高_V（V）1.2α₁培养肠系膜动脉和新生仔猪肺动脉中的蛋白质。^23,24这些发现表明高血压可能与钙的增加无关_V（V）1.2α₁信息，但钙的翻译后上调_V（V）1.2α₁蛋白质。^21–24在这里，我们使用SHR中高血压的年龄依赖性发展以及与WKY大鼠对照组的比较来研究α₂δ-1和Ca_V（V）1.2α₁mRNA和蛋白质。我们的数据表明，α₂δ-1（~2.1倍）和Ca_V（V）1.2α₁（~1.5倍）mRNA不能完全解释α₂δ-1（~2.5倍）和Ca_V（V）1.2α₁（约1.7倍）的蛋白质。这些数据表明转录和翻译后机制都会升高α₂δ-1和Ca_V（V）1.2α₁高血压时大脑动脉肌细胞中的蛋白质。

利用生物素化的一种新应用，我们最近确定了动脉α的表面到细胞内分布₂δ-1和Ca_V（V）1.2α₁正常血压大鼠的蛋白质。¹⁶基本上所有（>95%）α₂δ-1和Ca_V（V）1.2α₁正常血压SD大鼠脑动脉肌细胞表面存在蛋白质。¹⁶这里，总α的较小百分比₂δ-1（~85%）和Ca_V（V）1.2α₁（~77%）位于WKY大鼠动脉的质膜上。α略有差异的解释₂δ-1和Ca_V（V）1.2α₁SD和WKY大鼠之间的分布包括不同的大鼠品系和动物年龄（参考文献7周）。¹⁶与这里的12周相比）。确定α的细胞分布₂δ-1和Ca_V（V）1.2α₁我们比较了SHR和WKY脑动脉表面和表面表达的总蛋白百分比：细胞内蛋白比率。这两种分析方法都表明α₂δ-1和Ca_V（V）1.2α₁位于高血压大鼠动脉的质膜上，而非对照组。α转录和翻译增加的净结果₂δ-1和Ca_V（V）1.2α₁蛋白质和较高的相对表面表达提高了这些蛋白质的质膜水平。我们的数据还表明，表面α有分数偏移₂δ-1:Ca_V（V）1.2α₁在高血压期间，由于表面α升高而发生的变化₂δ-1比Ca_V（V）1.2α₁这些结果证明α₂δ-1至Ca_V（V）1.2α₁亚单位比率可以改变天然Ca_V（V）1.2电流特性和可能不存在刚性α₂δ-1:Ca_V（V）1.2α₁动脉肌细胞亚单位化学计量。同样可能的是，在血压正常的情况下，动脉肌细胞钙的比例_V（V）1.2通道复合体可能不含α₂δ-1亚单位。高血压期间，α表面升高₂δ-1比Ca高_V（V）1.2α₁可能会增加含有α的通道的比例₂δ-1. 未来的研究应旨在进一步研究天然Ca_V（V）1.2动脉肌细胞的通道化学计量和心血管疾病中发生的变化。总的来说，这些结果表明α₂δ-1增加Ca的表面表达和功能_V（V）1.2α₁高血压时动脉肌细胞中的亚单位。

普瑞巴林是一种加巴喷丁类药物，用于治疗神经性疼痛、纤维肌痛和癫痫发作。^25,26所有四个α₂δ亚型，仅α₂δ-1和-2包含完整的金属离子粘附位点和RRR基序，这些基序是加巴坦药物结合所必需的。^14,20Gabapanetin还原α₂从Rab-11阳性再循环内体中的δ亚单位再循环。²⁷普瑞巴林还降低了α₂δ-1和Ca_V（V）1.2α₁正常血压SD大鼠脑动脉肌细胞中的蛋白质。¹⁶普瑞巴林没有改变总α₂δ-1或Ca_V（V）1.2α₁蛋白质。相反，普瑞巴林降低了表面α₂δ-1和Ca_V（V）1.2α₁高血压大鼠动脉中的蛋白质含量高于对照大鼠动脉，基本上使这些蛋白质的表面水平恢复到WKY的水平。普瑞巴林还降低了α₂δ-1至Ca_V（V）1.2α₁高血压大鼠动脉与WKY对照组的亚单位比率。鉴于普瑞巴林使Ca升高正常化_V（V）1.2电流密度和非激活电流占WKY细胞的比例，我们的数据表明α₂δ-1功能性有助于钙的增加_V（V）1.2高血压患者动脉肌细胞电流。

电压依赖性钙²⁺当研究各种不同的高血压模型，如SHR、血管紧张素Ⅱ诱导的高血压、主动脉束带、中风型SHR、低氧诱导的肺动脉高压和高脂饮食的Osborne-Mendel大鼠时，包括肾动脉、脑动脉和肠系膜动脉在内的血管系统的心肌细胞中的电流升高。^{2,三,7,9,21,23,24,28–30}钙_V（V）1.2当使用WKY和SHR大鼠模型时，此处测量的电流密度与之前报道的大脑动脉肌细胞的电流密度一致。^2,30我们的数据表明_V（V）高血压大鼠动脉肌细胞的电流密度约为对照大鼠的2.2倍。相反，Ca_V（V）1.2电流V_1/2个和V_1/2不正确WKY和SHR细胞中的情况相似，与以前的报告一致。^2,9,28,30一种非活性钙_V（V）1.2高血压大鼠心肌细胞的电流是对照组的两倍，这种改变会显著增加钙²⁺稳态膜电位下的内流，从而刺激血管收缩。普瑞巴林（24小时）降低钙升高_V（V）1.2电流密度和非激活电流达到对照组水平，表明这些病理改变是由于α₂δ-1表面表达。我们的数据与普瑞巴林作为弱钙的作用一致_V（V）1.2通道阻滞剂和α的有效慢性抑制剂₂高血压大鼠动脉肌细胞δ-1表面表达。在我们之前的研究中，急性普瑞巴林降低钙_V（V）SD大鼠大脑动脉肌细胞中约33%的1.2电流。¹⁶在这里，相同的急性普瑞巴林浓度降低了钙_V（V）1.2 WKY大鼠心肌细胞电流约12%。我们之前的研究使用了7周龄SD大鼠，而这里在12周龄WKY大鼠心肌细胞中测量了急性普瑞巴林效应。我们的数据表明Ca_V（V）1.2 12周龄WKY心肌细胞的通道特性与7周龄SD大鼠心肌细胞的不同，包括钙的百分比_V（V）1.2α₁位于表面的蛋白质。这里的数据表明，急性普瑞巴林是一种更有效的钙抑制剂_V（V）SHR中的电流比WKY心肌细胞中的电流大1.2倍。这可能是由于表面α的数量较高₂δ-1亚基与高α₂δ-1:Ca_V（V）SHR心肌细胞的比率为1.2。急性加巴喷丁也抑制电压依赖性钙²⁺锥体新皮质细胞中的电流，但不改变重组钙产生的电流_V（V）2.1通道或内源性钙²⁺背根神经节神经元的通道。^31,32在神经病理性疼痛模型中，α₂δ-1上调，普瑞巴林慢性抑制α₂δ-1转运到突触前终端，从而抑制Ca²⁺通道功能。¹⁹我们的数据表明，慢性普瑞巴林抑制α₂δ-1诱导的钙迁移_V（V）1.2α₁通道亚基，从而减少Ca_V（V）1.2高血压时动脉肌细胞电流。

与对照组相比，血管内压力和去极化均刺激高血压大鼠动脉中更大的血管收缩。与我们的研究结果一致，压力诱导Ca²⁺遗传性和诱导性高血压动物模型的动脉内流和相关血管收缩更大。^7,21,23,24我们发现尼莫地平在所有压力下都能消除肌张力，表明钙_V（V）1.2通道活性对高血压和控制大鼠动脉张力至关重要。慢性普瑞巴林（24小时）是一种比对照大鼠动脉更有效的高血压血管扩张剂，能有效逆转病理性血管收缩。普瑞巴林也是一种弱钙_V（V）1.2通道孔隙阻滞剂，可诱导轻微的血管舒张。¹⁶因此，普瑞巴林诱导的钙_V（V）1.2孔堵塞也可能导致WKY和SHR动脉的血管舒张。尽管不太可能，普瑞巴林可能通过其他机制引起血管舒张，包括通过诱导膜超极化。我们的数据与这种可能性不一致，因为普瑞巴林同样降低了表面钙_V（V）1.2亚基，Ca_V（V）1.2电流、肌原性张力和K⁺-诱导收缩和抑制压力-和去极化诱导的血管收缩是等效的。因此，数据表明普瑞巴林主要通过减少钙的表面表达来扩张高血压大鼠的动脉_V（V）1.2肌细胞亚单位。

高血压与脑疾病风险增加有关，包括中风、阿尔茨海默病和痴呆。与血压正常的对照组相比，高血压患者和12周龄SHR大鼠的脑血流量减少。^33,34电压依赖性钙²⁺通道阻滞剂用于治疗高血压已有二十多年的历史。³⁵然而，Ca²⁺通道阻滞剂抑制钙_V（V）1.2多个单元类型中的通道体内并诱发多种副作用，包括出汗、水肿和恶心。^35,36因此，针对钙的替代方法的发展_V（V）与电流抑制剂相比，动脉肌细胞中的1.2通道可提供显著益处。在这里，我们使用普瑞巴林作为在体外测试α概念的工具₂δ-1靶向诱导高血压动物脑动脉血管舒张。这里的数据为未来旨在开发靶向α的新方法的研究奠定了基础₂δ-1在动脉肌细胞中表达。我们研究中的所有数据都是通过研究调节大脑区域血流但不控制全身血压的脑动脉获得的。在用于治疗神经性疼痛、纤维肌痛和癫痫发作的剂量下，临床普瑞巴林似乎不会改变血压正常的人的全身血压。²⁶对这一观察有几种解释。首先，有许多不同的机制控制大脑和系统动脉收缩。迄今为止，还没有研究检测α的分子特性或生理功能₂系统动脉肌细胞中调节舒张压和收缩压的δ亚基。α₂δ-1可能不是主α₂δ亚型或α₂δ亚基可能不调节钙_V（V）1.2体动脉肌细胞的通道活性。普瑞巴林是α₂δ-1/2配体。如果α₂δ-1或α₂δ-2不表达或不调节Ca_V（V）1.2在体动脉肌细胞的通道中，普瑞巴林不应诱导全身血管舒张或改变血压。其次，用于治疗神经病理性疼痛、纤维肌痛和癫痫发作的普瑞巴林的临床剂量可能不足以诱导血管舒张体内加巴喷丁是一种低亲和力的普瑞巴林类似物，通过系统L中性氨基酸转运体进入细胞。³²动脉肌细胞摄取普瑞巴林的效率可能不如神经元。体内，细胞内心肌细胞普瑞巴林浓度可能低于获得的浓度在体外改变Ca的_V（V）1.2功能。第三，很多体内机制，包括压力感受器或肾素-血管紧张素系统介导的机制，可以补偿普瑞巴林诱导的全身血管舒张，导致血压无净变化。第四，我们的数据表明普瑞巴林更有效地抑制钙_V（V）1.2α₁高血压大鼠脑动脉肌细胞亚单位运输量高于正常血压大鼠。体内普瑞巴林对高血压患者可能是一种更有效的血管扩张剂，而对已获得临床全身血压测量值的血压正常者则影响较小。我们的研究首次证明动脉肌细胞α₂高血压患者δ-1功能上调，α₂δ-1靶向治疗是一种减少高血压病理性血管收缩的新方法。数据还表明α₂δ-1靶向可以改变脑动脉收缩性，为将来研究使用多种其他α₂δ-1靶向策略，包括RNA干扰和遗传模型，以研究α₂其他血管床动脉中的δ亚单位体内.

总之，我们首次发现α₂δ-1升高Ca_V（V）1.2α₁动脉肌细胞表面表达导致压力和去极化诱导的血管收缩。我们的数据还表明₂δ-1靶向是逆转钙升高的新方法_V（V）1.2高血压患者动脉肌细胞通道表面表达与血管收缩。

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致谢

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脚注

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