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分子生物学细胞。2004年3月；15(3): 1470–1478.
数字对象标识：10.1091/桶。E03-08-0599号
预防性维修识别码：PMC363169型
PMID：14668483

Sec61p有助于根据积极内部规则确定信号序列方向

Veit Goder公司，* 蒂娜·朱恩、和马丁·施皮斯†
里德·吉尔摩，监控编辑器
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

靶向内质网的蛋白质由信号或信号锚定序列介导。它们在蛋白质拓扑学中也起着重要作用，因为它们在转座子中的定位决定了它们的N或C末端序列是否易位。信号定向主要由疏水核两侧的带电残基决定，其中较阳性的一端主要位于膜的细胞质侧，这一现象被称为“正内侧规则”。我们测试了Sec61p保守带电残基的作用，Sec61p是转座子的主要组分酿酒酵母，通过使用诊断模型蛋白进行定点诱变，根据其侧翼电荷对信号进行定向。Sec61p中R67、R74或E382的突变减少了具有阳性N末端侧翼序列的信号锚蛋白的C末端易位，并增加了具有阳性C末端序列的信号锚固蛋白的C端易位。这些突变对底物产生了更强的影响，在信号的疏水核上有更大的电荷差异。对于某些底物，Sec61p中的电荷突变与底物多肽中的电荷变异具有类似的效果。虽然这三个残基并不能解释信号定向中的整个电荷效应，但结果表明Sec61p有助于正内侧规则。

简介

分泌和膜蛋白靶向内质网（ER）是由信号序列介导的(沃尔特和约翰逊，1994年)。其主要特征是由信号识别粒子（SRP）识别的一段7-25非极性残基(基南等。, 2001)。在SRP与信号序列结合时，核糖体上升链复合物通过与SRP受体的相互作用靶向内质网，信号被转移到易位和整合通道，即转座子。除了它们的靶向功能外，信号序列通过将自身定位在转运子并最终定位在膜中，在蛋白质拓扑发生中发挥重要作用(《间谍》，1995年)。分泌蛋白的信号序列假设为N细胞周期/C类外显（exo）定位（细胞质N和外质C末端），从而启动其C末端序列移位到内质网腔中。膜蛋白的不可切割信号分子移位其C末端或N末端。几个参数决定了膜中的信号方向。最确定的是信号疏水核两侧带电残基的分布。正如在细菌中首次发现的那样，带正电荷的侧翼序列主要定位在膜的细胞质侧，这一现象被称为“阳性内部规则”(冯·海因（von Heijne），1986年)。对于ER信号，信号核两侧区域之间的电荷差异，而不是正电荷本身，与信号序列方向相关(哈特曼等。, 1989)。由于在内质网膜上没有一般的电势，电荷规则可能是由于信号中的电荷与转座子处或附近的电荷相互作用造成的。

除侧翼电荷外，其他特征也会影响信号方向。序列N末端折叠为内部信号可能在空间上阻碍N末端的移位，而与电荷分布无关(登策尔等。, 1995)增加非极性信号核的长度和疏水性有利于N末端移位到内质网腔(阪口等。, 1992;Wahlberg和Spiess，1997年;欧塞比奥等。, 1998;哈雷等。, 1998;罗什等。, 2000).

为了研究信号定向的机制，我们最近用一个由22个亮氨酸组成的长而疏水的N末端信号锚分析了模型蛋白质(戈德与间谍，2003年)。尽管有一个正的N末端和一个负的C末端侧翼序列，但只有一小部分分子插入了预期的N末端细胞周期/C类外显（exo）方向。这一比例随着蛋白质长度的增加和翻译时间的增加而增加，表明信号最初插入N外显（exo）/C类细胞周期根据电荷分布，定向和随时间反转。正如预期的那样，信号再定向动力学随着绝对电荷差Δ（C-N）的减小而增加。相反，信号核疏水性的增加减缓了信号反转，可能是因为与转座子中的信号结合位点的相互作用更紧密。

在本研究中，我们研究了酵母中主要转座子成分的作用酿酒酵母，第61p节，读取编码在信号序列侧翼电荷中的方向信息。Sec61p是异源三聚体膜蛋白复合物（由Sec61p、Sbh1p和Sss1p组成，与哺乳动物细胞中的Sec61α、β和γ相对应）中最大的亚单位，形成穿过ER膜的蛋白质传导通道(桑德斯等。, 1992;哥里奇和拉波波特，1993年;海因里希等。, 2000)。蛋白质在酿酒酵母并保存在各个王国(Deshaies和Schekman，1987年;波尔施罗德等。, 1997)。大量交联实验表明，分泌蛋白的信号序列和膜蛋白的信号抑制剂在插入过程中与Sec61p或其哺乳动物同源物Sec61α接触（高等。，1993年a，b条;蛾类等。, 1994;皮隆等。, 1998;普拉斯等。, 1998)。我们发现，蛋白质内腔和细胞质环中Sec61p的特定带电残基有助于根据内质网膜中的阳性内部规则定向信号序列。

材料和方法

Sec61p正交图对齐

Sec61p的氨基酸序列(酿酒酵母/瑞士普罗特：第32915页)与10个直系同源物一致(白色念珠菌/问题9P8E3;溶脂假丝酵母/第78979页;智人/第57726页;小家鼠/Q9JLR1号机组;家族犬/第38377页;秀丽隐杆线虫/O18239号;拟南芥/Q9ZV90型;黑腹果蝇/Q9VMD1；甲烷杆菌/O26134号;深海热球菌/Q9V1V8)和同源Ssh1p(酿酒酵母/第38353页)通过使用多重校准程序ClustalW(http://www.ch.embnet.org/software/ClustalW.html)。使用预测程序TMpred对Sec61p的10个跨膜结构域进行了定位(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)。预测的拓扑结构与Sec61α的预测一致(格利希等。, 1992)并得到威尔金森实验数据的支持等。(1996)，由于数据不明确，TM5的确切位置除外。

酵母菌株与Sec61p突变

酵母菌株RSY1293(垫子α、 can1-100，leu2-3122，his3-11,15，trp1-1，ura3-1，ade2-1，sec61:：his3，[pDQ1]）是R.Schekman（加利福尼亚大学伯克利分校）赠送的礼物(皮隆等。, 1997)。第1季度(LEU2 CEN第61节)由YCplac33交换(URA3欧洲标准化委员会)包含野生型SEC61。这种产生的菌株VGY61被用作亲本菌株来引入突变体第61秒克隆到YCplac111(LEU2欧洲标准)使用5-氟有机酸进行质粒改组。使用pDQ1作为模板和Vent聚合酶（马萨诸塞州贝弗利新英格兰生物实验室），通过聚合酶链反应对SEC61进行定点突变。

创建Δssh1型用于我们分析的突变菌株VGY61与BWY465杂交(ssh1：：TRP1; 来自英国曼彻斯特大学B.Wilkinson）(威尔金森等。, 2001)。产生的二倍体被孢子化，进行四分体切割，并筛选Trp/Ura表型。通过使用Ssh1p抗体（来自德国柏林T.Sommer）与野生型细胞进行免疫印迹分析，验证了Δssh1表型。该菌株随后被用于质粒改组第61秒突变质粒。Δssh1菌株在产生后立即冷冻。在解冻等分试样后的几天内进行了实验。在实验时，大多数细胞仍具有呼吸能力。

模型蛋白质结构

所有模型蛋白均使用Vent聚合酶（新英格兰生物实验室）通过聚合酶链反应进行工程。[Leu16]（-3）CPY由H1ΔLeu16的38个N末端残基组成(Wahlberg和Spiess，1997年)，通过Val-Asp连接器熔断（对应于萨尔I位点）连接到成熟羧肽酶Y（CPY）的残基5-211，然后是Ala-Cys连接子(速度I位点）融合到C末端三重血凝素（HA）标签上。40[Leu16]（+5）由H1-4Leu16的74个N末端残基组成(Wahlberg和Spiess，1997年)如上所述，与CPY-HA融合。60[H1]（+1）CPY由Ste2p的残基1-33组成，包括N个-糖基化位点通过Ser-Arg-Leu连接子与结构体H1-3的残基14-74融合(贝尔策尔等。, 1991)，然后是CPY-HA，就像上面提到的其他构造一样。如文中所示，侧翼电荷发生了突变。使用2μ/URA3公司带有甘油-3-磷酸脱氢酶启动子和磷酸甘油酸激酶终止子的质粒pRS426（来自加利福尼亚州圣地亚哥斯克里普斯研究所N.Kralli）。

标记和免疫沉淀

对于体内脉冲标记，酵母细胞在30°C的最小培养基中用组氨酸、腺嘌呤、亮氨酸和色氨酸培养过夜；稀释；并长到OD600纳米～1。将相当于1.5 OD的细胞重新悬浮在200μl培养基中，在30°C下培养15分钟，并用100μCi/ml标记5分钟[35S] 蛋氨酸（Amersham Biosciences，Piscataway，NJ）。为了追踪，进一步用过量（0.2 mM）的未标记蛋氨酸培养细胞。然后用5 mM叠氮化物补充细胞，转移到冰中，用磷酸盐缓冲盐水洗涤两次，并用玻璃珠在打浆器中溶解7分钟。用1%的SDS补充裂解液，并在95°C下加热5分钟。通过在Microfuge中离心10分钟，去除细胞残留物，并使用抗HA-tag的单克隆抗体将上清液用于免疫沉淀。用蛋白A-Sepharose（Amersham Biosciences）分离免疫复合物，并通过SDS-PAGE和放射自显影术进行分析。信号通过磷成像仪（分子动力学，加利福尼亚州森尼维尔）进行量化。为了分析内源性Gas1p，细胞数量增加了2.5倍，用400μCi/ml标记细胞3分钟[35S] 蛋氨酸。

对于脱糖基化，免疫复合物通过在50 mM柠檬酸钠（pH 6，1%十二烷基硫酸钠）中煮沸从蛋白A-Sepharose中释放出来，并与1 mU内切-β-d孵育-N个-在凝胶电泳前，在37°C下乙酰氨基葡萄糖苷酶H作用5小时。对于蛋白酶保护实验，在30°C、50 mM Tris-HCl（pH 7.5）和30 mM二硫苏糖醇的存在下，用每毫升包装酵母细胞2 mg酶解酶20T（Seikagaku America，Rockville，MD）洗涤脉冲标记细胞并进行球状成形。然后将细胞转移到冰中，并在Dounce匀浆器中用20次裂解。分离匀浆，并在存在或不存在0.4%Triton X-100的情况下，使用或不使用100μg/ml胰蛋白酶培养30分钟。所有反应均补充500μg/ml胰蛋白酶抑制剂，并按照上述方法进行免疫沉淀处理。对于碱性提取，细胞生长到OD600纳米1.5，相当于3.0 OD600纳米单元被转移到冰上，用磷酸盐缓冲盐水清洗两次，然后用玻璃珠溶解。细胞被分成两份，其中一份放在冰上。将另一等分试样在冰上在pH 11.5下孵育10分钟，并使用所述的Airfuge通过蔗糖垫离心(韦塞尔斯等。, 1991)。用10%三氯乙酸沉淀上清液。对总量、上清液和颗粒进行SDS-PAGE和免疫印迹分析。

结果

检测信号定向变化的模型蛋白质

为了监测Sec61p突变体对信号定向的影响，我们使用在野生型酵母细胞中以混合定向插入的模型蛋白。模型蛋白[Leu16]（-3）CPY具有16个亮氨酸残基的N端信号锚和具有电荷差Δ（C-N）的修饰的N端和C端侧翼区（根据哈特曼等。, 1989)第页，共3页(图1A)。将该序列融合到酵母分泌蛋白CPY的一部分以确保良好表达，并将HA-tag用于免疫沉淀。三个站点N个-连接糖基化是C末端易位的报告者。野生型Sec61p在细胞中的表达及标记[35S] 蛋氨酸作用5分钟后，只有约45%的[Leu16]（-3）CPY被糖基化，这已通过对内糖苷酶H的敏感性得到证实(图1A，车道1和2）。其余的产品是未糖基化的，与N一致外显（exo）/C类细胞周期方向。用胰蛋白酶培养球状细胞和均质细胞，导致非糖基化蛋白部分降解，但有少量甚至在洗涤剂存在下仍有抵抗力(图1A，3-5车道）。相反，在没有蛋白酶的情况下，糖化蛋白部分受到保护，但在有洗涤剂的情况下完全消化。该实验证实，糖基化模式代表蛋白质取向。

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模拟基板以检测信号方向的变化。（A） 图中显示了[Leu16]（-3）CPY的N端序列，该序列具有16个连续亮氨酸残基（装箱）、正N端和净负C端侧翼区域的信号锚。钻石表示突变R4E和E30K的位置，它们将电荷差Δ（C-N）从-3改变为-1。表达[Leu16]（-3）CPY的野生型Sec61p细胞被标记为[35S] 蛋氨酸5分钟。免疫沉淀蛋白质，并通过SDS-gel电泳和放射自显影术进行分析（第1道）。经内切糖苷酶H（EndoH）敏感性（通道2）证实，产生了三种含有零、二或三个聚糖（箭头）的产物。在蛋白酶保护实验（通道3-5）中，在免疫沉淀和分析之前，将标记细胞均质化，并在不含蛋白酶（-）、含胰蛋白酶（T）或含胰蛋白酶的洗涤剂（TD）中培养。受保护的糖基化产物和对胰蛋白酶敏感的未糖基化产品对应于N细胞周期/C类外显（exo）和N外显（exo）/C类细胞周期方向，如右图所示。C端子盒指示HA标签。突变R4E（第6车道）或E30K（第7车道）导致电荷差异降低，导致N外显（exo）/C类细胞周期方向。（B） 显示了40[Leu16]（+5）CPY（残基32-74）的内部信号锚定序列。钻石表示突变D34R和K65E的位置，它们将电荷差Δ（C-N）从+5降低到+3。40[Leu16]（+5）CPY在含有野生型Sec61p的细胞中表达，并进行内切糖苷酶H敏感性和蛋白酶保护试验，如A中所示。突变D34R（第6道）或K65E（第7道）导致电荷差异降低，导致N细胞周期/C类外显（exo）方向。分子量标记的位置显示在放射自显影的右侧。细胞质；外来的，外来的。

有趣的是，与标记后立即裂解的细胞相比，为蛋白酶保护试验准备的细胞中的糖基化增加了三倍。这很可能是由于第三个糖基化位点在球状化标记细胞所需的30分钟内发生翻译后修饰。这也得到了稳定状态下的糖基化模式的支持，其中完全修饰的物种是主要的糖基产物，并且在脉冲相实验中（见下图；图​图3C，3C公司，车道1；和​和5B5亿).

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Sec61p中的特定电荷突变影响[Leu16]（-3）CPY的取向模式。（A） [Leu16]（-3）CPY在Sec61p野生型和突变株中表达，脉冲标记为[35S] 蛋氨酸5分钟，免疫沉淀并通过凝胶电泳和放射自显影进行分析。突变体R225E/K226E/K228E/K229E/R230E缩写为R225E//R230（东经）。（B） 糖基化产物的组分（N细胞周期/C类外显（exo）方向）通过荧光成像仪分析定量。绘制了至少三次单独测定的平均值和标准差。白色条显示野生型Sec61p突变模型蛋白的取向模式（参见图1A，第6和第7车道）。根据Student’s吨试验（p≤0.05）。（C） 通过碱提取（通道1-15）测试[Leu16]（-3）CPY在表达野生型Sec61p和选定突变体的细胞中的膜整合。用抗HA抗体免疫印迹法分析上清液（S）和膜颗粒（P）以及起始物质（T，总量）。作为一种可溶性控制蛋白，对CPY进行平行分析（16-18道）。分子量标记的位置（单位：千道尔顿）已标明。

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Sec61p突变菌株的产品稳定性和糖基化效率。（A） 为了测试糖基化效率，在带有选定Sec61p突变体的菌株中表达带有酵母Ste2p的N末端部分的模型蛋白60[H1]（+1），该突变体标记5分钟，并含有糖基化位点[35S] 蛋氨酸和免疫沉淀（1-9道）。显示了附加聚糖的数量。此外，通过标记3分钟，分析具有不同Sec61p突变体的细胞中内源性Gas1p的糖基化效率[35S] 蛋氨酸和免疫沉淀（lanes 10-15）。在分析之前，对来自野生型细胞的等分样品进行内切糖苷酶H（endoH）脱糖基化处理（第10车道）。（B） [Leu16]（-3）CPY在Sec61p野生型和突变株中表达，脉冲标记5分钟[35S] 在免疫沉淀和分析之前，蛋氨酸和追赶在过量的未标记蛋氨酸存在下0-40分钟。在所有菌株中，组合糖基化形式的表观半衰期>90分钟，非糖基化形式的表观半衰期为30-40分钟。注意，在追逐期间，二到三倍糖基化形式逐渐转变。

尽管电荷差Δ（C-N）为-3，但[Leu16]（-3）CPY插入物具有混合取向，根据正内侧规则，这预测了C末端易位。这是因为由局部电势驱动的信号重新定向被疏水性Leu减缓16信号的核心(戈德与间谍，2003年)。Sec61p中带电残基的突变有助于降低信号反转的驱动力，并减少糖化氮的数量细胞周期/C类外显（exo）分子。为了了解这种突变所预期的拓扑变化，我们突变了底物蛋白[Leu16]（-3）CPY中的侧翼电荷：N端精氨酸-4突变为谷氨酸（R4E）或C端谷氨酸-30突变为赖氨酸（E30K），在这两种情况下，模型蛋白的绝对电荷差都减少了2（Δ（C-N）=-1）。在含有野生型Sec61p的细胞中表达时，糖基化产物的比例分别从～45%降至～5%和～26%(图1A，泳道6和7）。R4E突变体的影响更大，很可能是因为残基4比残基30更接近疏水信号核心。

具有反向电荷分布的N端信号[即正Δ（C-N）]均匀插入N外显（exo）/C类细胞周期定向，因为信号再定向没有力。然而，如果信号是内部的，N端亲水结构域可能会导致混合取向，也会带有反向侧翼电荷(贝尔策等。, 1991;登策尔等。, 1995;Wahlberg和Spiess，1997年)，因为N末端序列的折叠与其移位竞争，可能导致信号反转。作为第二个诊断底物蛋白，我们使用40[Leu16]（+5）CPY(图1B)。它与[Leu16]（-3）CPY的不同之处在于Leu16核心之前是去唾液酸糖蛋白受体H1的40-氨基酸N-末端结构域，每侧的两个最近的侧翼电荷突变为相反电荷的残基（两个N-末端精氨酸到天冬氨酸，两个C-末端谷氨酸到赖氨酸）。由此得出的电荷差Δ（C-N）为+5。通过将天冬氨酸-34突变为精氨酸或将赖氨酸-68突变为谷氨酸来减少电荷差异，增加了糖基化N的比例细胞周期/C类外显（exo）产品从47到～84%(图1B，通道6和7），证实该模型蛋白的拓扑依赖于与[Leu16]（-3）CPY类似的电荷相互作用。

Sec61p中的特异性电荷突变降低[Leu16]（-3）CPY的C末端易位

Sec61p跨越膜10倍，其N和C末端均朝向膜的细胞质侧(威尔金森等。, 1996) (图2)。为了识别Sec61p中可能在定向过程中与信号序列侧翼电荷相互作用的带电残基酿酒酵母序列与同源序列Ssh1p和10个同源序列对齐（见材料和方法）。我们筛选了与正内侧规则相反的保守带电残基（即，面向细胞质的负电荷残基和面向膜腔侧的正电荷残基）。如所示图2，我们鉴定出25个符合这些标准的残基。

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Sec61p的保守残基可能参与解码信号序列的侧翼电荷。氨基酸序列和膜拓扑酿酒酵母第61p节如图所示。与正内侧规则相反的荷电残基在Sec61p同源序列中具有很好的保守性，用填充圆表示。

为了测试这些残基对信号定向的贡献，通过定点突变改变它们。为了最小化潜在的构象效应，谷氨酸和天门冬氨酸分别突变为结构相关的谷氨酰胺和天门冬酰胺，使细胞溶质净电荷增加1个单位。由于精氨酸或赖氨酸不存在结构相似的残基，这些残基被突变为电荷相反的氨基酸，使胞外净电荷减少2个单位。然而，在第一系列结构中，紧密间隔的酸性残基一起发生突变。因此，大多数Sec61p突变体包含2个单位的净电荷变化。将产生的突变质粒导入酵母菌株VGY61，该菌株缺乏第61节，替换野生型质粒第61节通过质粒洗牌。对新转化的酵母菌株进行生长表型筛选。在15、30或37°C的富培养基平板上，没有一个突变菌株显示出明显的生长缺陷，这表明Sec61p突变体都是功能性的。

[Leu16]（-3）CPY在含有突变Sec61p的酵母菌株中表达，脉冲标记5分钟[35S] 蛋氨酸，免疫沉淀，凝胶电泳和放射自显影分析(图3A)。模型蛋白在几个突变菌株中显示出改变的糖基化模式。在定量时，七个突变体显示糖基化部分显著减少，表明预期向N转移外显（exo）/C类细胞周期方位(图3B; p≤0.05，根据学生的吨测试；用星号标记）。对于其中三个，即R67E、R74E和K313E，变化的程度与底物蛋白[Leu16]（-1）CPY（R4E）和（E30K）中观察到的电荷突变的程度相似。通过碱提取，确认Sec61p和K361E的这三个突变体的所有产物都稳定地整合到ER膜中(图3C)。因此，糖化蛋白的减少并不是由于膜整合效率低下。还可以证明，Sec61p的突变并没有降低糖基化的效率，例如，通过干扰糖基化机制对转座子的补充（见下文；图5A)。因此，观察到的糖基化模式变化反映了向N的转变外显（exo）/C类细胞周期拓扑结构。

R67E、R74E和E382R反向影响带有反向侧翼电荷的信号锚

N人口增加外显（exo）/C类细胞周期[Leu16]（-3）CPY分子对于识别参与信号定向的带电残基是必要的，但不是充分的标准，因为Sec61p中的突变在空间上阻碍信号重新定向或蛋白质移位，将影响同一方向的拓扑结构。有助于局部电位驱动信号定向的带电残基预计会对反向信号产生相反的影响，即正电荷差Δ（C-N），如构造40[Leu16]（+5）CPY。

与[Leu16]（-3）CPY相比，在Sec61p突变株中表达40[Leu16]（+5）CPY的糖基化模式变化较小(图4，A和B)。在那些显示[Leu16]（-3）CPY向N末端易位的Sec61p突变中，R67E和R74E对40[Leu16]（+5）CPY显示相反的效果，向C末端易位转变，这支持这些残基通过侧翼电荷在信号定向中的作用。然而，与底物蛋白中的电荷突变相比，40[Leu16]（+5）CPY的作用较弱。K313E和K361E促进了[Leu16]（-3）CPY的N末端易位，但对40[Leu16]（+5）CPY没有促进。由于这些残基在相反方向上也没有表现出显著变化，因此它们在信号定向中的作用尚不清楚。相比之下，突变体D390N/D397N、E407Q/E413Q和E460Q/E465Q导致两种底物蛋白的糖基化部分持续减少，表明信号重新定向或移位普遍存在缺陷。

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Sec61p突变体R67E、R74E和E382R反向影响40[Leu16]（+5）CPY的取向，这是一种带有反向侧翼电荷的底物。（A和B）测定Sec61p野生型和突变株中40[Leu16]（+5）CPY的插入模式，并量化[Leu16]（-3）CPY在Sec61p中的插入模式图3，A和B指示了分子量标记的位置（以千道尔顿为单位）。（C和D）分析附加Sec61p突变体D168R/E169R、E266R和E382R对底物[Leu16]（-3）CPY和40[Leu16.]（+5）CPY的取向效应。

E382Q是一个有趣的Sec61p突变，因为它导致40[Leu16]（+5）CPY的糖基化群体略有但显著增加，并且可能导致[Leu16]（-3）CPY糖基化人群略有减少。由于该突变的净电荷变化只有1，我们还测试了突变E382R，其中负电荷被正电荷取代。同样，我们生成了E266R和D168R/E169R。E266R表现为野生型Sec61p和D168R/E169R减少了两种底物的C末端易位（在所有温度下都伴有生长缺陷），而E382R显著降低了[Leu16]（-3）CPY的C末端易位分数，增加了40[Leu16]（+5）CPY(图4、C和D)。这一结果支持了E382通过与侧翼电荷的相互作用来定向信号序列的结论。

作为另一项控制，糖基化模式也反映了具有内部信号锚的底物的拓扑结构，我们用底物蛋白60[H1]（+1）CPY测试了Sec61p突变体的子集。该蛋白由α-因子受体Ste2p的60个氨基酸的N端部分组成，Ste2p是H1信号锚定结构域的疏水核心，其C端序列与40[Leu16]（+5）CPY相同。电荷差Δ（C-N）仅为+1，但与疏水性较弱的信号结合在一起。由于Ste2p结构域包含一个糖基化位点，该蛋白在膜插入时以任一方向发生糖基化：当C端易位时为两倍或三倍，当N端易位后为一倍。野生型或突变型Sec61p在细胞中的表达(图5A60[H1]（+1）CPY中只有一小部分（约4%）保持未糖基化，这表明测试的Sec61p突变不会影响糖基化、靶向和膜整合的效率。此外，突变R67E和R74E明显增加了多重糖基化组分（即N外显（exo）/C类细胞周期取向）与野生型Sec61p进行比较，证实了40[Leu16]（+5）CPY的结果。同样，内源性糖蛋白Gas1p在3分钟后发生糖基化[35S] 蛋氨酸标记在野生型和Sec61p突变株中是同等有效的(图5A，10-15车道）。因此，在表达Sec61p关键突变体的细胞中，糖基化通常不会减慢。

为了排除Sec61p突变可能对糖基化和非糖基化产物的稳定性产生不同影响，进行了脉冲相实验。[Leu16]（-3）CPY在带有野生型或突变Sec61p的细胞中表达，标记5分钟，并在免疫沉淀和分析之前追踪40分钟(图5B)。除了翻译后从两倍糖基化物种转变为三倍糖基化外，糖基化形式在所有测试菌株中都非常稳定，而未糖基化的形式半衰期为～30分钟。结果表明糖基化[Leu16]（-3）的比例降低具有特定Sec61p突变体的细胞中的CPY不是这些产物降解加剧的结果。Sec61p突变不会显著影响这两种形式的降解率。

基于上述实验，氨基酸R67、R74和E382符合Sec61p中带电残基的标准，根据正内侧规则参与信号序列定向。然后将突变R67E、R74E和E382R组合在所有可能的组合中，以测试它们对[Leu16]（-3）CPY和40[Leu16.]（+5）CPY拓扑结构的影响是否相加。如中所示图6，A和B，这只是部分情况。特别是，具有R67E/R74E和R67E/R74E/E382R组合的突变Sec61p没有显示底物40[Leu16]（+5）CPY的C末端易位显著增加，但显示[Leu16]（-3）CPY显著减少。这可以用Sec61p中的一个额外结构缺陷来解释，该缺陷抑制信号重新定向，并叠加在电荷效应上，对[Leu16]（-3）CPY加上该缺陷，然后从中减去40[Leu16.]（+5）CPY。在某些单一突变中可能已经存在某种程度的结构缺陷。如果是这种情况，人们可能会认为Sec61p突变的电荷效应越显著，底物蛋白的电荷差异越大。为了测试这一点，我们使用底物40[Leu16]（+7）CPY和40[Leu 16]（+3）CPY分析了Sec61p突变体的选择，这两种底物是40[Leu16]（+5）CPY的两个变体，其中电荷差分别通过谷氨酸-72突变为赖氨酸而增加，或通过赖氨酸-65突变为谷氨酸而减少。的确，如图所示图7Sec61p突变体R67E、R74E和E382R对40[Leu16]（+7）CPY的C末端易位的刺激作用（A和B）比40[Leu 16]（+5）CPY强烈得多，而40[Leu16]（+3）CPYC和D的结构缺陷似乎推翻了电荷效应。

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结合电荷突变R67E、R74E和E382R。（A和B）具有Sec61p联合突变的菌株中[Leu16]（-3）CPY或40[Leu16.]（+5）CPY的插入模式按照图3，A和B为了进行比较，已包括单个突变体中的蛋白质定向值。

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Sec61p突变通过电荷效应和结构效应影响信号定向。Sec61p野生型和突变菌株中40[Leu16]（+7）CPY（A和B）和40[Leu 16]（+3）CPY的插入模式按照图3（A和B)。40[Leu16]（+7）CPY对应于40[Leu 16]（+5）CPY，其中电荷差因突变E72K而增加。在40[Leu16]（+3）CPY中，电荷差因变异K65E而减少。

电荷突变R67E、R74E和E382R的影响与Ssh1p的存在或不存在无关

除了由Sec61p、Sbh1p和Sss1p组成的“经典”转座子外，酵母还表达第二种类型的转座子复合物，由Ssh1p（Sec 61同源物）组成，与Sec61p，Sbh2p和Sss1p具有约30%的同源性(芬克等。, 1996)。Sec61p的某些突变影响我们模型底物的拓扑结构，这一事实表明Sec61p参与了它们的膜整合。然而，不能排除的是，在某种程度上，底物也利用了Ssh1p转座子，这可能与我们的诊断结构具有不同的属性。因此可以想象，Sec61p突变影响底物蛋白的拓扑结构，不是通过改变Sec61p复合体中的局部电位，而是通过改变Sec61和Ssh1p转座子的使用比率。为了测试这种可能性，在缺乏Ssh1p的细胞中测量Sec61p突变R67E、R74E、E382R和R67E/R74E/E382R对40[Leu16]（+5）CPY和40[Leu 16]（+7）CPY拓扑的影响。如所示图8在没有Ssh1p的情况下，Sec61p突变使拓扑结构向相同的方向移动，并且移动的程度与Ssh1p存在时相似。因此，观察到的效应是对Sec61p易位中的拓扑发生的影响。然而，ΔSSH1细胞的拓扑结构都向C末端易位较少的方向转移。这可能表明Ssh1p转座子整合了恒定比例的底物，从而减少了C末端易位，或者更可能的是，Ssh1p的缺乏间接影响了模型蛋白的取向。事实上，ΔSSH1细胞有明显的生长缺陷，并表现出持续的未折叠蛋白反应(威尔金森等。, 2001).

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Sec61p中突变R67E、R74E和E382R的影响与Ssh1p无关。在缺乏Ssh1p的菌株中测定并量化40[Leu16]（+5）CPY和40[Leu 16]（+7）CPY的插入模式，如图3，A和B绘制了两个独立实验的平均值。为了进行比较，前面图中存在Ssh1p时确定的值用浅灰色条表示。

讨论

统计和实验数据有力地表明，通过跨膜电位的影响和/或直接电荷相互作用，静电力对于正确定位细菌质膜和真核生物内质网膜中的多肽很重要。在原核生物中，跨质膜的电化学电位确实能刺激含负电荷残基的链段的移位，并抑制带正电荷区域的移位(Andersson和von Heijne，1994年)。此外，还发现带负电荷的磷脂可以阻止正电荷跨膜传递(范·克伦彭堡等。, 1997)。阴离子脂质含量的降低大肠杆菌从25%到<10%，通过抑制磷脂酰甘油磷酸合成酶的表达，有利于先导肽酶诊断变体中的N末端正电荷移位，而不影响膜电位或SecA功能。这一发现表明，正电荷与膜细胞溶质表面的酸性脂质相互作用，并被保留在那里，从而使信号/跨膜段的低阳性端移位。

在真核细胞中，内质网膜上没有一般电位。我们最近对具有22个亮氨酸疏水核的N末端信号锚的研究表明，信号最初插入N外显（exo）/C类细胞周期方向，然后根据侧翼电荷反转方向(戈德与间谍，2003年)。这一观察结果反对在细胞质表面保留这种信号的更积极的侧翼序列，但表明转座子的局部电位是重新定向的驱动力。

目前的研究表明，Sec61p中的特定带电残基根据正内部规则对信号定向有贡献。这一结论基于Sec61p中的选择性电荷突变对诊断模型蛋白取向的影响。R67、R74或E382的突变减弱了电荷规则，减少了负电荷差Δ（C-N）的信号锚蛋白的C末端易位，而正电荷差的信号锚蛋白质的C末端易位增加。这些对具有相反电荷差的底物的反向效应是一个重要的标准，它可以区分静电对底物的影响与间接、空间位阻信号重新定向和/或多肽移位。事实上，R67、R74或E382的突变导致了轻微的易位缺陷，这些缺陷叠加在静电效应上，甚至对电荷差异较小的底物（例如40[Leu16]（+3）CPY）也会将其掩盖。

与信号序列侧翼电荷相互作用的转座子带电残基预计位于靠近转座子信号结合位点的腔端和细胞质端。R67和R74定位于跨膜结构域2之前的Sec61p第一腔环，E382位于跨膜结构区8的细胞溶质端(图2)。值得注意的是，跨膜结构域2已经被证明是信号序列结合位点的一部分。交叉链接研究表明，前α-因子的信号序列通过插入跨膜结构域2和7与Sec61复合物结合(普拉斯等。, 1998).

尽管残基R67、R74和E382有助于确定信号序列的方向，但它们显然并不是唯一负责正中规则的。这是显而易见的，因为三重突变体R67E/R74E/E382R是可行的，尽管存在生长缺陷。取消甚至推翻指控规则应该会产生更严重的后果。额外贡献者的候选者是转运蛋白复合物的其他亚基，Sbh1p和Sss1p，以及Sec62p和Sec63p。脂质的作用也是可以想象的。被捕获的新生多肽的信号，其长度刚好足以进入转运子，不仅可以与Sec61p/Sec61α交联，还可以与磷脂交联(马托格里奥等。, 1995;蛾类等。, 1998;普拉斯等。, 1998)。带电脂质接近、甚至不对称地进入转座子的信号结合位点也可能在信号定向中发挥重要作用。

大多数信号序列不如这里分析的序列疏水，因此对作用在它们上的静电力更敏感。不能排除的是，许多与疏水性信号结合位点亲和力较低的信号甚至在与转座子中的结合位点结合之前，可能会对胞浆内质网表面的负电荷作出反应。Sec61p的残基R67、R74和E382对于挽救插入错误方向的信号可能很重要，因此，当突变时，可能只严重影响蛋白质的一个子集。

在最近的一项研究中(Tipper和Harley，2002年)，酵母突变体被筛选出来，导致N的定向效率低下外显（exo）/C类细胞周期信号锚（Ste2p的N末端和第一跨膜段，电荷差为+5）融合到Kex2p蛋白酶和转化酶的裂解位点。在内质网或高尔基体中编码P型ATP酶的两个基因SPF1和内质网金属蛋白酶STE24在突变时可使野生型细胞的转化酶分泌从约3%增加到9-12%。这些基因影响信号定向的机制尚不清楚。据推测，它们可能与ER-Ca有关2+体内平衡或控制内质网膜脂组成。可以想象，在生成积极的内部规则时涉及到几个机制。我们的结果表明，其中之一是转座子蛋白Sec61p本身。

致谢

我们感谢Robbie Loewith博士批判性阅读手稿，感谢E.Hartmann博士、N.Kralli博士、R.Schekman博士、T.Sommer博士和B.Wilkinson博士提供菌株和试剂。这项工作得到了瑞士国家科学基金会31-061579.00的资助。

笔记

文章在印刷前在线发布。Mol.Biol。单元格10.1091/mbc。E03-08-0599。文章和出版日期见www.molbiolcell.org/cgi/doi/10.1091/mbc。E03-08-0599。

所用缩写：CPY，羧肽酶Y；内质网；SRP，信号识别粒子。

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文章来自细胞分子生物学由以下人员提供美国细胞生物学学会