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英国药理学杂志。2013年5月；169(1): 197–212.
2013年4月12日在线发布。 数字对象标识：2011年10月11日/桶12114
预防性维修识别码：项目经理3632249
PMID：23347184

β-catenin途径参与瘦素对大鼠肝星状细胞SREBP-1c表达和肝纤维化的影响

徐光斋,1 严坤峰,1 纪业范,2 牛明慧,1 钱周,1 兖州,1 陈洪山,1和周亚军1
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摘要

背景和目的

肝纤维化通常与肥胖有关，大多数肥胖患者会出现高瘦素血症。脂肪细胞因子瘦素在肝纤维化的发展中具有独特的作用。肝星状细胞（HSC）的激活是肝纤维化发生的关键步骤，甾醇调节元件结合蛋白-1c（SREBP-1c）可以抑制HSC的激活。我们已经证明，瘦素强烈抑制大鼠HSC中SREBP-1c的表达。因此，我们旨在阐明脂肪细胞分化的关键负调控因子β-catenin途径是否介导瘦素对HSC和小鼠肝纤维化中SREBP-1c表达的影响。

实验方法

HSC由大鼠和小鼠制备。通过实时PCR、Western blot分析、免疫染色和瞬时转染分析分析基因表达。

主要成果

瘦素增加了培养HSC中的β-catenin蛋白，但不增加mRNA水平。瘦素诱导血清糖原合成酶激酶-3β磷酸化9随后β-catenin蛋白的稳定至少部分由ERK和p38 MAPK途径介导。瘦素诱导的β-catenin途径降低了SREBP-1c的表达和活性，但不影响控制SREBP-1活性的关键调控因子的蛋白水平，也不参与瘦素对肝脏X受体α的抑制。在小鼠肝损伤模型中，β-catenin通路被证明参与了瘦素诱导的肝纤维化。

结论和启示

β-catenin途径有助于瘦素调节HSC中SREBP-1c的表达和小鼠瘦素诱导的肝纤维化。这些结果对阐明与瘦素水平升高相关的肝纤维化发生机制具有潜在意义。

关键词：β-catenin、固醇调节元件结合蛋白-1c、糖原合成酶激酶-3β、肝星状细胞、瘦素、肝纤维化

介绍

高瘦素血症和胰岛素抵抗在肥胖患者中很常见，反过来又与2型糖尿病（Stefanovic等.,2008; 横滨市等.,2008). 肥胖和2型糖尿病是非酒精性脂肪肝的重要病因（渡边捷昭等.,2008). 此外，肥胖者的肝纤维化发病率是普通人群的六倍（McCullough和Falck-Ytter，1999; 拉特齐乌等.,2000).

脂肪细胞因子瘦素主要由脂肪细胞产生，是负反馈回路调节能量稳态的重要介质。它抑制游离脂肪酸（FFA）的摄取从头开始脂肪酸合成，刺激FFA的动员和氧化，逆转脂肪细胞的分化（周等.,1999). 此外，近年来，在体外和体内研究提供了令人信服的证据，证明瘦素在肝纤维化的发展中起着独特的作用（阿勒菲等.,2005; 曹等.,2006; 埃利纳夫等.,2009). 肝纤维化是由多种原因引起的慢性肝损伤的结果，与过量、异常的细胞外基质（ECM）的积累有关。肝星状细胞（HSC）是肝脏中主要的间充质细胞类型。在正常肝脏中，HSC处于静止状态，位于Diss的窦周间隙，其中含有丰富的中性脂质（Tsukamoto，2005). 慢性损伤后，静止的HSC转分化为活化的肌纤维母细胞样细胞（活化的HSC），并分泌大量ECM。HSC活化过程被认为是肝纤维化发展的关键事件，因为肝损伤后，HSC成为ECM的主要来源，如胶原蛋白（Hernandez-Gea和Friedman，2011).

HSC的激活需要HSC基因表达的全局重新编程，这必须通过关键转录调节器的表达和/或活性的变化来协调。静止的HSC，曾被称为脂肪储存细胞，很像脂肪细胞，HSC从静止细胞向肌纤维母细胞的转分化似乎类似于脂肪细胞对前脂肪细胞（成纤维细胞）的转分化（Tsukamoto，2005). 脂肪细胞分化的关键转录因子包括固醇调节元件结合蛋白（SREBP）-1、PPAR-γ和CCAAT/增强结合蛋白家族（C/EBP；Rangwala和Lazar，2000). SREBP-1以两种亚型形式存在，即SREBP-1a和SREBP-2c。肝脏中SREBP-1a和SREBP-1的mRNA比值为1:9（Shimomura等.,1997)HSC中为1:4（支持信息图S1)表明SREBP-1c是肝脏和HSC中SREBP-1的主要亚型。有趣的是，已经证明SREBP-1c在抑制HSC激活中起着关键作用（Tsukamoto，2005). SREBP-1c的异位转导导致活化HSC向静止细胞的形态和生化逆转（She等.,2005). 瘦素似乎可以通过激活其受体直接靶向HSC，并刺激HSC激活和纤维化（Saxena等.,2002; 贝托拉尼和马拉，2010). HSC的激活与瘦素的顺序上调和SREBP-1c（Potter等.,1998; 她等.,2005). 基于这些观察结果，研究瘦素对HSC中SREBP-1c表达和活性的影响似乎很有意义，因为这可能有助于阐明瘦素在HSC激活和肝纤维化中的作用机制。在之前的研究中，我们证明瘦素强烈抑制HSC中SREBP-1c的表达体内和在体外通过p38 MAPK下调肝脏X受体α（LXRα），导致HSC胶原表达减少（Yan等.,2012). 然而，这种瘦素诱导HSC中SREBP-1c表达抑制的分子机制尚不完全清楚。

典型的Wnt/β-catenin信号通路控制许多细胞过程，包括增殖和分化（麦克唐纳等.,2009). 研究表明，Wnt/β-catenin途径是脂肪生成和脂肪细胞分化的关键负调控因子（Arango等.,2005; 基督齿类等.,2009). β-连环蛋白是Wnt信号通路的关键效应器（Valenta等.,2012). 在缺乏Wnt的情况下，糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）促进β-catenin蛋白的磷酸化，从而导致β-catentin（谷胱甘肽激酶-3β的主要底物）（Christodoulides）的泛素化和降解等.,2009). 在Wnt存在的情况下，由于Wnt参与诱导GSK-3β磷酸化和失活的复合物的形成，β-连环蛋白得以稳定（MacDonald等.,2009). 因此，β-连环蛋白被转运到细胞核，在那里它与T细胞因子（Tcf）结合位点结合，以调节特定靶基因的表达（麦克唐纳等.,2009). 特别令人感兴趣的是，在HSC中已证明存在功能性β-连环蛋白依赖的Wnt信号，更重要的是，Wnt/β-连环素途径已被证明可介导胆管结扎（BDL）诱导的肝纤维化（Cheng等.,2008). 因此，鉴于瘦素和SREBP-1c在脂肪细胞分化和肝纤维化中的作用，瘦素可能与HSC中的β-catenin信号通路相关，从而影响HSC中SREBP-1的表达。因此，本研究的目的是调查这种可能性在体外和体内通过使用HSC培养物和瘦素缺乏小鼠（ob/ob小鼠）。

SREBP-1c的激活涉及内质网（ER）中嵌入的SREBP-1前体（125 kDa）的蛋白水解裂解。在内质网中，无活性的SREBP-1c蛋白与两个完整的蛋白相关，即SREBP裂解激活蛋白（SCAP）和胰岛素诱导基因（insig-1和insig-2），它们在控制SREBP-1 c裂解过程中起着关键作用（Goldstein等.,2006; 佐藤，2010). Insis作为内质网中SCAP/SREBP复合物的保留蛋白发挥作用（Goldstein等.,2006). 在存在特定信号的情况下，SCAP从标记中分离出来，并将SREBP从内质网带到高尔基体，在高尔基体中，SREBP进行蛋白水解处理，产生转录活性形式（核SREBP-1c，68kDa），导致SREBP-1 c移位到细胞核以激活转录。因此，由于发现瘦素影响β-catenin信号传导，从而影响SREBP-1c活性，我们进一步研究了瘦素诱导的β-catentin信号传导途径是否与SCAP水平以及HSC内insig的变化有关。

方法

材料

Leptin购自ProSpec Tany TechnoGene（Rehovot，Israel），用于治疗100 ng·mL的HSC−1（严等.,2012). XAV939（β-catenin途径的有效抑制剂）和环己酰亚胺（蛋白质生物合成抑制剂）购自Santa Cruz（加利福尼亚州圣克鲁斯）。硫代乙酰胺（TAA）、氯化锂、IBMX、地塞米松和胰岛素购自西格玛（美国密苏里州圣路易斯）。PD98059（一种MEK抑制剂）和SB203580（一种p38 MAPK抑制剂）购自CalBiochem（美国加利福尼亚州拉霍亚）。

动物的治疗

雄性C57BL/6J ob/ob小鼠（肥胖小鼠，瘦素缺乏），5周龄，购自南京大学模型动物研究中心（中国南京）。在再被关一周后，这些老鼠被用于实验。所有的老鼠都可以免费获得水和标准的食物，并得到人道的照顾。实验方案按照江苏和南通大学的指导方针进行。所有涉及动物的研究均按照ARRIVE动物实验报告指南进行报告（基尔肯尼等.,2010; 麦格拉思等.,2010). 小鼠被随机分为四组（每组六只）。各组小鼠腹腔注射TAA（200μg·g−1体重，每周两次）4周（燕等.,2012). 在TAA治疗的4周期间，第1-4组分别给予Ad.Fc（编码IgG2αFc片段的腺病毒）、leptin加Ad.Fc、Leption加Ad.Dkk-1[编码小鼠Dickkopf-1（Brugmann）的腺病毒等.,2007)]或Ad.Dkk-1。Ad.Dkk-1（2×107pfu·g−1体重，每两周一次）或Ad.Fc注射到小鼠尾静脉。Ad.Fc被用作对照病毒。小鼠接受瘦素（1μg·g−1体重，i.p.，每天一次）（严等.,2012). 腺病毒在HEK293细胞中扩增并在氯化铯梯度上纯化。

造血干细胞的分离和培养

如前所述，从Sprague-Dawley大鼠或ob/ob小鼠中分离出HSC（周等.,2010). 通过相差显微镜和紫外线激发荧光显微镜评估HSC的纯度，发现其纯度超过95%。半融合大鼠HSC在4-8代后用于实验。在含有0.4%FBS的DMEM中去除血清24 h后，用含有0.4%的FBS的DMAM中的瘦素处理细胞。从ob/ob小鼠分离的HSC直接用于Western blot分析。

蛋白质印迹分析

Western blot分析如前所述（周等.,2010). 通过抗β-连环蛋白（稀释1:400）、SREBP1（稀释1:500）、GSK-3β（稀释1:1000）、丝氨酸9磷酸化GSK-3α（稀释1:5000）、SCAP（稀释1:11000）、insig-1（稀释1:100）、insig 2（稀释1:12000）、LXRα（稀释1:1500）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）（1:2000）、α1（I）的一级抗体检测靶蛋白胶原蛋白（1:1000）、细胞周期蛋白D1（1:1000）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH，稀释1:2000）或β-肌动蛋白（稀释1:2000），随后通过辣根过氧化物酶偶联的第二抗体（稀释1:4000）。β-actin或GAPDH用作内部对照。LXRα、SREBP1和α-SMA购自Abcam（马萨诸塞州坎布里奇，美国），其他抗体购自Santa Cruz（加利福尼亚州圣克鲁斯）。

mRNA分离和实时PCR

按照制造商的说明，使用TRI-试剂（Sigma）提取总mRNA。如前所述进行实时PCR（周等.,2009). 靶基因的mRNA水平相对于内源性亲环素对照的倍数变化如Schmittgen所述进行计算等. (2000). 实时PCR中使用的引物如下：

大鼠β-catenin：

（正向）5′-CACGACTAGTTCAGCTGTTGTAC-3′；

（反面）5′-ACTGCACAAAACAGTGAATGGT-3′。

大鼠SREBP-1c：

（向前）5′-AGCACAGCAAACCAGAACTCAA-3′；

（反面）5′-AGGTCTTTCAGTGATTTGCTTTTGT-3′。

大鼠α-SMA：

（向前）5′-ACACGTGGCCTATCTATGAGGGCT-3′；

（反面）5′-AGCGACATAGCAGCTTCTCCTT-3′。

大鼠α1（I）胶原蛋白：

（正向）5′-TGGTCCCAAAGGTTCCTGGT-3′；

（反面）5′-TTAGGTCCAGGAATCCCATCACA-3′。

大鼠亲环素：

（正向）5′-TGGATGGCAAGCATGTGGTCTTTTG-3′；

（反面）5′-CTTCTGCTGGTCTTGCCATTCT-3′。

质粒和瞬时转染分析

Photinus荧光素酶报告质粒pSREBP1c-Luc包含大鼠SREBP-1c基因启动子（Deng等.,2002). 质粒pdncatenin和质粒pwtcatenin分别编码显性负性β-连环蛋白和野生型β-连环素。质粒pMKK6E编码p38 MAPK上游激活物（MAPK激酶-6）的活性突变体MKK6 E。质粒pcaMEK-1编码MEK-1的组成活性形式，刺激ERK激活。Photinus荧光素酶报告质粒pLXRE-Luc包含三个串联LXR结合位点。Photinus荧光素酶报告质粒pSRE-Luc包含三个常见的SREBP-1c结合位点。质粒ptwist2编码twist2，即SREBP-1c活性的阻遏物（Lee等.,2003). Photinus luciferase报告质粒pGL3-OT（Addgene，Cambrige，MA，USA）包含三个串联野生型Tcf-4结合位点，用于评估β-catenin活性，pGL3-OF包含三个级联突变型Tcf-4-结合位点（Addgene）。

将HSC培养在12孔塑料板中，并使用LipofectAMINE试剂（美国纽约州纽约市生命科技公司）瞬时转染表达磷脂酶的报告质粒（0.8μg DNA/孔）和表达肾素荧光素酶的30 ng对照载体（pRL-TK；美国威斯康星州麦迪逊市普罗米加）根据制造商的说明。0–0.8μg（每个孔）和2μg或8μg（每孔25cm2烧瓶）或相应的空载体。使用空载体确保转染试验中总DNA的数量相等。使用双荧光素酶报告分析系统（Promega）荧光定量荧光素酶活性。数据表示为Photinus与Renilla荧光素酶活性的比值，以实现Photinus荧光素蛋白酶活性的正常化。

β-catenin、SREBP-1c、突触素和α-SMA的免疫染色及肝纤维化的组织学分析

如前所述，对培养的HSC进行单免疫染色，对肝脏切片进行双免疫染色（周等.,2010). 简言之，对于培养的HSC上的β-连环蛋白的单荧光染色，用正常血清阻断多聚甲醛固定的细胞，然后与抗β-连环蛋白的第一抗体（稀释1:100，Abcam）和DyLight488缀合的第二抗体（稀释1:500，ImmunoReagents，Inc.，Raleigh，NC，USA）孵育。细胞核用Hoechst 33342（Sigma）进行复染。为了对肝脏中的α-SMA进行单荧光染色，用正常血清阻断含副甲醛的肝脏切片，并用抗α-SMA的一级抗体（稀释1:100，Abcam）和DyLight488-结合二级抗体（稀1:500）孵育。肝脏SREBP1c的单一染色采用亲和素-生物素复合物（ABC）法；在用过氧化物酶封闭液和正常血清封闭后，用抗SREBP1c的一级抗体（稀释1:100，Abcam）和生物素化的二级抗体（稀1:500，ImmunoReactors，Inc.）孵育装有副甲醛的肝脏切片。此后，用ABC试剂（Vector Laboratories，Inc.，加利福尼亚州伯林盖姆，美国）和DAB试剂（Amresco，Solon，OH，美国）培养肝脏切片，然后用核染料苏木精（Sigma）进行复染。图像是用光学显微镜拍摄的。为了检测肝脏HSC中SREBP1c的表达，进行了双重荧光染色。用正常血清阻断副甲醛固定的肝脏切片，并用抗SREBP1c的一级抗体（稀释1:100，Abcam）和抗突触素的一级血清（SYP，稀释1:10，Abcam）孵育，突触素是静止和活化HSC的标志物（Cassiman等.,1999). 清洗后，用DyLight594-结合二级抗体（稀释1:500，ImmunoReactors，Inc.）和DyLight 488-结合二级抗原（稀释1:50）孵育肝脏切片。细胞核用Hoechst 33342（Sigma）进行复染。用荧光显微镜拍摄图像。为了对SREBP-1c阳性HSC进行定量，如双荧光染色法所示，在6个随机选择的高倍视野中以200倍放大率计数SREBP-1阳性HSC。

为了进行肝纤维化的组织学分析（胶原的天狼星红染色），将多聚甲醛固定的肝切片在室温下用苦味酸固绿（Amresco）染色10分钟，然后与苦味酸-天狼星红（Amresco）孵育1小时。用光学显微镜拍摄图像。

统计分析

每个结果都是从至少三个独立的实验中获得的。结果表示为平均值±SD。平均值之间的差异使用Student的非配对双侧进行评估t吨-测试。在适当的情况下，通过以下方法分析多种治疗条件与对照组的比较：方差分析Dunnett的测试用于事后（post-hoc）分析。P（P）<0.05视为显著。

结果

瘦素治疗增加培养HSC中β-catenin蛋白水平

为了研究瘦素是否与β-catenin信号通路相关，将培养的HSC与100 ng·mL孵育−1瘦素（Yan等.,2012)或10 mM氯化锂（罗迪奥瓦等.,2007)对于不同的时间段(图1A） 或使用不同浓度的瘦素24小时(图1B） ●●●●。由于LiCl可以抑制GSK-3β活性，导致β-catenin蛋白稳定，模拟Wnt信号通路（Hedgepeth等.,1997)，LiCl处理作为对照。图1和B表明，瘦素分别以时间依赖和剂量依赖的方式显著增加β-catenin蛋白水平。在6 h时点，瘦素明显上调了β-catenin的蛋白水平。氯化锂处理也增加了β-catenin蛋白水平。通过β-连环蛋白的免疫荧光染色进一步证实了瘦素对β-连环素的作用(图1C） ●●●●。此外，瘦素治疗后观察到β-catenin蛋白的核蓄积(图1C） 表明β-catenin的激活（麦克唐纳等.,2009). 基于这些结果，用β-连环蛋白活性报告质粒pGL3-OT转染HSC，检测瘦素对β-连环素反激活活性的影响。正如预期的那样，瘦素增加了β-连环蛋白反激活活性(图1D） ●●●●。随后用或不用100 ng·mL培养HSC−1通过实时荧光定量PCR进一步分析了瘦素在不同时间段对β-catenin mRNA水平的影响。出乎意料的是，瘦素在24小时内对β-catenin mRNA水平没有影响(图1E） ●●●●。

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瘦素治疗增加培养HSC中β-catenin蛋白水平和活性，但不增加β-catentin mRNA水平。（A，B）β-catenin水平的Western blot分析。用100 ng·mL培养HSC−1瘦素或10 mM氯化锂用于不同的时间段（A）或不同浓度的瘦素用于24小时（B）。显示了三个独立实验的代表。（C） β-连环蛋白的免疫荧光染色。用或不用100 ng·mL处理HSC后−1用抗β-catenin一级抗体和DyLight488-结合二级抗体（绿色荧光）对瘦素作用24h后的β-catentin蛋白进行免疫荧光染色。细胞核用Hoechst 33342（蓝色荧光）进行复染。代表性图像来自三个独立的实验。比例尺25μm。（D） β-catenin反激活活性的转染分析(n个= 6). 用质粒pGL3-OT或pGL3-OF+pRL-TK转染HSC，然后用不同浓度的瘦素处理24 h。荧光素酶活性表示正常化为内部对照pRL-TK活性后用pGL3-OT和pGL3-OFF检测到的信号的比率。所有值均表示为平均值±SD*P（P）与不含瘦素的对照组相比，<0.05。（E） β-catenin mRNA水平的实时PCR分析(n个= 3). 用或不用100 ng·mL培养HSC−1不同时间段的瘦素水平。所有值均表示为平均值±SD*P（P）>0.05与相同时间点无瘦素的相应对照组相比。

总的来说，结果显示在图1表明瘦素通过上调β-catenin蛋白水平和活性刺激HSC中的β-catentin信号传导，但在24小时内不影响β-catelin mRNA水平。

β-儿茶素是瘦素抑制培养HSC SREBP-1c基因表达所必需的

我们已经证明，瘦素强烈抑制HSC中SREBP-1c的表达在体外和体内（严等.,2012). 为了阐明β-连环蛋白是否介导了这种由瘦素诱导的对HSC中SREBP-1c表达的抑制，XAV939是β-连环素途径的一种有效抑制剂[促进β-连链蛋白的降解（Huang等.,2009)]已使用。HSC用不同浓度的XAV939预处理，然后用瘦素再处理24小时。蛋白质印迹分析显示，5μM XAV939导致β-连环蛋白水平显著降低(图2A） ●●●●。根据这一结果，分别用5μM XAV939或瘦素处理HSC 24 h，并用Western blot分析和实时PCR检测SREBP-1c的蛋白和mRNA水平(图2，C）。图2C证明XAV939在蛋白和mRNA水平上减弱了瘦素对SREBP-1c表达的抑制作用，表明β-catenin途径是瘦素诱导抑制培养HSC中SREBP-1基因表达所必需的。为了进一步证实这些结果，显性负性β-连环蛋白表达质粒pdncatenin（抑制β-连环素活性，支持信息图S3)或野生型β-catenin表达质粒pwtcatenin（增加β-catening活性，支持信息图S3)用质粒pSREBP1c-Luc联合转染HSC，用或不用瘦素刺激细胞。如所示图2通过荧光素酶分析，pdncatenin阻断letin诱导的β-catenin通路以剂量依赖性的方式上调荧光素酶活性。与未经治疗的对照组（右侧第一列）相比，仅瘦素（左侧第一列）降低了荧光素酶活性，而通过pwtcatenin转染（右侧第二列）可增强该活性。这些结果表明，瘦素诱导的β-catenin途径下调SREBP-1c启动子活性，与图2B和C瘦素似乎没有影响SREBP-1a的表达（支持信息图S4).

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β-儿茶素是瘦素抑制培养的HSC中SREBP-1c[前体SREBP-1c（前SREBP-1c），125kDa]基因表达所必需的。（A，B）β-catenin（A）蛋白水平和SREBP-1c前体形式的蛋白质印迹分析（B）。在用瘦素（100 ng·mL）治疗前，用不同浓度的XAV939预孵育HSC−1)再进行24小时。结果代表了三个独立的实验。（C） SREBP-1c mRNA水平的实时PCR分析(n个= 3). 在使用或不使用瘦素（100 ng·mL−1)额外24 h。所有值均表示为平均值±SD*P（P）与仅含瘦素的细胞相比，<0.05（左侧第一列）。（D） SREBP-1c启动子活性的转染分析(n个= 6). 用固定量的DNA混合物（包括0.8μg pSREBP1c-Luc、不同剂量的pwtcatenin（pwtcat）或pdncatenin。所有值均表示为平均值±SD*P（P）与仅含瘦素的细胞相比，<0.05（左侧第一列）。（E） 前SREBP-1c蛋白水平的Western blot分析。将HSC与递增剂量的氯化锂孵育12小时。结果表明，三个独立实验具有代表性。（F） SREBP-1c启动子活性的转染分析(n个= 6). 用pSREBP1c-Luc和pRL-TK转染HSC，然后用或不用LiCl孵育12 h。所有值均表示为平均值±SD*P（P）<0.05，与不含氯化锂的细胞相比。

由于氯化锂在第12小时增加了β-连环蛋白水平(图1A） ，用不同浓度的氯化锂处理HSC 12 h(图2E） 或用pSREBP1c-Luc转染HSC，然后用或不用LiCl培养12小时(图2F） ●●●●。Western blot分析和荧光素酶分析表明，氯化锂降低了SREBP-1c蛋白水平(图2E） 和SREBP-1c启动子活性(图2F） ，支持中的结果图2B–D类。

总之，这些结果有力地表明，β-连环蛋白通路介导了瘦素诱导的HSC SREBP-1c表达的降低在体外.

β-catenin通路参与了瘦素诱导的TAA诱导肝损伤ob/ob小鼠HSC中SREBP-1c蛋白水平的降低

研究β-catenin途径是否参与了leptin诱导的HSC中SREBP-1c蛋白水平的降低体内使用ob/ob小鼠（瘦素缺乏）和Ad.Dkk-1。给药TAA可导致正常小鼠肝纤维化，这是一个公认的肝纤维化模型（本田等.,2002). 相反，仅给予TAA 4周的ob/ob小鼠几乎没有发生肝纤维化，而给予TAA加瘦素4周的ob/ob小鼠会导致显著的肝纤维化（本田等.,2002; 雁鸣声等.,2012). Ad.Dkk-1（编码Wnt/β-catenin通路的拮抗剂Dkk-1）给药可以阻断肝脏中的β-catentin通路（Cheng等.,2008). 因此，在TAA治疗的4周期间，共给四组ob/ob小鼠注射瘦素、Ad.Dkk-1或Ad.Fc，如图3用ABC法对肝脏切片进行SREBP1c单染。HSC是具有星状突起的常驻窦周细胞。图3显示在第1组（TAA+Ad.Fc）中，具有星状突起的窦周细胞中明显存在SREBP-1c反应性，而在第2组（TAA+leptin+Ad.Fc）中几乎检测不到SREBP-1c阳性的窦周细胞。然而，当第3组小鼠接受TAA、瘦素和Ad.Dkk-1时，具有星状投射的窦周细胞中的SREBP-1c反应性再次出现。这些结果表明，在TAA诱导的肝损伤模型中，Dkk-1对β-catenin通路的阻断可以减轻轻蛋白诱导的HSC中SREBP-1c蛋白水平的降低。

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在TAA诱导肝损伤的ob/ob小鼠模型中，瘦素抑制HSC中SREBP-1c基因表达需要β-连环素。Ob/Ob小鼠随机分为四组：第一组（TAA+Ad.Fc）；第2组（TAA+瘦素+Ad.Fc）；第3组（TAA+瘦素+Ad.Dkk-1）；第4组（含TAA+Ad.Dkk-1）。小鼠注射TAA（200μg·g−1体重，i.p.，每周两次）或瘦素（1μg·g−1体重，每天一次），持续4周。Ad.Dkk-1或Ad.Fc（2×107pfu·g−1体重，每2周注射一次）。Ad.Fc被用作对照病毒。治疗4周后，通过以下方法检测HSC中SREBP1c或β-catenin的蛋白：（A）用ABC法在肝切片上对SREBP1c进行单一染色。每组的代表性图片(n个=6）显示SREBP-1c阳性的窦周细胞，呈星状投射（箭头所示）。比例尺25μm。（B） HSC中SREBP1c蛋白水平的Western blot分析[pre-SREBP1c，125kDa；核活性形式（nSREB1c），68kDa]或β-catenin。从四组中分离出HSC，并直接用于通过Western blot分析SREBP1c或β-catenin的蛋白水平。显示了三个独立实验的代表性图像。（C） 双荧光染色用于检测和定量SREBP-1c阳性HSC。用抗SREBP1c的一级抗体和抗突触素（SYP，静止和活化HSC的标记物）的一级抗原，以及随后用DyLight594结合的二级抗体（红色荧光），对肝切片进行双重荧光染色，检测SREBP-1c阳性HSC和DyLight488-共轭二级抗体（绿色荧光）。细胞核用Hoechst 33342（蓝色荧光）进行复染。每组的代表性图片(n个=6）。比例尺25μm。箭头显示阳性染色细胞的例子。SREBP-1c阳性HSC在六个随机选择的高功率场中以200倍放大率计数，SREBP-1阳性HSC的计数如直方图所示。所有值均表示为平均值±SD*P（P）与第1组（TAA+Ad.Fc）或第3组（TAA+瘦素+Ad.Dkk-1）相比，<0.05。

要验证此结果体内从各组中分离出HSC，并通过Western blot分析直接用于检测β-catenin和SREBP-1c蛋白水平(图3B） ●●●●。正如预期的那样，瘦素明显增加了β-catenin蛋白水平，但降低了SREBP-1c前体（125 kDa）和核活性形式（68 kDa；左边的第二条带）的蛋白水平，这些作用通过Ad.Dkk-1治疗（右边的第二个带）部分逆转。这些结果表明，在该小鼠模型中，β-连环蛋白通路介导瘦素诱导的HSC中SREBP-1c蛋白水平的降低。

为了确认上述结果，还对相同样品进行了双重荧光染色。SYP可用作静止和激活HSC的标记物（卡西曼等.,1999).图3显示了各组肝脏切片中SREBP-1c（红色）和SYN（绿色）免疫荧光分析的代表性显微照片。双重荧光染色和SREBP-1c阳性HSC计数表明，与第1组（TAA+Ad.Fc）相比，瘦素降低了SREBP-1阳性HSC（第2组：TAA+瘦素+Ad.Flc），而Ad.Dkk-1治疗部分抵消了这一作用（第3组：TAA+瘦素+Ad.Dk k-1）。这些双重荧光染色结果进一步支持了β-连环蛋白途径在瘦素诱导HSC中SREBP-1c蛋白水平降低中的作用。

总之，这些数据表明β-catenin途径介导了瘦素对HSC中SREBP-1c蛋白水平的影响体内.

ERK和p38 MAPK均与瘦素诱导的培养HSCβ-catenin蛋白的稳定有关

瘦素可增加HSC中的β-连环蛋白水平，但不增加β-连环素mRNA水平(图1)我们推测瘦素可能抑制β-catenin蛋白的降解。为了检验这种可能性，用瘦素刺激HSC 24小时（以增加β-catenin蛋白水平），然后用5μM环己酰亚胺（Reynaert等.,2005)在添加或不添加瘦素的情况下再维持24小时。Western blot分析表明，瘦素可延缓β-catenin蛋白含量的下降(图4A） 表明瘦素对培养的HSC中β-catenin蛋白降解具有抑制作用。

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ERK和p38 MAPK均介导瘦素诱导的培养HSC中β-连环蛋白的稳定。（A） β-catenin蛋白水平的Western blot分析。用瘦素刺激HSC 24小时，然后在有或无瘦素的情况下用5μM环己酰亚胺再处理24小时。结果是三个独立实验的代表。（B） 血清蛋白水平的Western blot分析9-磷酸化谷胱甘肽激酶-3β（p-GSK-3β）。用瘦素（100 ng·mL）刺激HSC−1)针对不同的时间段。总GSK-3β（T-GSK-3β）被用作内部控制。结果是三个独立实验的代表。（C） 血清蛋白水平的Western blot分析9-磷酸化谷胱甘肽激酶-3β（p-GSK-3β）和β-连环蛋白。在使用或不使用瘦素（100 ng·mL）刺激HSC之前，用或不使用PD98059（PD，MEK抑制剂，10μM）或SB203580（SB，p38 MAPK抑制剂，100μM）预处理HSC−1)额外30分钟（用于分析p-GSK-3β水平）或24小时（用于分析β-catenin水平）。总谷胱甘肽激酶-3β（T-GSK-3β）和β-肌动蛋白被用作各自的内部对照。结果是三个独立实验的代表。蛋白质条带的强度用密度计测定，印迹下的数字表明，在归一化为内部对照后，条带密度相对于相应对照（左侧第一条条带）的折叠变化*P（P）与单独使用瘦素的各样本相比，<0.05。（D） β-catenin活性的转染分析(n个= 6). 用β-catenin活性报告质粒pGL3-OT或pGL3-OF+pRL-TK转染HSC，然后用或不用PD98059（10μM）、SB203580（10μM）或瘦素（100 ng·mL）处理HSC−1)24 h。荧光素酶活性表示将pGL3-OT和pGL3-of归一化为内部对照pRL-TK活性后检测到的信号的比率。所有值均表示为平均值±SD*P（P）与未经治疗的相应对照组（左侧相应的第一列）相比<0.05。#P（P）与单独使用瘦素的样本相比，<0.05（左侧第二列）。

β-连环蛋白是谷胱甘肽激酶-3β的主要底物，谷胱甘氨酸激酶-3β可以通过N-末端丝氨酸（Ser9)从而稳定β-连环蛋白（Rodionova等.,2007; 卡拉奇等.,2008). 自从瘦素被证明可以刺激HSC中ERK和p38 MAPK的激活以来（周等.,2009; 雁鸣声等.,2012)ERK似乎可以磷酸化（在Ser9)随后使人肺成纤维细胞（Caraci）中的GSK-3β失活等.,2008)，我们检测了瘦素诱导的ERK和p38 MAPK激活是否导致血清GSK-3β磷酸化9以及随后在HSC中β-连环蛋白的积累。首先用瘦素刺激HSC不同时间段和GSK-3β磷酸化（Ser9)Western blot分析。图4研究表明，瘦素治疗增加了Ser的水平9-磷酸化GSK-3β。在30分钟的时间点，瘦素显著增加血清9-磷酸化GSK-3β水平。接下来，用PD98059（MEK抑制剂）或SB203580（p38 MAPK抑制剂）对HSC进行预处理，然后用瘦素刺激30分钟（用于分析血清9-磷酸化GSK-3β水平）或24小时（用于分析β-catenin蛋白水平）。蛋白质印迹分析(图4C） 研究表明，单独的瘦素会增加Ser的水平9-磷酸化GSK-3β和β-catenin蛋白，这些作用通过PD98059或SB203580预处理部分抵消。这些结果表明，瘦素诱导GSK-3β在血清中的磷酸化9随后，HSC中的ERK和p38 MAPK通路至少部分介导了β-catenin蛋白的稳定。

我们还评估了瘦素刺激的ERK和p38 MAPK通路在β-catenin反激活活性中的作用。用pGL3-OT或pGL3-OF转染培养的HSC，然后用或不用PD98059、SB203580或瘦素处理，如图4这些结果表明，瘦素上调了β-catenin反激活活性（左侧相应的第二个空柱或实心柱），PD98059或SB203580分别减弱了这一活性。这些结果与瘦素刺激的ERK和p38 MAPK通路参与β-catenin蛋白的稳定相一致。

瘦素通过ERK和p38 MAPK诱导β-catenin蛋白的稳定，导致培养的HSC中SREBP-1c表达降低

如我们所示，β-catenin参与了leptin诱导的对培养HSC中SREBP-1c表达的抑制(图2)有理由推测，通过激活ERK和p38 MAPK稳定β-catenin蛋白可能有助于减少HSC中SREBP-1c的表达。为了验证这一点，HSC首先被转染有或没有质粒pMKK6E（刺激p38 MAPK激活，图5A） 或质粒pcaMEK-1（刺激ERK激活，图5B） Western blot分析表明，转染pMKK6E或pcaMEK-1可导致β-catenin蛋白的积累（第二条带位于图5和B），并通过用XAV939（图中右侧的第一条带图5和B）。根据这些结果，HSC与pSREBP1c-Luc联合转染，无论有无pMKK6E(图5C） 或pcaMEK-1(图5D） 与相应的对照组（含载体）相比，pMKK6E的抑制作用(图5C） 或pcaMEK-1(图5D） XAV939处理部分抵消了荧光素酶活性。这些结果表明，p38 MAPK和ERK依赖性β-catenin蛋白的积累有助于瘦素诱导的对培养HSC中SREBP-1c启动子活性的抑制。

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阻断β-catenin信号通路可减弱ERK和p38 MAPK对培养HSC中SREBP-1c启动子活性的抑制作用。（A，B）β-catenin的Western blot分析。每25cm用pMKK6E（A）、pcaMEK-1（B）或空载体转染HSC2烧瓶，用XAV939或载体处理24小时。三个独立实验显示了代表性。（C，D）转染分析SREBP-1c启动子活性(n个= 6). 每孔用固定量的DNA混合物（包括0.8μg pSREBP1c-Luc、0.3μg pMKK6E或0.3μg pcaMEK-1、30 ng pRL-TK和空载体）共同转染HSC，并用5μM XAV939或载体处理24小时计算用XAV939或载体处理的细胞。所有数值均以平均值±SD表示*P（P）与单独使用载体的细胞相比，<0.05。使用空载体确保转染试验中的总DNA数量相等。

瘦素对β-catenin途径的诱导作用降低了培养HSC中SREBP-1c的活性形式及其反激活活性，但对SCAP、insigs和LXRα没有影响

SREBP-1c（68 kDa）的核活性形式是通过SREBP-1 c前体（125 kDa的裂解产生的。因此，在培养的HSC中检测了瘦素刺激的β-连环蛋白途径对SREBP-1c活性形式的蛋白质水平和SREBP-2c活性的影响。HSC用或不用XAV939预处理，然后用或不使用瘦素孵育24小时(图6A） ，或用增加剂量的质粒pdncatenin加pSRE-Luc（含有SREBP-1c结合位点）共转染HSC，并与瘦素一起或不与瘦素一起孵育24小时(图6B） ●●●●。结果表明，瘦素降低了SREBP-1c活性形式的水平(图6A） 及其反激活活性(图6B） XAV939分别逆转了(图6A） 和pdncatenin(图6B） ●●●●。

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瘦素诱导的β-catenin信号通路抑制SREBP-1c的激活，但对培养的HSC的insogs、SCAP和LXRα没有影响。（A） 核活性形式SREBP-1c（nSREBP-1 c，68 kDa）蛋白质水平的Western blot分析。HSC在使用或不使用瘦素进行额外24小时治疗之前，用或不使用XAV939进行预处理。显示的代表性结果来自三个独立的实验。（B） 转染法分析SREBP-1c的反激活活性(n个= 6). 每孔用固定量的DNA混合物（包括0.8μg pSRE-Luc、不同剂量的pdncatenin（pdncat）、30 ng pRL-TK和空载体）共同转染HSC，并用或不用瘦素（ng·mL）处理−1)24 h。数值表示为平均值±SD*P（P）与仅使用瘦素的对照组相比，<0.05（左侧第一列）。（C，D，E）SCAP、insig-1、insig-2和LXRα的蛋白质水平的蛋白质印迹分析。用或不用瘦素（100 ng·mL）治疗HSC−1)不同时间段（C），或在使用或不使用瘦素（100 ng·mL−1)再延长24小时（D，E）。显示的代表性结果来自三个独立的实验。（F） 用于分析LXRα反激活活性的转染试验(n个= 6). 每孔用固定量的DNA混合物（包括0.8μg pLXRE-Luc、不同剂量的pdncatenin（pdncat）、30 ng pRL-TK和空载体）共同转染HSC，并用或不用瘦素处理（100 ng·mL−1)24 h。数值表示为平均值±SD*P（P）> 0.05,#P（P）与仅使用瘦素的对照组相比，<0.05（左侧第一列）。使用空载体确保转染试验中的总DNA数量相等。

SCAP、insig-1和insig-2在控制SREBP-1c前体的裂解以生成其核活性形式（Goldstein等.,2006; 佐藤，2010). 因此，我们研究了瘦素刺激的β-连环蛋白途径对SCAP、insig-1和insig-2表达的影响。用或不用瘦素治疗HSC不同时间段，Western blot分析表明，瘦素在12-24小时内增加了insig-1蛋白水平，但对SCAP和insig-2蛋白水平没有影响(图6C） ●●●●。接下来，在用瘦素治疗24小时之前，用或不用XAV939对HSC进行预处理(图6D） ●●●●。Western印迹分析显示，XAV939未能影响瘦素对HSC中insg-1蛋白水平的影响，这表明β-连环蛋白通路不参与瘦素对HSC中insg-1表达的影响。

我们以前的研究表明，瘦素通过降低LXRα（Yan等.,2012). 因此，我们研究了瘦素刺激的β-连环蛋白途径对LXRα表达和活性的影响。HSC在接受瘦素或不接受瘦素治疗前，用XAV939或不用XAV93预处理24小时（Yan等.,2012;图6E） 或HSC在用或不用瘦素刺激24小时之前，用增加剂量的pdncatenin和质粒pLXRE-Luc（含有LXRα结合位点）共同转染（Yan等.,2012;图6F） ●●●●。出乎意料的是，Western blot分析和荧光素酶分析表明，阻断β-catenin通路对LXRα蛋白水平没有影响(图6E） 和反激活活性(图6F） ●●●●。

leptin上调的β-catenin通路对SREBP1c表达的负面影响影响培养HSC中α-SMA和α1（I）胶原的mRNA水平

SREBP-1c抑制HSC激活（She等.,2005)减少激活的HSC中α1（I）胶原蛋白的表达，α1（Ⅰ）胶原蛋白是ECM的主要成分（She等.,2005). 因此，我们研究了瘦素诱导的β-catenin途径对SREBP1c表达的负面影响是否会影响α-SMA（HSC激活的一个公认标记）和α1（I）胶原的转录。HSC转染有或没有质粒ptwist2[编码twist2，一种SREBP-1c活性的阻遏物（Lee等.,2003)]然后在含有脂肪分化鸡尾酒（MDI:0.5 mM IBMX，1μM地塞米松和1μM胰岛素）的DMEM中维持24 h。MDI用于减少HSC中α-SMA和α1（I）胶原的表达，并增加SREBP-1c的表达等.,2005). 在与MDI孵育后，将细胞切换到含有或不含XAV939的培养基中，并在添加或不添加瘦素刺激前预处理30分钟，再再刺激24小时。实时PCR分析显示，瘦素单独增加α-SMA和α1（I）的mRNA水平与对照组相比的胶原（左侧对应的第一列；图7A） ●●●●。XAV939预处理减弱了瘦素诱导的α-SMA和α1（I）胶原mRNA水平的增加（左侧相应的第三列）；通过转染ptwis2（右侧相应的第三列）可以部分消除这些影响。

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瘦素通过β-catenin途径抑制SREBP1c的表达，导致培养的HSC中α-SMA和α1（I）胶原mRNA水平下降，β-catentin途径是TAA诱导肝损伤的ob/ob小鼠模型中瘦素诱导肝纤维化所必需的。（A） 实时PCR分析α-SMA和α1（I）胶原的mRNA水平。25 cm内的HSC2转染或不转染8μg质粒ptwist2（抑制SREBP1c活性）或空载体。HSC在含有脂肪分化鸡尾酒（MDI:0.5 mM IBMX，1μM地塞米松和1μM胰岛素）和0.4%FBS的DMEM中保存24 h后，切换到含有或不含有XAV939（5μM）的培养基中，并在含有或不含瘦素（100 ng·mL）的孵育前进行预处理−1)再持续24小时，通过实时PCR分析检测α-SMA和α1（I）胶原的mRNA水平(n个= 3). 数值表示为平均值±SD*P（P）与未经处理的细胞相比，<0.05（左侧对应的第一列）**P（P）与仅含瘦素的细胞相比，<0.05（左侧相应的第二列）。§P（P）与XAV939加瘦素的细胞相比，<0.05（左侧相应的第三列）。（B，C）评估肝纤维化和HSC激活。相同的实验设计图3已使用。Ob/Ob小鼠随机分为四组：第一组（TAA+Ad.Fc）、第二组（TAA+leptin+Ad.Fc）、第三组（TAA+leptin+Ad.Dkk-1）和第四组（TAA+Ad.Dkk-1）。在小鼠接受相应试剂4周后，通过肝切片胶原蛋白天狼星红染色检测肝纤维化，并通过α-SMA（箭头所示）的单荧光染色检测HSC激活，其中α-SMA的一级抗体和DyLight488-共轭二级抗体（B）或从各组中分离出HSC，并通过Western blot分析（C）直接用于检测α1（I）胶原、α-SMA和细胞周期蛋白D1的蛋白水平。每组的代表性图片(n个=6）。比例尺（左侧）80μm。比例尺（右侧）25μm。

这些结果表明，瘦素通过β-连环蛋白途径对SREBP1c表达的抑制作用导致培养的HSC中α-SMA和α1（I）胶原的转录增加。

在TAA诱导肝损伤的ob/ob小鼠模型中，β-catenin通路是leptin诱导肝纤维化所必需的

如我们所示，β-catenin途径是leptin诱导抑制HSC中SREBP1c表达和活性所必需的，进一步研究了该途径在TAA诱导肝损伤小鼠模型中leptin诱发肝纤维化中的作用。与所示相同的实验设计图3已执行。简单地说，ob/ob小鼠被随机分为四组：第1组（TAA+Ad.Fc）、第2组（TAA+瘦素+Ad.Flc）、组3（TAA+瘦素+Ad.Dkk-1）和组4（TAA+Ad.Dk k-1）。所有小鼠接受相应试剂4周后，通过胶原天狼星红染色显示肝纤维化，通过α-SMA荧光染色评估HSC激活。如所示图7第1组（TAA+Ad.Fc）没有出现肝纤维化或HSC激活的迹象，而当小鼠联合服用TAA、Ad.Fc和瘦素时，明显出现肝纤维化和HSC激活（第2组）。用Ad.Dkk-1治疗可部分抑制这些效应（第3组）。活化的HSC是受损肝脏中主要的ECM生成细胞，并且增殖增加。这个d日-型细胞周期蛋白，如细胞周期蛋白D1，在活化HSC的增殖中起着关键作用（卡瓦达等.,1999). 因此，从第1-4组分离的HSC直接用于通过Western blot分析检测α1（I）胶原、α-SMA和细胞周期蛋白D1的蛋白水平(图7C） ●●●●。结果表明，与第1组相比，瘦素治疗增加了α1（I）胶原、α-SMA和细胞周期蛋白D1的表达（第2组），而与Ad.Dkk-1联合治疗则减弱了这些影响（第3组）。因此，这些来自蛋白质印迹分析的数据与从组织学分析获得的数据一致。

总之，这些结果表明β-catenin途径参与了TAA诱导肝损伤小鼠模型中瘦素诱导的肝纤维化。

讨论和结论

本研究结果表明，瘦素治疗通过稳定化增加HSC中β-catenin蛋白的水平，这与瘦素诱导的p38 MAPK或ERK激活以及随后的GSK-3β失活有关。瘦素对β-catenin蛋白的影响可导致HSC中SREBP-1c的表达和活性降低体内和在体外在TAA诱导肝损伤的ob/ob小鼠模型中，这可能导致HSC中α1（I）胶原和HSC活化标记物的增加，并有助于肝纤维化的形成。Insig和SCAP是控制SREBP-1c激活的关键调节因子（Goldstein等.,2006; 佐藤，2010). 我们的研究表明，瘦素治疗上调了培养的HSC中insig-1的蛋白水平，但没有上调SCAP或insig-2的蛋白水平。β-catenin途径似乎与瘦素对insig-1或LXRα蛋白水平和反激活活性的影响无关。然而，我们从各种实验中获得的结果表明，瘦素上调的β-catenin途径与HSC中SREBP-1c的表达之间存在关系，并且该途径参与了瘦素诱导的肝纤维化。有大量证据表明瘦素在肝纤维化发展中具有独特作用（阿列菲等.,2005; 曹等.,2006; 埃利纳夫等.,2009)我们的研究结果为瘦素诱导的抑制HSC和肝纤维化中SREBP-1c表达（抑制HSC活化的关键因素）的机制提供了新的见解。

不适当的β-catenin途径信号对纤维生成的影响才刚刚开始被了解（Lam和Gottardi，2011). Wnt/β-catenin途径已被证明可介导BDL诱导的小鼠肝纤维化（Cheng等.,2008). 此外，在小鼠和人类的肺纤维化中也观察到Wnt/β-catenin途径的激活（Königshoff和Eickelberg，2010). 在我们准备本文时，Akhmetshina及其同事发现β-catenin活性与转化生长因子β1（TGF-β1）诱导的皮肤纤维化（Akhmetchina等.,2012). 结合我们的研究结果表明，β-连环蛋白通路参与了瘦素诱导的小鼠肝纤维化，这些观察结果表明，β-连环蛋白通路在组织纤维化的发展中起着重要的中介作用。不太清楚发生这种情况的确切机制。值得注意的是，Wnt/β-catenin途径是脂肪生成和脂肪细胞分化的关键负调控因子（Arango等.,2005; 基督齿类等.,2009)而SREBP-1c（也称为脂肪细胞测定和分化依赖因子1）是促进脂肪细胞分化的关键转录因子（Rangwala和Lazar，2000). 此外，HSC激活类似于脂肪细胞对前脂肪细胞（成纤维细胞）的反分化（Tsukamoto，2005)SREBP-1c在抑制HSC激活中起着关键作用（Tsukamoto，2005). 我们的结果表明，HSC中瘦素上调的β-catenin途径与SREBP-1c表达呈负相关体内和在体外提示该通路在瘦素诱导的肝纤维化中起作用。因此，我们假设SREBP-1c可能是β-catenin途径促进HSC活化和肝纤维化形成的关键靶点。阿比奥拉等发现骨骼肌细胞中Wnt/β-catenin信号的激活通过下调SREBP-1c（Abiola等.,2009)表明SREBP-1c也是骨骼肌细胞中β-catenin途径的分子靶点。

瘦素诱导的β-catenin蛋白增加与瘦素抑制HSC中β-catentin蛋白降解有关。这一结果基于以下观察结果：第一，瘦素处理增加了β-catenin蛋白的水平，但不增加mRNA的水平。第二，当蛋白质生物合成受到抑制时，瘦素抑制了β-catanin蛋白含量的下降。第三，瘦素诱导血清GSK-3β磷酸化9（非活性形式），β-catenin蛋白（Rodionava）稳定性的关键调节器等.,2007; 卡拉奇等.,2008)导致β-catenin蛋白的积累。与我们的结果一致，瘦素也被证明能增加血清9-神经干/祖细胞（Garza等.,2012). 注意，Endo等. (2011)揭示了β-catenin通路的激活可以增加大肠细胞中瘦素受体的表达，结合瘦素对HSC和神经干细胞中β-catening蛋白稳定性的积极作用，表明β-catentin信号通路和瘦素信号通路之间存在相互关系。

GSK-3β受Ser磷酸化负调控9从而稳定β-连环蛋白（Rodionova等.,2007; 卡拉奇等.,2008)MAPK似乎与某些细胞类型（Bikkavilli和Malbon，2009). 我们的结果表明，瘦素诱导的p38 MAPK和ERK的激活导致了GSK-3β在血清中的磷酸化9以及稳定HSC中的β-连环蛋白。Wnt3a通过p38 MAPK使GSK3β失活，导致F9畸胎瘤细胞（Bikkavilli等.,2008). 有趣的是，Wnt3a诱导的p38 MAPK激活增加了β-catenin反激活活性，但对Wnt3a诱导的C3H10T1/2间充质细胞β-catentin蛋白水平的变化没有影响（Caverzasio和Manen，2007)而Wnt3a诱导的ERK不会影响同一细胞类型中的β-连环蛋白活性或β-连环素蛋白水平（Caverzasio和Manen，2007). 相反，TGF-β1磷酸化物诱导的ERK激活9)并使人肺成纤维细胞（Caraci）中的GSK-3β失活等.,2008). 这些观察结果表明，p38 MAPK和ERK对β-catenin通路的影响依赖于细胞类型。我们的结果并不排除其他信号通路参与瘦素调节HSC中β-catenin蛋白水平。最近，人们发现瘦素可以通过激活Janus激酶2诱导frizzle表达，从而激活软骨细胞中的β-连环蛋白途径（Ohba等.,2010). 我们的数据表明p38 MAPK和ERK通路与β-catenin通路之间存在串扰，并且在HSC中，这种串扰是由GSK-3β在血清中的磷酸化介导的9p38 MAPK和ERK诱导。

LXR在胰岛素介导的肝脏SREBP-1c转录激活中起着核心作用（Chen等.,2004). 我们之前的研究表明，瘦素诱导的p38 MAPK导致LXRα的表达和活性降低，从而导致HSC中SREBP-1c的表达下降（Yan等.,2012). 虽然本研究表明，瘦素诱导的p38 MAPK增加导致HSC中β-catenin蛋白的积累和随后SREBP-1c表达的减少，但我们的结果也表明，β-catentin途径对LXRα蛋白水平和活性没有影响，这意味着β-catenin途径与p38 MAPK对HSC LXRα的影响无关。然而，与我们的结果相反，β-catenin被证明能增强人类胚胎肾细胞（Uno等.,2009). 根据我们的结果，我们无法解释这种差异。

SREBP-1c的激活受其表达和前体蛋白水解裂解的调节。后一个过程由几个关键因素控制，如SCAP和insigs（Goldstein等.,2006; 佐藤，2010). 在我们的研究中，瘦素未能影响SCAP和insig-2蛋白水平，这表明β-catenin途径并不介导瘦素对HSC中insig-1蛋白水平的影响。因此，瘦素对HSC中SREBP-1c活性的抑制可能主要是由于β-catenin途径介导的瘦素诱导的SREBP-2c表达减少。

总之，通过使用在体外和体内方法，我们已获得证据表明β-catenin途径与leptin诱导的HSC中SREBP-1c表达和活性下降相关，并证明β-catentin途径在leptin诱发的HSC激活和肝纤维化中的作用。我们的结果并不排除瘦素也可能影响其他细胞类型（表达瘦素受体）的可能性，这些细胞类型也可能介导瘦素在肝纤维化中的作用。考虑到大多数肥胖患者会出现高瘦素血症，他们的血清瘦素浓度可高达169 ng·mL−1（Liuzzi）等.,1999)，本研究的结果可能对阐明与这些瘦素水平升高相关的肝纤维化机制具有潜在意义。

致谢

质粒pdncatenin和pwtcatenin是Jane B.Trepel（美国贝塞斯达国家卫生研究院NCI肿瘤医学分院）赠送的礼物。质粒pSREBP1c-Luc、质粒pMKK6E、质粒pcaMEK-1、质粒pLXRE-Luc、质粒pSRE-Luc和质粒ptwist2均由熊登（美国孟菲斯田纳西大学健康科学中心）、韩嘉怀（中国厦门大学）、苏林德·索恩（英国剑桥大学）、大卫·J·。Mangelsdorf（美国达拉斯德克萨斯大学西南医学中心）、Axel Nohturfft（伦敦圣乔治大学生物医学科学）和Jae Bum Kim（韩国首尔国立大学）。Ad.Dkk-1和Ad.Fc由Jill A.Helms（美国加利福尼亚州斯坦福大学）提供。我们感谢科学家们的重要帮助。

这项工作得到了国家科学基金（3097117号）、江苏省高等学校学术优先发展计划资助的项目和中国江苏省高等院校自然科学基金资助的项目（11KJB310009号）的支持。

词汇表

α-SMAα-平滑肌肌动蛋白
急诊室内质网
金融流量账户游离脂肪酸
GSK-3β糖原合成酶激酶-3β
HSC公司肝星状细胞
Insig公司胰岛素诱导蛋白
LXR公司肝X受体
SCAP公司SREBP裂解激活蛋白
固醇调节元件结合蛋白-1c固醇调节元件结合蛋白-1c

利益冲突

未申报。

支持信息

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图S1HSC中SREBP-1a和SREBP-1c mRNA水平的实时PCR分析。HSC在含有10%胎牛血清的Dullbecco改良Eagle's培养基中培养。提取总mRNA并进行实时PCR。根据Schmittgen等人的建议，计算了靶基因相对于内源性亲环素控制的mRNA水平的折叠变化，等《Anal Biochem》2000，285:194-204）。

图S2大鼠肝脏SREBP-1a和SREBP-1mRNA水平的实时PCR分析(n个= 3). 按照制造商的说明，使用TRI-试剂（美国圣路易斯西格玛）从大鼠肝脏中提取总mRNA。如支持信息所述，通过实时PCR分析SREBP-1a和SREBP-1 c的mRNA水平图S1.

图S3β-catenin活性的转染分析(n个= 6). 每孔用固定量的DNA混合物（包括0.8μg质粒pGL3-OT或pGL3-of、0.8μgpwtcatenin（pwtcat）或pdncatenin−1)在转染试验中，使用空载体以确保总DNA的数量相等。荧光素酶活性表示通过内部控制pRL-TK活性归一化后用pGL3-OT和pGL3-of检测到的信号的比率。所有值均表示为平均值±SD*P（P）与不含瘦素的细胞相比，<0.05（左侧第一列）**P（P）< 0.05,#P（P）与仅含瘦素的细胞相比，<0.05（左侧第二列）。

图S4SREBP-1a mRNA水平的实时PCR分析(n个= 3). 在使用或不使用瘦素（100 ng·mL−1)再持续24小时。如支持信息中所述，通过实时PCR分析SREBP-1a的mRNA水平图S1.

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文章来自英国药理学杂志由以下人员提供英国药理学学会