生物化学杂志。2013年4月12日；288(15): 10406–10417.
SAMHD1的四聚体对HIV感染的生物活性和抑制作用是必需的*
,‡ ,‡ ,§¶ ,‡ ,§¶ ,‡ ,‖ ,‖ ,§¶ ,§¶,1和‡¶,2
玛丽亚·德露西亚
这个§结构生物学和
¶宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学医学院匹兹堡HIV蛋白相互作用中心，邮编：15260
詹妮弗·梅伦斯
这个§结构生物学和
¶宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学医学院匹兹堡HIV蛋白相互作用中心，邮编：15260
马尔金·戈尔扎克
‖俄亥俄州克利夫兰凯斯西储医学院药理学44106和
克日什托夫·帕尔琴夫斯基
‖药理学，凯斯西储医学院，俄亥俄州克利夫兰44106和
安吉拉·格罗恩博恩（Angela M.Gronenborn）
这个§结构生物学和
¶宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学医学院匹兹堡HIV蛋白相互作用中心，邮编：15260
金宇安
这个§结构生物学和
¶宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学医学院匹兹堡HIV蛋白相互作用中心，邮编：15260
雅切克·斯科夫朗斯基
从‡分子生物学和微生物学系
¶宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学医学院匹兹堡HIV蛋白相互作用中心，邮编：15260
从‡分子生物学和微生物学系
‖俄亥俄州克利夫兰凯斯西储医学院药理学44106和
这个§结构生物学和
¶宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学医学院匹兹堡HIV蛋白相互作用中心，邮编：15260
2012年12月19日收到；2013年2月16日修订
- 补充资料
补充数据
GUID:1FFB6FB6-7A11-421A-A583-94E1D663E0F2
GUID:763DAC6D-6654-4056-85D7-6F7DB3F46E91
背景：SAMHD1是一种dGTP激活的dNTP酶，在单核细胞和静止T淋巴细胞的反转录步骤中抑制逆转录病毒感染。
结果：dGTP诱导的SAMHD1四聚体与其功能激活相关。
结论：SAMHD1四聚体是这种dNTPase的生物活性形式。
意义：了解SAMHD1功能是如何调节的，对于理解先天免疫和抗病毒免疫非常重要。
关键词：HIV，先天免疫，蛋白质化学，蛋白质复合物，病毒
摘要
SAMHD1是一种dGTP激活的dNTP酶，被认为是先天免疫反应的调节剂。在单核细胞及其分化衍生物以及静止细胞中，SAMHD1强烈抑制HIV-1感染，在较小程度上抑制HIV-2和猴免疫缺陷病毒（SIV），因为它们的病毒相关毒力因子Vpx引导SAMHD1-蛋白酶体降解。在这里，我们结合生物化学和病毒学方法来深入了解人类SAMHD1的功能组织。我们发现催化活性的重组dNTP酶是dGTP诱导的四聚体。化学交联研究表明，SAMHD1四聚体存在于人类单核细胞中，在该四聚体中它能强烈限制HIV-1感染。SAMHD1维持四聚体状态的倾向在体外由其位于催化域外的C末端调节。因此，我们表明，C末端是SAMHD1耗尽dNTP池和抑制U937单核细胞中HIV-1感染的全部能力所必需的。有趣的是，人类SAMHD1 C末端包含一个HIV-2/SIVmac Vpx的对接位点，并且已知其是在正向选择下进化的。这一证据表明，Vpx瞄准了SAMHD1中功能重要的元素。总之，我们的研究结果表明，SAMHD1四聚体是这种dNTPase的生物活性形式，并为SAVHD1的功能组织提供了新的见解。
关键词：HIV、先天免疫、蛋白质化学、蛋白质复合物、病毒
介绍
人类免疫缺陷病毒I型在感染具有关键先天免疫功能的细胞（如单核细胞、树突状细胞和巨噬细胞）方面相对无效，这可能导致对HIV感染的先天反应较差(1——三). 树突状细胞对HIV-1感染基本不起作用(4)以及单核细胞和巨噬细胞，尽管它们易受感染，但不能为HIV-1 cDNA合成提供有利的环境。因此，在进入后的早期步骤中抑制了感染（参见5). 该发现发现由HIV-2和相关猴免疫缺陷病毒（SIV）编码的病毒相关副毒力因子Vpx，三是有效转导树突状细胞和巨噬细胞所必需的，揭示了抑制这些病毒的机制；随后发现，Vpx在限制细胞类型方面也能减轻对HIV-1感染的抑制，这表明这种抑制机制广泛针对灵长类逆转录病毒(6——11). 这些发现共同为确定SAMHD1（无菌α基序域和HD域包含蛋白1）是负责单核细胞衍生细胞系和静止CD4进入后早期抑制HIV/SIV感染的细胞抗病毒因子奠定了基础+淋巴细胞(12——16)。
SAMHD1是一种具有脱氧核糖核苷酸三磷酸三磷酸水解酶（dNTPase）活性的核蛋白。其dNTP酶活性由脱氧鸟苷三磷酸（dGTP）在预测变构位点上的结合刺激(17,18). 该蛋白包含一个保守的N末端无菌α基序（SAM）结构域，该结构域之前有一个核定位信号(19,20)一个催化HD结构域和一个C末端区域，在不同灵长类和脊椎动物物种的SAMHD1蛋白之间存在差异(21,22). 包含催化核心的SAMHD1片段的晶体结构表明该蛋白是二聚体(17). 实验证据支持SAMHD1通过消耗低于病毒逆转录酶有效合成前病毒cDNA所需阈值的dNTP水平来抑制静止细胞中灵长类慢病毒感染的模型(23,24)。
Vpx通过编程使其被蛋白酶体降解来抵消SAMHD1(12,13). 特别是，SIVmac Vpx识别人类SAMHD1 C末端的一个特定决定簇，并将其加载到DCAF1上，DCAF1是CRL4 E3泛素连接酶的底物受体亚单位，导致SAMHD1-多泛素化和蛋白酶体降解(21). 这种一般机制似乎是保守的，因为来自广泛灵长类慢病毒谱系的不同Vpx和Vpx样蛋白具有从同源灵长类宿主物种中耗尽SAMHD1蛋白的能力(22,25)。
SAMHD1基因座的功能缺失突变与一种名为Aicardi-Goutieres综合征（AGS）的自身免疫性疾病有关(26,27). AGS是一种罕见的遗传性炎症性疾病，其临床和免疫学特征类似于先天性病毒感染(28,29). AGS是由SAMHD1公司以及编码细胞3′-5′核酸外切酶TREX1和RNaseH2复合物亚基的其他四个位点。人们认为AGS蛋白可以防止对自身核酸的先天免疫反应的不当触发(29——31)通过SAMHD1阻止细胞核酸代谢的死产物的合成，或通过TREX1和RNaseH2处理它们。为此，SAMHD1耗尽终末分化非分裂天然免疫细胞中的dNTP池，从而确保内源性、非经典、潜在免疫刺激核酸不会在具有活性天然核酸传感和效应系统的细胞中合成。
SAMHD1位于中央HD结构域，其催化活性对于其抑制单核细胞中HIV感染的能力至关重要(13). 以前的研究提供了证据，证明SAMHD1抑制HIV感染既不需要保守的SAM结构域也不需要SAMHD11核定位(19,20). 然而，对于其他SAMHD1结构域与有效抗病毒和细胞/先天免疫功能的额外要求之间的相互关系知之甚少。为了解决这些问题，我们启动了人类SAMHD1蛋白的结构-功能和生化研究。有趣的是，我们的研究表明SAMHD1寡聚并形成四聚体，揭示了SAMHD1-四聚体由催化核心结构域两侧的元素调节，并将四聚体状态与SAVHD1催化和抗病毒活性联系起来。
实验程序
哺乳动物表达结构与病毒
使用标准技术构建人SAMHD1缺失和点突变体，并将其亚克隆到pCG质粒中(32)编码N末端Myc、HA或FLAG表位标签和/或进入MSCV（puro）逆转录病毒载体。从瞬时转染的HEK 293T细胞中产生水泡性口炎病毒糖蛋白假型MSCV（puro）病毒颗粒(33). 如前所述，制备了负载Vpx的SIV病毒样颗粒(5,12). 单周期HIV-1荧光素酶报告子构建HIV-1 NL4–3-Luc-R−E类−由N.Landau建造(34)由Tom Hope和David McDonald提供。
SAMHD1限制性分析
U937电池（2×105)用表达野生型或突变型表位标记SAMHD1的MSCV（puro）逆转录病毒载体转导。感染后第三天，将细胞置于24孔板中，加入100 ng/ml佛波醇12-肉豆蔻酸13-醋酸盐（PMA），以开始向巨噬细胞分化。两天后，细胞在新鲜培养基中休息一天，然后用单周期HIV-1 NL4–3-Luc-R进行挑战−E类−表达荧光素酶报告子，单独或联合感染携带Vpx的SIV病毒样颗粒。48小时后，用荧光素酶测定系统（Promega）定量荧光素酶活性。
dNTP的LC-MS定量
从PMA分化的U937细胞（5×10）中提取dNTP5)并在70°C的真空下蒸发(17). 将干燥材料重新悬浮在100μl H中2O、 与…混合[13C类15N] dNTP标准，并使用安捷伦科技1100系列HPLC系统（安捷伦技术，加利福尼亚州圣克拉拉）与配备电喷雾电离源的LXQ线性离子阱质谱仪（马萨诸塞州沃尔瑟姆的Thermo Scientific）接口进行分析。在Hypersil GOLD-C18色谱柱上实现了dNTPs的高效液相色谱分离，该色谱柱的粒度为100×1 mm，3μm（Thermo Electron，Waltham，MA），乙腈的线性梯度（0–60%）为20 m米含3m的碳酸氢铵水溶液米己胺，pH 9.2。梯度以0.2 ml/min的流速在15分钟内形成(35). 质谱仪在正电离模式下运行。为了获得适当的灵敏度，在相应的流动相中使用dATP和流速来调节仪器参数。使用593.0[MH+101己胺]在选定的离子监测模式下记录dATP的离子强度+
米/z（z）值，对应于dATP-己胺加合物。根据添加的同位素标记内标物的参考峰对分析物进行定量(13C类1015N个5]dATP，米/z（z）=607.1[MH+101己胺]+; Sigma-Aldrich）。在2–400 n的浓度范围内，使用分析物的离子强度面积与内标面积的比率计算分析物/内标离子对的校正系数米。
西方印迹法
用SDS-PAGE分离细胞提取物并转移到PVDF膜上进行免疫印迹。用HA、FLAG或Myc表位标签特异性单克隆抗体检测蛋白质，用小鼠或兔免疫球蛋白G Fc片段特异性HRP偶联抗体（1:5000；Jackson ImmunoResearch Laboratories）和增强化学发光（Amersham Biosciences）检测免疫复合物或通过小鼠或兔免疫球蛋白G的荧光抗体（Kirkegaard和Perry实验室）和Odyssey红外成像仪（Licor）发现。
甲醛交联与免疫沉淀
表达HA-FLAG-AU1-（hfa-）标记的SAMHD1的U937细胞在培养基（RPMI 1640培养基，10%胎牛血清）中存在指定浓度的甲醛的情况下，在37°C下孵育10分钟。通过添加最终浓度为0.125的甘氨酸来终止交联米用冷PBS清洗细胞，并用RIPA缓冲液（10 m米Tris-HCl，pH 8.0，1%Triton X-100，0.1%SDS，0.5%脱氧胆酸钠，1 m米EDTA，140米米含有蛋白酶抑制剂（罗氏应用科学）的NaCl，SAMHD1通过HA和FLAG表位标签通过两种顺序免疫沉淀进行免疫亲和纯化，然后分别用表位肽进行竞争洗脱(36). 将样品在75°C下培养60分钟，在SDS样品缓冲液中，部分逆转了从U937细胞纯化的SAMHD1复合物的交联。
大肠杆菌SAMHD1的表达与纯化
编码野生型和突变型SAMHD1蛋白的cDNA通过His克隆到pET28载体（EMD4Biosciences）中6N端的标签，单位为大肠杆菌Rosetta 2（DE3）在Luria-Bertani培养基中用0.4 m培养米异丙基β-d日-硫代吡喃半乳糖苷，用于在18°C下诱导16 h，并按照前面所述进行纯化(21). 四个独立SAMHD1批次的SAMHD1-dNTPase比活性的平均变化为±5%。
蛋白质复合物的分析尺寸排除柱色谱
100μl纯化蛋白质或蛋白质混合物（10μl米)dGTP的指示浓度为20 m米Tris-HCl，pH 7.8，含50m米氯化钠，1米米氯化钙2，1米米将DTT、5%甘油和0.02%叠氮化钠注入24-ml Superdex 200分析柱（1×30 cm；GE Healthcare）中，并在同一缓冲液中以0.8 ml/min的流速分离，无还原剂。记录在UV280下的吸光度，收集0.5 ml峰馏分并分析dNTPase活性。或者，在250 n下100μl蛋白质米与dGTP在指定浓度（0–200μ米)注入Superdex 200分析柱中，用pH 7.8、50 m的Tris-HCl平衡米氯化钠、5%甘油和0.02%叠氮化钠。通过监测282 nm激发和313 nm发射的荧光迹线来记录洗脱谱。
多角度光散射（MALS）
使用Superdex 200分析柱和在线多角度光散射（HELEOS；怀亚特技术）、可变波长UV（安捷伦1100系列；安捷伦技术）和折射率（Optilab rEX；怀亚德技术）检测器测定蛋白质或蛋白质复合物的分子质量。通常，将100μl 2 mg/ml的蛋白质溶液注入20 m平衡的色谱柱中米Tris-HCl缓冲液，pH 7.8，含50 m米氯化钠，1米米氯化钙2和0.02%叠氮化钠，室温下流速为0.5 ml/min。在柱色谱之前，如图所示，将蛋白质与dGTP在含有1mL的相同缓冲液中孵育米DTT公司。ASTRA程序（5.3.4版；怀亚特技术）用于光散射数据分析。
SAMHD1 dGTP依赖性dNTPase检测和甲醛交联
dNTPase分析在含有10 m的反应缓冲液中进行米三氯化氢，pH 7.5，50 m米氯化钠，5米米氯化镁2，适当的dNTP各为100μ米，和56 n米（28 pmol）重组SAMHD1，25°C。在不同时间点收集的等分样品被稀释成9体积的冰镇PBS以停止反应，并在14000×克使用Eclipse XDB-C18 4.6-×150mm色谱柱（安捷伦）通过HPLC分析脱蛋白样品。柱在0.1内平衡米千赫2人事军官4，10米米四丁基溴化铵，pH 6.5（溶剂A）。用0–7.5%乙腈在溶剂a中的线性梯度洗脱注入的样品，洗脱时间为30分钟，然后用7.5%的乙腈在溶液a中洗脱20分钟，流速为1 ml/min。或者，脱氧核糖核酸和dNTP在CapCell Pak C18 4.6×250-mm柱（Phenomenex）上分离，用10 m预平衡米磷酸铵、pH 7.8和4.8%甲醇。然后用4.8–19.2%甲醇的线性梯度在22.5 min内以1.5 ml/min的流速洗脱。底物和产物的数量通过260 nm处记录的吸光度数据的峰值积分进行量化。对于化学交联实验，在没有或存在指示的dGTP浓度的情况下组装反应，并在冰上预培养30分钟，用等量的2%甲醛溶液在PBS中稀释至最终浓度1%，然后在室温下培养15分钟。用0.25淬灭交联反应米甘氨酸在室温下放置15分钟，通过SDS-PAGE进行解析，通过银染显示SAMHD1。
结果
位于催化HD结构域外的SAMHD1区域调节HIV-1感染抑制
SAMHD1具有一个保守的N末端SAM结构域、一个HD-dNTP三磷酸水解酶结构域，该结构域包含变构激活剂的结合位点、dGTP和催化位点，以及一个在不同脊椎动物物种的SAVHD1蛋白中高度分化的C末端区域(A类). 而功能性HD结构域对于SAMHD1在非分裂细胞中抑制灵长类慢病毒感染的能力至关重要(13)，其他SAMHD1域的角色尚未确立。为了解决其重要性，我们构建了一组人类SAMHD1缺失突变体，如A类，并量化其在U937单核细胞中抑制HIV-1感染的能力。
位于催化域外的SAMHD1突变调节其抑制HIV-1感染的能力。
A类，人类SAMHD1蛋白（626个残基）的示意图。SAM结构域、变构dGTP效应器结合位点（dGTP）、HD/COG1078磷酸水解酶结构域（HD）和发散C末端的位置(C术语)显示了SIVmac/HIV-2 Vpx的目标。B类，SAMHD1蛋白变体在U937细胞中的表达。用于荧光素酶测定的细胞提取物的等分试样，如C类通过其N末端表位标签和α-微管蛋白（α-浴缸)，作为加载控件。用空MSCV puro载体转导的U937细胞(M（M）)作为阴性对照。荧光信号用奥德赛红外成像系统定量。C类，SAMHD1突变对其抑制HIV-1感染能力的影响。在剂量反应实验中，通过逆转录病毒转导多种感染在U937细胞中表达野生型和突变型SAMHD1蛋白。将转导的细胞诱导分化为巨噬细胞，然后用携带荧光素酶报告基因的单周期水疱性口炎病毒糖蛋白假型HIV-1对其进行攻击(黑色条)或存在(灰色条)携带Vpx的SIV类病毒颗粒(4,12)三口井。2天后对细胞提取物中的萤光素酶活性进行定量，并以任意单位显示，误差条为±1σ。D类，HD域外的突变调节SAMHD1的效力。散点图显示荧光素酶报告活性（来自C类)作为SAMHD1变异蛋白表达水平的函数(B类)归一化为野生型蛋白质。
通过逆转录病毒转导在U937细胞中表达野生型和突变型SAMHD1蛋白，其N端标记有串联HA、FLAG和AU1表位（hfa表位标记）。在一系列多重感染中进行感染，以研究SAMHD1在广泛SAMHD1表达水平上的限制(B类). SAMHD1转导三天后，将U937细胞暴露于PMA诱导其向巨噬细胞分化，然后用单周期水疱性口炎病毒糖蛋白假型HIV-1报告病毒攻击，该病毒携带荧光素酶报告基因nef（奈夫）轨迹(34). 如所示C类(左侧面板)野生型SAMHD1（1–626）能有效抑制HIV-1感染，与对照组未转导的U937细胞的荧光素酶活性相比，表达最高水平SAVHD1的U937-细胞中的荧光素酶报告活性降低了100倍以上。荧光素酶活性随SAMHD1水平变化的散点图(D类)清楚地说明了抑制作用的剂量依赖性。为了证实细胞的低效感染反映了SAMHD1介导的抑制作用，将细胞暴露于装有Vpx的SIV病毒样颗粒中，Vpx可使SAVHD1进行蛋白酶体降解(12——14). 这种治疗在很大程度上缓解了抑制作用(C类)从而证实其确实由SAMHD1介导。
位于催化域外的几个序列似乎对SAMHD1限制HIV-1感染的能力进行了积极或消极的调节(D类). SAMHD1 C末端缺失变异体SAMHD1（1-595）的效果最为显著，该变异体无法有效抑制HIV-1感染(D类)，即使表达水平与全长SAMHD1抑制HIV-1感染的水平相似，也超过100倍。相反，C末端缺失较小的变异SAMHD1（1-617）能够有效限制HIV-1感染。值得注意的是，两个C端的删除都破坏了SAMHD1上的Vpx对接站点(21)从而使这些突变蛋白抵抗Vpx的消耗。这解释了SAMHD1（1-617）变异体抑制作用明显缺乏Vpx介导的缓解。有趣的是，N末端的缺失，移除SAMHD1（113–626）中保守的SAM结构域，导致SAMHD11抑制HIV-1感染的能力轻微但可复制的增强，Vpx缓解了这种增强，这与之前的报告一致，即该突变是HIV-2/SIVmac Vpx降解的靶点，尽管效率低于全长SAMHD1(19——21,37). 在脊椎动物SAMHD1蛋白的不同C末端存在一个保守的疏水基序（亮氨酸620和苯丙氨酸621）的双丙氨酸取代后，SAMHD11的抗HIV活性也表现出类似的增强（参见补充图1C类参考文献中。22). 该变异体SAMHD1（LF620AA）对HIV-1的抑制作用持续且略有增强，而SAMHD11（VQ618AA）中先前的非共有氨基酸残基缬氨酸618和谷氨酰胺619的丙氨酸替代没有这种作用。后一种点突变来自SAMHD1 C末端的丙氨酸扫描筛查，用于调节HIV-1感染抑制的突变（数据未显示）。综上所述，上述观察结果表明，位于催化结构域之外且未知直接参与dNTP水解的SAMHD1序列调节SAMHD1-抑制HIV-1感染的能力，并提出了它们如何发挥控制作用的问题。
SAMHD1 C末端对dNTP磷酸水解酶体外活性不重要
SAMHD1被认为通过耗尽非分裂细胞中的dNTP池以抑制HIV-1感染，其水平过低，不利于病毒逆转录酶合成前病毒cDNA(23,24). 因此，SAMHD1 C末端序列在HIV-1抑制中的需求以及其他序列对抑制的增强()促使我们探索这些中的任何一个，特别是SAMHD1 C末端，是否在调节dNTPase活性中发挥作用。
我们首先研究SAMHD1的选择性突变对其dNTP三磷酸水解酶活性的影响在体外，使用表达于大肠杆菌野生型和突变型SAMHD1蛋白，纯化至接近同质性(A类)用dATP、dGTP、dCTP和TTP的混合物孵育，然后用HPLC定量反应的脱氧核苷产物。如所示B类，全长SAMHD1蛋白对dGTP>dCTP>dATP/TTP的单个dNTP底物表现出明显的偏好，与以前的报道一致(17,18). 值得注意的是，SAMHD1（1-595）突变体的dNTPase活性与全长SAMHD1（1-626）的dNTPase活性相似，表明在该测定条件下，SAMHD1催化不需要C末端(C类). 有趣的是，C末端的LF620AA取代导致dNTP水解率增加50%，包括SAM结构域在内的N末端区域的缺失也导致了dNTP的水解率增加(C类)这表明后一种元素可以调节SAMHD1催化活性，这与我们的发现一致，即这些相同的突变增强了HIV-1对HIV-1感染的抑制。此外，SAMHD1蛋白在预测的变构dGTP效应物结合位点（D137A）或催化中心（HD206DN）含有氨基酸替换(17)没有显示任何催化活性，因此验证了该分析。尽管存在一些实验可变性（高达20–30%），但这些发现通过几个独立执行的分析得到了证实（数据未显示）。值得注意的是，这些突变都没有影响底物偏好的顺序(B类)与它们远离底物结合/活性位点的位置一致。
体外重组SAMHD1蛋白的dNTPase活性。
A类在Novex 4–12%Bis-Tris梯度凝胶上分离出150-ng的SAMHD1蛋白变体小份，以及一系列2倍稀释的全长SAMHD1标准品（1–626（2x）；300、150和75 ng），并通过银染色显示。B类，突变不会改变SAMHD1对dNTP底物的偏好。含有野生型（1-626）或指示突变SAMHD1蛋白和100μ米每个dATP、dGTP、dCTP和TTP在5 m米氯化镁220分钟和脱氧核苷(德国)反应产物用HPLC定量。显示了两次实验中三份样品在每次反应中产生的dA、dG、dT和dC的平均量±标准误差，用脱氧核糖核酸/SAMHD1（mol/mol）表示。C类野生型和突变SAMHD1蛋白依赖dGTP的dATP酶活性。SAMHD1蛋白与dGTP、dATP、dCTP和TTP孵育指定时间，并显示每个指定时间产生的dA量。三份样品的标准误差小于5%，通常小于所示值的2%。
SAMHD1 C终端对于体内耗尽dNTP水平的全容量至关重要
接下来，我们询问SAMHD1 C末端是否需要有效耗尽dNTPs体内在分化的U937细胞中。使用了与上述SAMHD1限制能力测定类似的实验方法(). 具体而言，野生型和突变型SAMHD1蛋白通过逆转录病毒转导在适当的感染倍数下在U937细胞中表达到不同水平，然后通过暴露于PMA诱导分化。三天后，收集细胞，通过LC-MS和SAMHD1结合水平通过Western blotting对dNTP池进行定量。LC-MS分析允许检测dATP池，但灵敏度不足以准确定量表达SAMHD1分化U937巨噬细胞中的dGTP、dCTP和TTP水平（数据未显示）。因为SAMHD1对dNTP底物的固有偏好未被任何测试突变改变(B类)，我们使用dATP水平作为SAMHD1活动的读数体内全长SAMHD1蛋白以及每种变异体SAVHD1蛋白的表达导致dATP水平的剂量依赖性降低，降低幅度高达～100倍(). 散点图显示细胞dATP池大小作为SAMHD1表达水平的函数，如所示面板C，揭示了大多数分析的突变并没有可检测地削弱SAMHD1消耗细胞dATP的能力，这与我们之前的发现一致，即它们保留了完全抑制HIV-1感染的能力。一个显著的例外是SAMHD1（1-595）变异体，其消耗U937细胞dATP水平的能力似乎降低。特别是，与野生型和其他经测试的突变型SAMHD1相比，这种变体的水平要高得多，才能将dATP水平消耗到相同的程度。这一发现揭示了C末端促进SAMHD1对dNTP水平的耗竭体内并初步解释了为什么SAMHD1变异体在保护细胞免受HIV-1感染方面无效()。
有效耗尽dATP需要SAMHD1 C终端体内。
A类,体内突变SAMHD1蛋白的活性。在一定水平上表达SAMHD1野生型或变体的U937细胞被诱导分化为巨噬细胞，3天后通过LC-MS测定dATP池。平均dATP水平/106对于每个SAMHD1变体，显示了三个代表性实验中三份样品的细胞±标准误差。α-浴缸，α-微管蛋白。这个垂直线在中中间面板指示此螺栓的两部分连接的位置。B类U937细胞中SAMHD1水平。用于测定dATP的SAMHD1-表达U937细胞提取物等分A类通过其N末端表位标签和α-微管蛋白对SAMHD1进行免疫印迹，作为负荷对照。使用奥德赛红外成像系统量化荧光信号。M（M），对照用空MSCV载体转导的U937细胞。C类,体内突变SAMHD1蛋白的效力。对于每个SAMHD1变体，dATP的量以pmol/10表示6单元格（来自A类)，绘制为SAMHD1表达水平的函数（从B类)，归一化为野生型SAMHD1。
预测变构位点上的dGTP结合诱导SAMHD1四聚反应
先前对人类SAMHD1片段（残基120–626）的结构和生物化学研究表明，全长SAMHD1的催化活性形式是通过dGTP结合进行变构激活的二聚体(17). SAMHD1 C末端的作用尚不清楚，因为该区域未在晶体结构中解析。我们推测，C末端突变可能影响SAMHD1（1-595）自我交互的某些可能微妙的方面，从而干扰其功能体内为了解决这种可能性，我们首先使用SEC-MALS评估了重组全长SAMHD1在存在或不存在dGTP的情况下的四级状态。在没有dGTP的情况下，SAMHD1以单峰洗脱(A类,红色轨迹). MALS估计主峰洗脱蛋白质的平均分子量为～110 kDa。因为含有N末端His的重组SAMHD1单体的质量6tag和短连接体的计算值为75 kDa，据报道，SAMHD1（残基120–626）在没有dGTP的情况下以二聚体的形式结晶(17)，该峰可能代表SAMHD1单体（75kDa）和二聚体（150kDa。引人注目的是，预培养30μ米dGTP导致更复杂的洗脱曲线。尽管大多数SAMHD1（~70-80%）以预期的SAMHD1单体和二聚体的体积洗脱，但剩余的蛋白质洗脱得明显更早（11.1 ml；A类,绿色痕迹). 在60μ米dGTP公司(A类,蓝色痕迹)除在dGTP诱导的峰早期有较大比例的SAMHD1被洗脱外，导致了类似的洗脱曲线。重要的是，用4 m预培养米dGTP基本上将所有SAMHD1转移到早期洗脱峰，因此表明绝大多数蛋白质能够形成这些大的dGTP诱导的复合物(补充图S1). MALS估计该峰蛋白质的分子量为300kDa，表明dGTP诱导SAMHD1四聚体。
dGTP诱导SAMHD1四聚反应。
A类，SEC-MALS对重组SAMHD1四元态的表征。SAMHD1（25μ米)独自一人(红色痕迹)以0.5ml/min的流速注入分析凝胶过滤柱中，在280nm处记录吸光度迹线。吸光度(右y轴)和MALS分子质量分布(左y轴)显示了整个洗脱体积。MALS估计，12.6至14.2 ml之间洗脱物的平均分子量为110 kDa。值得注意的是，SAMHD1的计算分子质量为75 kDa。SAMHD1与两种不同浓度dGTP（30μ米,绿色痕迹; 和60μ米,蓝色痕迹)SEC-MALS也进行了分析。MALS估计的四聚SAMHD1物种（300kDa）和二聚和单体蛋白质物种混合物（110-120kDa箭头所示。B类，化学交联dGTP诱导的SAMHD1低聚物的SDS-PAGE图谱。预测的dGTP-结合变构位点（D137A）或催化中心（HD206RN）发生突变的重组野生型和变异SAMHD1蛋白(17)如图所示，在反应缓冲液中与dGTP预孵育，化学交联，并在4-12%Novex凝胶上分离，通过银染色观察蛋白质。HiMark蛋白标准中SAMHD1低聚物对应的蛋白带位置和蛋白质分子量(M（M）)显示。
为了证实SEC-MALS分析的结果，进行了甲醛交联实验，并通过SDS-PAGE分析了交联蛋白。如所示B类，在没有dGTP的情况下交联的重组SAMHD1作为单体迁移，少量迁移带可能对应于SAMHD1-二聚体。相反，在dGTP存在下进行的交联导致低聚物形成阶梯状结构，达到四聚体，但不是更高的低聚物，其表观迁移率与SEC-MALS数据大致一致。值得注意的是，由于交联效率低，SAMHD1四聚体含量可能被低估，因为甲醛浓度增加导致SAMHD1-低聚物产量增加（数据未显示；另请参阅A类). 为了证实SAMHD1四聚确实需要dGTP与变构位点结合，对在预测的变构dGTP效应结合位点（D137A）或作为对照的催化中心（HD206DN）具有氨基酸取代的SAMHD1蛋白进行了类似的分析(17). 变构dGTP结合位点的破坏在很大程度上破坏了dGTP诱导的SAMHD1齐聚，而催化位点的突变没有这种影响(B类). 我们得出结论，全长SAMHD1齐聚物以依赖dGTP的方式形成四聚体在体外。
完整细胞中的SAMHD1低聚物。
A类，SAMHD1是完整U937细胞中的寡聚物。表达表位标记的hfa-SAMHD1的U937细胞被交联(C类)甲醛达到指定浓度(传真%). 用SDS-PAGE分离添加凝胶负载缓冲液的细胞提取物的等分样品，并用FLAG-M2抗体在SAMHD1的N末端与FLAG标签反应进行印迹。将样本子集在90°C下加热20分钟，以部分逆转交联(R（右）)在分离和吸干之前。显示了与单体和迁移较慢的SAMHD1交联形式相对应的带。B类，表征从U937细胞纯化的交联SAMHD1形式。hfa标记的SAMHD1通过HA和FLAG标记的两种连续免疫沉淀从与0.1或0.2%甲醛交联的U937细胞中纯化。交叉链部分颠倒(R（右）;车道5和6)或者不是(C类;车道2–4)，并且蛋白质按照描述进行分解A类以上。来自不表达SAMHD1的U937细胞的模拟免疫沉淀用作阴性对照(车道2). 与甲醛交联的重组SAMHD1蛋白(车道7和8)或缺席(9号车道)作为对照，dGTP被并行解析。显示了Mark12蛋白质标准（M）中蛋白质的分子量。银染显示蛋白质条带。
SAMHD1在完整细胞中是体内寡聚物
接下来，我们测试了SAMHD1四聚体/低聚物是否可以通过在完整细胞中进行化学交联，在更生理的环境中检测到。表达hfa标记的SAMHD1蛋白的U937细胞与浓度增加的甲醛交联。将由交联细胞制备的细胞裂解物在90°C下加热，以部分逆转交联，或未经处理，通过SDS-PAGE进行解析，并用抗FLAG抗体对SAMHD1进行免疫印迹。交联导致FLAG抗体反应物质迁移较慢(A类)提示SAMHD1参与高分子量蛋白质复合物。令人惊讶的是，交联的部分逆转揭示了一组离散的高分子量条带与抗FLAG抗体反应，这让人想起重组SAMHD1交联时dGTP诱导的低聚物。
为了证实在交联细胞中检测到的缓慢迁移的SAMHD1形式确实是SAVHD1低聚物，通过FLAG和HA表位标签通过两种顺序免疫沉淀从甲醛交联的U937细胞中纯化SAMHD1-复合物(36)用SDS-PAGE与交联重组SAMHD1低聚物并排分离，用银染法观察蛋白质。可以清楚地看到B类U937和重组大肠杆菌纯化的SAMHD1复合物显示出类似的电泳迁移模式。这些模式之间的微小差异可能反映了不同的交联密度，因为部分交联逆转导致U937细胞衍生SAMHD1复合物的迁移稍快(B类，比较车道3和4具有车道5和6). 我们得出结论，SAMHD1低聚物（包括四聚体）是SAMHD11的主要形式体内。
SAMHD1四聚体是具有催化活性的dNTP磷酸水解酶
D137A突变预计会破坏变构位点的dGTP结合(17)消除了dGTP诱导的SAMHD1催化活性活化和四聚反应。有趣的是，EF1143是一种细菌HD域dNTP酶，是一种四聚体(38). 因此，我们推断全长SAMHD1四聚体可能是该dNTPase的催化活性形式。为了仔细检查，重组SAMHD1与dGTP（30μ米)如上所述诱导四聚体形成。接下来，通过尺寸排除柱色谱对反应进行分级，并在dATP、dCTP和TTP的混合物上分析SAMHD1混合馏分（对应于四聚体或二聚体/单体）中的dNTPase活性(,A–C). 根据SEC-MALS数据确定了四聚体和二聚体/单体部分的范围(A类). MALS数据表明，10.5–11.0-ml馏分应含有SAMHD1四聚体，且不含二聚体/单体，而13.25–13.75-ml馏分主要包含二聚体和单体(A类). dNTP水解仅在含有SAMHD1四聚体的组分中观察到(,B类和C类). 引人注目的是，至少在反应的前20分钟内，水解速度保持不变(C） ●●●●。由于反应中变构dGTP激活剂的唯一来源是与SAMHD1结合的dGTP，因此该观察结果表明，dGTP从变构位点分离的速度较慢，或者四聚体中变构位点之间的核苷酸交换较慢。重要的是，将dGTP浓度从30μ增加到60μ米在SAMHD1齐聚反应中，导致了较大的含四聚体峰和较大的水解，而不是二聚体/单体峰(,D类和E类). 对照实验表明，二聚体/单体峰中的SAMHD1能够形成四聚体，并对dGTP的添加起酶促作用，从而排除了二聚体或单体形态因错误折叠而缺乏催化活性的可能性(补充图S1和S2). 此外，在不存在dGTP的情况下，分离的四聚体转化回二聚体/单体形式。这些结果共同表明，四聚体是SAMHD1 dNTP磷酸水解酶的催化活性形式。
四聚体SAMHD1是催化活性dNTPase。
A类和D类，重组SAMHD1（10μ米)用30μ米(A类)或60μ米(D类)dGTP，并以0.8 ml/min的流速通过尺寸排除色谱分离。洗脱曲线(A类280纳米)图中显示了SAMHD1四聚体和二聚体/单体峰的位置。四聚体对应的混合分数(位置1和三; 洗脱体积10.5–11.0 ml）和二聚体/单体混合物(位置2和4; 洗脱体积13.25–13.75 ml）的峰汇集并分析dNTPase活性，如B类和E类和中C类和F类分别是。B类,C类,E类、和F类，将等体积等分试样（300μl）的合并SAMHD1四聚体或单体峰部分与100μ米反应缓冲液中每个dATP、dCTP和TTP的指定时间，以及脱氧核苷(德国)用HPLC定量的反应产物(C类和F类). 值得注意的是，dGTP没有添加到dNTPase分析混合物中。20分钟时间点收集的反应产物分离色谱图如所示B类和E类.在30μ米dGTP和60μ米dGTP如所示B类和C类和中E类和F类分别是。
SAMHD1 C终端稳定四聚体
SAMHD1（1-595）变异体缺乏发散的C末端，在消耗dATP库方面效率相对较低体内()以及U937细胞中HIV-1感染的不良抑制剂(). 为了评估这是否反映了C末端在dGTP诱导的SAMHD1四聚/齐聚中的作用，进行了化学交联和尺寸排除色谱实验。如重组蛋白的甲醛交联所报告的那样，C末端缺失并未检测到SAMHD1（1-595）形成四聚体的固有能力受到损害(A类). 除SAMHD1（113–626）可能例外，研究中的其他突变也没有发生，SAMHD11缺乏N末端SAM结构域，与全长SAMHD10和其他点缺失突变相比，其四聚体减少。
SAMHD1 C末端对SAMHD1-四聚体状态很重要。
A类野生型和指示的突变重组SAMHD1蛋白在有或无dGTP的情况下孵育，化学交联，用SDS-PAGE在4–12%Novex凝胶上分离，并用银染色进行可视化。B类野生型和突变型SAMHD1蛋白（250 n米)用dGTP（200μ米)，并按照“实验程序”中的描述，通过尺寸排除色谱分离混合物。通过监测荧光示踪（mV，282 nm激发，313 nm发射）记录洗脱曲线。SAMHD1四聚体的峰洗脱体积(泰特)和二聚体/单体混合物(双声道/单声道)表示为（ml），与dGTP对应的峰值表示为星号。C类，位于催化HD结构域两侧的SAMHD1区域影响dGTP诱导的四聚体。野生型和突变型重组SAMHD1蛋白（250 n米)在不同浓度（50–200μ米)，并以0.8 ml/min的流速将混合物注入分析凝胶过滤柱中。洗脱曲线（荧光示踪、282 nm激发和313 nm发射）显示了对应于SAMHD1四聚体和单体的峰位。四聚体峰高(纵坐标)绘制为dGTP浓度的函数(横坐标)。
为了更定量地评估SAMHD1四聚反应，进行了尺寸排除色谱实验。允许SAMHD1低聚物在dGTP存在的情况下组装，SAVHD1低聚的程度由SEC评估。值得注意的是，色谱是在柱缓冲液中没有dGTP的情况下进行的；因此，本试验同时测定了初始四聚体组装及其在色谱分离过程中的稳定性。这与化学交联分析相反，在交联反应期间，dGTP持续存在，这可能会减缓四聚体的离解。如所示B类，根据峰洗脱体积，几乎所有测试的SAMHD1变体都观察到了有效的四聚体，与中所示的化学交联实验结果非常一致A类一个显著的例外是SAMHD1（1-595）突变体，在本试验条件下，该突变体主要为单体/二聚体。为了进一步仔细检查和证实这些观察结果，允许SAMHD1低聚物在初始dGTP浓度增加的情况下组装，并通过SEC分析混合物C类，更清楚地揭示了一些突变调节了SAMHD1四聚体的倾向。重要的是，预测的变构位点dGTP结合突变体SAMHD1（D137A）在任何dGTP浓度下都无法形成稳定的四聚体，这与交联结果一致。最值得注意的是，与其他SAMHD1蛋白相比，在所有测试的dGTP浓度下，具有SAMHD1（1-595）变体的四聚体的产量始终非常低。这不太可能是由野生型SAMHD1耗尽dGTP引起的，因为在四聚体组装期间，只有不到2%的dGTP转化为dG（数据未显示）。有趣的是，SAMHD1（113–626）和SAVHD1（LF620AA）变异体的四聚体产量似乎略高于测试的其他SAMHD1-蛋白质的产量，但始终如此。此外，催化失活的SAMHD1（HD206RN）也被四聚到高于野生型SAMHD1的水平。我们得出结论，C末端以及位于催化结构域两侧的其他SAMHD1元素都可以调节SAMHD1-四聚体的组装/稳定性。
讨论
SAMHD1，一种在主要白细胞群中表达的核dNTP酶(12——17)具有双重作用。它是终末分化白细胞中灵长类慢病毒感染的有效抑制剂，并保护先天免疫系统对免疫刺激性核酸（可能是自体核酸）产生免疫反应(12——14,26,27). 这两种操作都需要功能性SAMHD1 dNTPase。先前的研究结果强调了这一点，即许多AGS相关突变破坏了SAMHD1催化活性，并且通过改变HD域催化中心的关键组氨酸和天冬氨酸残基，可以消除对HIV感染的抑制(13,26). SAM结构域的保守性和脊椎动物SAMHD1蛋白中普遍存在的可变C末端结构域表明，它们对其细胞功能很重要。然而，它们在SAMHD1抗病毒作用中的确切作用尚未明确。为了对SAMHD1功能的分子决定因素获得新的见解，我们评估了它的四元态在体外和体内我们提供的证据表明，SAMHD1 dNTP三磷酸水解酶组装成具有催化活性的四聚体，并识别位于HD催化域之外的序列元素，这些序列元素调节其功能。我们的发现揭示了SAMHD1四聚体对其生物活性的重要性。
从我们对变异蛋白的定量并排比较中也可以明显看出，SAMHD1抑制HIV-1感染的能力并不依赖于其细胞内定位，这证实并扩展了先前的观察结果(19,20). 而删除包含核定位信号和SAM结构域的分子的N末端区域会导致SAMHD1在细胞质中定位错误(19,20)，这不会检测到损害其dNTPase或抗病毒活性。SAMHD1抑制作用对其细胞内定位缺乏依赖性可能反映了dNTP从合成位点向慢病毒复制位点的高扩散率。先前的研究发现，HIV-1 cDNA合成速率与感染细胞中的总dNTP水平密切相关，这也与这种可能性相一致(23,24). 总之，这些证据支持SAMHD1通过消耗dNTP池到低于病毒逆转录酶有效发挥作用所需阈值的水平，间接抑制HIV-1感染的模型。
我们的生化和基于细胞的分析揭示了SAMHD1的低聚物状态。在没有dGTP的情况下，我们发现SAMHD1主要是单体和二聚体，并且这两种形式都缺乏可检测的催化活性。这些发现与之前的生化特征和结构研究一致，该研究报告SAMHD1催化核心结晶为二聚体单元(17,18). 我们的物理化学和交联研究也表明，在dGTP存在下，SAMHD1形成四聚体，这是一种活性酶。值得注意的是，交联实验中观察到的SAMHD1三聚体可能来自部分交联的四聚体，因此缺乏生理相关性。
然而，在之前的一份报告中，使用两个催化活性SAMHD1片段（位置120–626和26–583）通过分析超速离心法未检测到SAVHD1四聚体(17)，我们的发现与之前的观察结果并不矛盾。SAMHD1（23–583）缺少C末端，因此与我们发现在dGTP存在下无法形成稳定四聚体的SAMHD1（1–595）相似(). 一种可能性是SAMHD1（23-585）片段可以形成四聚体，但它们是不稳定的，与本研究中描述的SAVHD1（1-595）变体类似。这将解释SAMHD1（23–585）片段如何具有催化活性，但在长时间的分析超速离心分析中，由于dGTP耗尽时四聚体分离，似乎主要是二聚体。在没有dGTP的情况下，SAMHD1（120–626）的四元态被确定为平衡状态下的单体和二聚体，这再次与我们的观察一致，即四聚体的形成仅由dGTP结合诱导。
我们对完整细胞进行的SAMHD1交联研究结果证实了上述发现，如他们清楚地记录了离散的高阶SAMHD1复合物的存在，这些复合物可以被纯化，并且可以在SDS-PAGE中观察到与重组SAMHD1-低聚物结合。值得注意的是，在活跃增殖和PMA分化的U937细胞中也检测到类似水平的复合物，即，在限制性和非限制性条件下（数据未显示）。总之，我们的发现表明SAMHD1四聚体是酶的催化活性形式，并且这种形式普遍存在体内SAMHD1对HIV感染施加屏障的细胞类型。
现有证据表明以下模型适用于SAMHD1分子的功能组织。中心位置的HD结构域介导依赖dGTP的SAMHD1四聚反应，这与先前对SAMHD1-催化核心的结构分析结果一致(17). 蛋白质的远端区域调节SAMHD1功能。特别地，包括核定位信号和SAM结构域的N-末端区域可能用于将催化结构域定位到特定的细胞隔室和过程。它的保守性表明，分区对细胞SAMHD1功能的执行很重要，尽管它对其抗病毒作用是不可或缺的。催化结构域远端的C末端通过调节四聚作用影响SAMHD1功能。虽然目前尚不清楚潜在的分子机制，但我们的数据表明C末端对维持SAMHD1四聚体状态很重要在体外以及耗尽dNTP水平的全部容量体内。
SAMHD1 C末端的另一个关键作用是调节与病毒调节器的相互作用。该区域包含HIV-2和灵长类慢病毒相关株的Vpx副毒力因子的对接位点(21). Vpx绑定到此站点以将SAMHD1加载到CRL4DCAF1公司E3泛素连接酶，从而为蛋白酶体降解编程(22,23). 由于C末端突变调节SAMHD1功能，因此与C末端结合的Vpx可能也会通过改变其四聚体状态来影响SAVHD1催化活性。很有意思的是，该域是否能从控制细胞dNTP水平的上游病毒和/或细胞调节器接收输入，并将其转化为SAMHD1催化活性。
致谢
我们感谢特蕾莎·布罗森尼奇（Teresa Brosenitsch）和迈克尔·格林伯格（Michael Greenberg）对手稿的批判性阅读和编辑帮助。
*这项工作得到了美国国立卫生研究院AI077459和AI100673（发给J.S.）、P50GM082251（发给A.M.G.、J.A.和J.S.）以及CWRU/UH艾滋病研究中心P30AI036219的全部或部分支持。
本文包含补充图S1和S2。
三使用的缩写如下：
- SIV公司
- 猴免疫缺陷病毒
- 山姆
- 不育α基序
- AGS公司
- Aicardi-Goutieres综合征
- 项目管理局
- 佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯
- 秒
- 尺寸排除色谱法
- MALS公司
- 多角度光散射
- HD-域
- 含有组氨酸天冬氨酸基序的结构域。
参考文献
1Manel N.、Hogstad B.、Wang Y.、Levy D.E.、Unutmaz D.、Littman D.R.（2010）HIV-1的神秘传感器激活树突状细胞中的抗病毒先天免疫。自然
467, 214–217[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 2Sunseri N.、O'Brien M.、Bhardwaj N.、Landau N.R.（2011）经修饰包装猿猴免疫缺陷病毒Vpx的人类免疫缺陷病毒1型可有效感染巨噬细胞和树突状细胞。J.维罗尔。
85, 6263–6274[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 4Nègre D.、Mangeot P.E.、Duisit G.、Blanchard S.、Vidalain P.O.、Leisner P.、Winter A.-J.、Rabourdin-Combe C.、Mehtali M.、Moullier P.、Darlix J.-L.、Cosset F.-L.（2000）高效转染成熟人类树突状细胞的猴免疫缺陷病毒（SIVmac251）衍生的新型安全慢病毒载体的特性。基因疗法。
7, 1613–1623 [公共医学][谷歌学者] 5Bergamaschi A.、Pancino G.（2010年）宿主对单核细胞和巨噬细胞HIV-1复制的阻碍。逆转录病毒学
7，31。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 6于晓峰，于庆中，埃塞克斯M.，李T.H.（1991）这个虚拟专用交换机猴免疫缺陷病毒基因促进病毒在新鲜淋巴细胞和巨噬细胞中的高效复制。J.维罗尔。
65, 5088–5091[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 7川村M.、酒井H.、阿达奇A.（1994）人类免疫缺陷病毒Vpx在外周血单个核细胞复制的早期阶段是必需的。微生物。免疫学。
38, 871–878 [公共医学][谷歌学者] 8Hirsch V.M.、Sharkey M.E.、Brown C.R.、Brichacek B.、Goldstein S.、Wakefield J.、Byrum R.、Elkins W.R.、Hahn B.H.、Lifson J.D.、Stevenson M.（1998）Vpx是SIV（SM）PBj传播和发病所必需的。巨噬细胞依赖性病毒扩增的证据。自然医学。
4, 1401–1408[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 9Goujon C.、Jarroson-Wuilleme L.、Bernaud J.、Rigal D.、Darlix J.-L.、Cimarelli A.（2006）在朋友的一点帮助下。用SIV（MAC）病毒样颗粒增强单核细胞衍生树突状细胞的HIV转导。基因疗法。
13, 991–994 [公共医学][谷歌学者] 10Goujon C.、Rivière L.、Jarroson-Wuilleme L.、Bernaud J.、Rigal D.、Darlix J.-L.、Cimarelli A.（2007）SIVSM/HIV-2 Vpx蛋白促进逆转录病毒从人类树突状细胞中存在的蛋白酶体依赖性限制途径逃逸。逆转录病毒学
4, 2.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 11Kaushik R.、Zhu X.、Stranska R.、Wu Y.、Stevenson M.（2009）细胞限制决定了非分裂单核细胞/巨噬细胞对慢病毒和γ-逆转录病毒感染的许可性。宿主与微生物
6, 68–80[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 12Hrecka K.、Hao C.、Gierszewska M.、Swanson S.K.、Kesik-Brodacka M.、Srivastava S.、Florens L.、Washburn M.P.、Skowronski J.（2011）Vpx减轻SAMHD1蛋白介导的巨噬细胞对HIV-1感染的抑制。自然
474, 658–661[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 13Laguette N.、Sobhian B.、Casartelli N.、Ringeard M.、Chable-Bessia C.、Ségéral E.、Yatim A.、Emiliani S.、Schwartz O.、Benkirane M.（2011）SAMHD1是被Vpx抵消的树突状和髓细胞特异性HIV-1限制因子。自然
474，654–657[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 14Berger A.、Sommer A.F.、Zwarg J.、Hamdorf M.、Welzel K.、Esly N.、Panitz S.、Reuter A.、Ramos I.、Jatiani A.、Mulder L.C.、Fernandez-Sesma A.、Rutsch F.、Simon V.、König R.、Flory E.（2011）Aicardi-Goutières综合征患者SAMHD1-缺陷CD14+细胞对HIV-1感染高度敏感。《公共科学图书馆·病理学》。
7，e1002425。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 15Baldauf H.M.、Pan X.、Erikson E.、Schmidt S.、Daddacha W.、Burggraf M.、Schenkova K.、Ambiel I.、Wabnitz G.、Gramberg T.、Panitz S.、Flory E.、Landau N.R.、Sertel S.，Rutsch F.、Lasitchka F.、Kim B.、König R.、Fackler O.T.、Keppler O.T.（2012）SAMHD1限制静止CD4中HIV-1感染+T细胞。自然医学。
18, 1682–1687[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 16Descours B.、Cribier A.、Chable Bessia C.、Ayinde D.、Rice G.、Crow Y.、Yatim A.、Schwartz O.、Laguette N.、Benkirane M.（2012年）SAMHD1限制静止CD4+T细胞中HIV-1逆转录。逆转录病毒学
9, 87.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 17Goldstone D.C.、Ennis-Adeniran V.、Hedden J.、Groom H.C.、Rice G.I.、Christodoulou E.、Walker P.A.、Kelly G.、Haire L.F.、Yap M.W.、de Carvalho L.P.、Stoye J.、Crow Y.J.、Taylor I.A.、Webb M.（2011）HIV-1限制因子SAMHD1是一种脱氧核苷三磷酸三磷酸水解酶。自然
480, 379–382 [公共医学][谷歌学者] 18鲍威尔·R·D、霍兰德·P·J、霍利斯·T、佩里诺·F·W（2011）Aicardi-Goutieres综合征基因和HIV-1限制性因子SAMHD1是一种dGTP调节的脱氧核苷酸三磷酸水解酶。生物学杂志。化学。
286, 43596–43600[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 19Hofmann H.、Logue E.C.、Bloch N.、Daddacha W.、Polsky S.B.、Schultz M.L.、Kim B.、Landau N.R.（2012）Vpx慢病毒辅助蛋白以SAMHD1为靶点在细胞核中降解。J.维罗尔。
86, 12552–12560[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 20Brandarize-Nuñez A.、Valle-Casuso J.C.、White T.E.、Laguette N.、Benkirane M.、Brojatsch J.、Diaz-Griffero F.（2012）SAMHD1核定位在限制HIV-1和SIVmac中的作用。逆转录病毒学
9, 49.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 21Ahn J.、Hao C.、Yan J.、DeLucia M.、Mehrens J.、Wang C.、Gronenborn A.M.、Skowronski J.（2012）HIV/猴免疫缺陷病毒（SIV）副毒力因子Vpx将宿主细胞限制因子SAMHD1加载到E3泛素连接酶复合物CRL4DCAF1上。生物学杂志。化学。
287, 12550–12558[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 22Laguette N.、Rahm N.、Sobhian B.、Chable-Bessia C.、Münch J.、Snoeck J.、Sauter D.、Switzer W.M.、Heneine W.、Kirchhoff F.、Delsuc F.、Telenti A.、Benkirane M.（2012）髓系限制因子SAMHD1与慢病毒Vpx蛋白相互作用的进化和功能分析。宿主与微生物
11, 205–217[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 23Lahouassa H.、Daddacha W.、Hofmann H.、Ayinde D.、Logue E.C.、Dragin L.、Bloch N.、Maudet C.、Bertrand M.、Gramberg T.、Pancino G.、Priet S.、Canard B.、Laguette N.、Benkirane M.、Transy C.、Landau N.R.、Kim B.、Margottin Goguet F.（2012）SAMHD1通过耗尽细胞内三磷酸脱氧核苷库来限制人类免疫缺陷病毒1型的复制。自然免疫学。
13, 223–228[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 24Kim B.、Nguyen L.A.、Daddacha W.、Hollenbaugh J.A.（2012）人类原代单核细胞衍生巨噬细胞中SAMHD1蛋白水平、细胞dNTP水平和HIV-1前病毒DNA合成动力学之间的紧密相互作用。生物学杂志。化学。
287, 21570–21574[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 25Lim E.S.、Fregoso O.I.、McCoy C.O.、Matsen F.A.、Malik H.S.、Emerman M.（2012）灵长类慢病毒降解单核细胞限制因子SAMHD1的能力早于病毒辅助蛋白Vpx的诞生。宿主与微生物
11, 194–204[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 26Rice G.I.、Bond J.、Asipu A.、Brunette R.L.、Manfield I.W.、Carr I.M.、Fuller J.C.、Jackson R.M.、Lamb T.、Briggs T.A.、Ali M.，Gornall H.、Couthard L.R.、Aeby A.、Attard-Montalto S.P.、Bertini E.、Bodemer C.、Brockmann K.、Brueton L.A.、Corry P.C.、Desguerre I.、Fazzi E.、Cazorla A.G.、Gener B.、Hamel B.C.、Heiberg A.、Hunter M.、。，van der Knaap M.S.、Kumar R.、Lagae L.、Landrieu P.G.、Lourenco C.M.、Marom D.、McDermott M.F.、van der Merwe W.、Orcesi S.、Prendiville J.S.、Rasmusen M.、Shalev S.A.、Soler D.M.、Shinawi M.、Spiegel R.、Tan T.Y.、Vanderver A.、Wakeling E.L.、Wassmer E.、Whittaker E.、Lebon P.、Stetson D.B.、Bonthron D.T.、Crow Y.J.（2009）Aicardi-Goutieres综合征的突变表明SAMHD1是先天免疫反应的调节因子。自然遗传学。
41, 829–832[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 27Xin B.、Jones S.、Puffenberger E.G.、Hinze C.、Bright A.、Tan H.、Zhou A.、Wu G.、Vargus-Adams J.、Agamanolis D.、Wang H.（2011）SAMHD1基因纯合子突变导致脑血管病和早期卒中。程序。国家。阿卡德。科学。美国。
108, 5372–5377[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 28Jepps H.、Seal S.、Hattingh L.、Crow Y.J.（2008）新生儿型Aicardi-Goutieres综合征伪装成先天性感染。早期人类发展。
84，783–785[公共医学][谷歌学者] 29Crow Y.J.、Rehwinkel J.（2009）Aicardi-Goutieres综合征及相关表型。将核酸代谢与自身免疫联系起来。嗯，分子遗传学。
18，R130–R136[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 30铃木K.、清川N.、田口T.、竹口H.、斋藤M.、清水T.、冈田H.、藤本J.（2007）CD34+骨髓细胞体外诱导单核巨噬细胞系细胞的特性。国际血液学杂志。
85, 384–389 [公共医学][谷歌学者] 31Yang Y.G.、Lindahl T.、Barnes D.E.（2007）Trex1核酸外切酶降解ssDNA以防止慢性检查点激活和自身免疫性疾病。单元格
131, 873–886 [公共医学][谷歌学者] 32Tanaka M.，Herr W.（1990年）10月1日和10月2日的差异转录激活。相互依赖的激活域诱导Oct-2磷酸化。单元格
60, 375–386 [公共医学][谷歌学者] 33Hrecka K.、Gierszewska M.、Srivastava S.、Kozaczkiewicz L.、Swanson S.K.、Florens L.、Washburn M.P.、Skowronski J.（2007）慢病毒Vpr篡夺Cul4–DDB1[VprBP]E3泛素连接酶调节细胞周期。程序。国家。阿卡德。科学。美国。
104, 11778–11783[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 34Connor R.I.、Chen B.K.、Choe S.、Landau NR.（1995）Vpr是在单核吞噬细胞中高效复制人类免疫缺陷病毒1型所必需的。病毒学
206, 935–944 [公共医学][谷歌学者] 35Fromentin E.、Gavegnano C.、Obikhod A.、Schinazi R.F.（2010）液相色谱-串联质谱法同时定量细胞内天然和抗逆转录病毒核苷和核苷酸。分析。化学。
82, 1982–1989[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 36Janardhan A.、Swigut T.、Hill B.、Myers M.P.、Skowronski J.（2004）HIV-1 Nef结合DOCK2-ELMO1复合物激活rac并抑制淋巴细胞趋化性。《公共科学图书馆·生物》。
2，E6。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 37魏伟、郭宏、韩旭、刘旭、周旭、张伟、于晓峰（2012）Vpx介导的核SAMHD1降解和Vpr诱导的G2阻滞所需的新型DCAF1结合基序。细胞微生物学。
14, 1745–1756 [公共医学][谷歌学者] 38Vorontsov I.、Minasov G.、Kiryukhina O.、Brunzelle J.S.、Shuvalova L.、Anderson W.F.（2011年）产EF1143蛋白脱氧核苷酸三磷酸三磷酸水解酶（dNTPase）活性的表征粪肠球菌活化剂-底物复合物的晶体结构。生物学杂志。化学。
286, 33158–33166[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 
