Stim1、PKCδ和RasGRP蛋白设置了B细胞发育期间促凋亡Erk信号的阈值

SOCE增加导致钙²⁺-依赖性Erk激活

我们检测了在刺激2分钟和5分钟后Stim1过度表达的DT40 B细胞的磷酸化酪氨酸谱，并观察到约42 kDa带的稳定和持续的酪氨酸磷酸化，这在刺激thapsigargin的野生型DT40细胞中只有少量检测到(图1c). 用磷酸酪氨酸抗体免疫沉淀这种蛋白质(图1d)随后通过质谱鉴定出该条带为Erk2。为了确认该蛋白的身份，在细胞外钙存在或不存在的情况下，用thapsigargin或CPA随着时间的推移刺激DT40细胞或Stim1过度表达的DT40细胞²⁺，并用流式细胞术分析磷酸化Erk（pErk）反应。而Ca²⁺-依赖性Erk激活在野生型DT40中是适度且短暂的，在Stim1过度表达的DT40细胞中是强健且持续的(图1e、f,补充图2b). 细胞外钙螯合²⁺通过EGTA有效地消除了thapsigargin或CPA诱导的pErk反应，表明在Stim1过度表达的DT40细胞中观察到的强大Erk激活是由于这些细胞中的SOCE增加。

抗原诱导的淋巴细胞Erk活化被认为是DAG依赖性的，主要是Ca²⁺-独立的，独立的^23–27然而，我们假设类似的Ca²⁺-当SOCE相对于有限的DAG信号更强烈时，B细胞中Erk的驱动途径可能变得相关¹⁰，比DAG信号持续时间更长。与野生型DT40细胞相比，Stim1过表达的DT40细胞在BCR刺激下增加并延长了pErk的产生，并且这种反应的增加幅度和持续时间取决于细胞外Ca²⁺(图2a、b). 确定通往Erk的途径是否主要由Ca触发²⁺较少使用DAG，我们使用了二酰甘油激酶ζ（DGKζ），它将DAG转化为磷脂酸，从而抑制DAG依赖性反应²⁸我们用DGKζ和CD16作为转染细胞的替代细胞表面标记物转染过表达Stim1的DT40细胞。然后用thapsigargin或一剂量的抗BCR刺激细胞，在未感染的人群中引起等效的pErk反应(图2c、d). DGKζ的表达不抑制thapsigargin诱导的Ca²⁺-依赖pErk(图2c、d). 相反，触发DAG生成和SOCE的BCR交联引发pErk反应，该反应部分被DGKζ抑制。BCR交联时添加EGTA会进一步抑制pErk反应，表明同时抑制Ca²⁺DAG几乎可以完全清除这些细胞中的Erk激活。因此，BCR刺激可以通过不同的DAG或Ca激活Erk²⁺-钙的依赖途径和动力学²⁺进入和DAG生成影响这些途径对整体反应的相对贡献。

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图2

BCR刺激通过两条主要由钙激活的不同途径激活Erk²⁺或DAG

（a）通过流式细胞术分析抗BCR刺激的细胞的磷酸化Erk（pErk）强度。（b）绘制了pErk随时间变化的平均荧光强度（MFI）。数据代表了至少五个独立实验。（c、d）用CD16和载体或DGKζ构建物瞬时转染稳定过度表达Stim1的DT40细胞。在转染后16–20 h收集细胞，用1μM thapsigargin或抗BCR刺激5 min，并用流式细胞术分析pErk的丰度。表面CD16与pErk一起染色，并作为标记物来区分同一样本中转染和未转染的人群（如c（c）). 直方图表示所示每个人群的pErk反应，数字表示pErk百分比⁺相应CD16中的单元格⁺人口（d） ●●●●。面板a-d中的数据代表了至少3个实验。

钙²⁺-骨髓发育中B细胞的Erk信号转导

接下来我们研究了这种Ca的激活²⁺-我们在DT40 B细胞模型中观察到的带有Stim1表达的Erk通路也发生在原代B细胞中。对野生型C57BL/6小鼠的骨髓细胞进行thapsigargin长期刺激、固定、渗透、pErk染色，并结合细胞表面标记物进行流式细胞术分析。只有未成熟和过渡型B细胞，而不是早期的前体细胞或成熟的再循环B细胞，显示出强大的钙²⁺-依赖性Erk激活(图3). 钙²⁺-脾过渡性亚群中依赖性Erk的激活不如骨髓未成熟和过渡性细胞中的激活强烈（数据未显示），这表明此途径在骨髓中更为相关。因此，B细胞在发育过程中发生改变，以激活该通路，尤其是在对凋亡高度敏感的骨髓B细胞群中，这是自我激活B细胞缺失的重要检查点。

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图3

钙²⁺-原代骨髓B细胞在负选择阶段选择性地激活依赖性Erk

（a）用thapsigargin刺激WT C57BL/6小鼠的骨髓细胞，固定、渗透并染色pErk和细胞表面标记物。B220型⁺被选入4个亚群的细胞被定义为B220⁺免疫球蛋白M⁻免疫球蛋白D⁻（前体），B220⁺免疫球蛋白M⁺免疫球蛋白D⁻（不成熟），B220⁺免疫球蛋白M^你好免疫球蛋白D^整数（过渡），B220⁺免疫球蛋白M^洛免疫球蛋白D⁺（成熟再循环），如上点图所示。对每个亚群的pErk反应进行分析。（b）pErk响应的平均荧光强度随时间变化的图表。这些数据代表了至少3个实验。

发育中的B细胞中Stim1过度表达缺失

我们接下来假设，与在DT40细胞中观察到的效果类似，增加骨髓造血祖细胞中的Stim1可能会增加SOCE，增加Ca²⁺-依赖性Erk信号传导并使发育中的B细胞对阴性选择敏感。为了验证这个假设，我们用携带eYFP或eYFP-Stim1的逆转录病毒感染表达不同同源标记的骨髓造血干细胞。这些细胞用于竞争性再生实验和eYFP-Stim1的存活⁺在与eYFP相关的整个发育过程中追踪B细胞⁺B细胞。eYFP-Stim1⁺细胞被eYFP显著竞争⁺单元格(图4)，导致eYFP-Stim1数量非常低⁺外周B细胞。Stim1+B细胞的最大损失发生在与钙的发育开始相关的骨髓阶段²⁺-依赖性Erk激活。因此，增加Stim1的表达对处于同一阶段的B细胞的发育具有竞争性劣势，而同一阶段B细胞对thapsigargin诱导的非移植骨髓B系细胞中Erk的激活最为敏感。为了测试这种竞争优势是否是由于增加了负选择，我们检测了Stim1对发育MD4转基因B细胞的影响，该细胞表达识别鸡蛋溶菌酶（IgHEL）的转基因BCR。将来自MD4小鼠的造血干细胞（HSC）感染eYFP-Stim1，并注射到致死性照射的野生型受体小鼠中。eYFP-Stim1转导的MD4 B细胞相对于非转导的MD4 B细胞的存活率在整个发育过程中进行了追踪。在缺乏抗原的情况下，过度表达eYFP-Stim1的MD4 B细胞在骨髓发育过程中与非转导细胞有效竞争(补充图3). 事实上，偶尔小鼠表现出eYFP-Stim1的扩张⁺细胞相对于非转导细胞，这种效应与在具有无限制B细胞库的小鼠中观察到的相反。因此，在没有抗原（HEL）的情况下，将BCR库限制为IgHEL足以挽救Stim1过表达B细胞的竞争劣势。这些发现表明，Stim1过度表达使发育中的B细胞对阴性选择敏感。

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图4

Stim1过度表达对B细胞的发育具有竞争劣势

CD45.1型^+/+或CD45.1⁺CD45.2型⁺纯化的骨髓造血干细胞分别感染携带eYFP或eYFP-Stim1的逆转录病毒。将感染细胞以1:1的比例混合，并将相同基因型的未感染载体骨髓注射到致命照射的CD45.2中^+/+主机。注射后8-10周对宿主小鼠进行分析。采集骨髓、脾脏和淋巴结细胞，对各种细胞表面标记物进行染色，并用流式细胞仪进行分析。CD45.1的比率⁺CD45.2型⁺至CD45.1^+/+计算受感染的细胞（eYFP⁺)或未感染（eYFP⁻)B细胞发育不同阶段的种群（对应于eYFP-Stim1⁺至eYFP⁺感染人群中的比率）。数据代表三组重组小鼠中的一组。误差线：此队列的s.e.m(n个=5只小鼠）。

RasGRP依赖性钙²⁺-Erk信号是促凋亡的

接下来我们研究了SOCE激活Erk的机制，以确定该途径与细胞凋亡之间是否存在因果关系。钙的增加通常不被认为调节导致Erk激活的MAPK途径。RasGrp和SOS是Ras鸟嘌呤核苷酸交换因子（RasGEFs），参与淋巴细胞Erk活化上游RasGTP的产生^25,29–33RasGrp蛋白含有DAG结合C1结构域和Ca²⁺-结合EF手，它们被提议在B细胞中调节促凋亡信号^34,35虽然DAG对RasGrp活性很重要，但我们假设，在高SOCE条件下，Ca²⁺也可能触发RasGrp的激活，导致Erk激活。我们首先瞬时转染光栅1^−/−Rasgrp3型^−/−或Sos1系列^−/−二氧化硫^−/−DT40电池³²用eYFP-Stim1检测这些细胞支持Erk激活以响应thapsigargin的能力。Thapsigargin诱导的Erk激活在过度表达RasGRP缺陷的Stim1细胞中几乎完全消除，但在过度表达Stim1的SOS缺陷细胞中完全不受影响(图5a). 因此，我们产生了光栅1^−/−Rasgrp3型^−/−稳定过度表达eYFP-Stim1的DT40细胞株(补充图4a)与野生型DT40细胞过度表达Stim1时观察到的SOCE增加相似(补充图4b). 正如在瞬时转染实验后所预期的那样，这些细胞对thapsigargin的反应显示Erk活性几乎完全丧失(补充图4c). RasGrp缺乏使DT40细胞免于BCR诱导的凋亡，即使Stim1过度表达(图5b). 这些结果表明，RasGrp需要通过Ca介导Erk活化²⁺和破坏Ca²⁺-RasGrp和Erk的依赖性激活足以抑制抗原受体诱导的凋亡。

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图5

钙下游Erk的活化²⁺需要RasGrp

（a）重量，光栅1^−/− Rasgrp3型^−/−，或Sos1系列^−/−二氧化硫^−/−用eYFP-Stim1瞬时转染DT40细胞。用所示的thapsigargin刺激细胞，固定、渗透并染色pErk。结果显示eYFP-Stim1表达群体中的pErk强度。数据是两个独立实验的代表。（b）刺激稳定过度表达Stim1的细胞8小时，并分析表面Annexin V⁺相对于未刺激细胞的细胞。误差线：s.e.m(n个=5个实验）。（c）用指示的PKC抑制剂处理稳定过表达Stim1的WT DT40细胞5分钟，用thapsigargin或抗BCR抗体刺激5分钟，并分析pErk强度。数据代表至少两个独立实验。

已知PKC介导的RasGrp磷酸化对其活化很重要^25,26,36,37.为了确定Ca²⁺-依赖性激活Erk需要PKC活性，我们检测了两种不同的PKC抑制剂GF-109203X和Gö6976对thapsigargin或抗BCR诱导的pErk的影响。令人惊讶的是，这两种PKC抑制剂具有相反的作用。GF-109203X有效地抑制了对thapsigargin的反应，但对抗BCR反应的影响较小。Gö6976没有抑制对他司加金氏菌的反应，但抑制了大多数抗BCR诱导的pErk反应，其余pErk为Ca²⁺-从属的(图5c). 这一结果与之前研究Gö6976在BCR诱导的pErk中的作用一致^36,37因此，Gö6976抑制BCR介导的Erk反应的DAG依赖性成分，但不抑制Ca²⁺-依赖性反应。相反，GF-109203X抑制Ca²⁺-依赖性Erk反应，但不依赖于DAG反应。尽管已知这两种抑制剂都能以相似的效力抑制经典PKCs，但它们抑制非经典PKCs的能力不同。GF-109203X，但不是Gö6976，可以有效阻断PKCδ活性³⁸表明PKC亚型在钙²⁺依赖性Erk信号。

钙²⁺-Erk信号需要phospho-S332 RasGRP1

PKC和RasGRP蛋白之间的合作已被充分记录，但迄今为止唯一被确定为PKC靶点的磷酸化位点是RasGRP1 T184，它对应于RasGRP3的T133（参考文献。^36,37). 有趣的是，这两个位点都不符合PKCδ共识靶序列。此外，这些位点的磷酸化被Gö6976阻断，它不抑制PKCδ或Ca²⁺-依赖性Erk激活。事实上，我们发现T133 RasGRP3对thapsigargin没有磷酸化反应，T184A突变型RasGRP1在调节SOCE反应中的Erk激活中起着重要作用（数据未显示）。因此，我们假设PKCδ可能在其他位点磷酸化RasGRP，从而诱导功能不同的Erk通路的激活。为了验证这一假设，我们基于三个标准在人类RasGRP1上选择候选位点：一、假定位点具有PKCδ一致性靶序列（S/TXR/K）；第二，这些站点在Netphos 2.0服务器上的预测磷酸化得分应高于0.8(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos网站/)³⁹; 第三，不同物种（鸡、鼠和人）的位点应该得到保护(补充图5a). 在RasGRP1上鉴定出五个潜在的丝氨酸或苏氨酸位点，并分别突变为丙氨酸。将这些突变体或野生型人类RasGRP1瞬时转染到Stim1过度表达的RasGRP缺陷DT40细胞中。然后用thapsigargin刺激转染细胞，并检测转染人群中的pErk反应。五种突变蛋白中有四种能够支持钙²⁺-依赖性Erk激活(补充图5b). 然而，RasGRP1 S332A在该途径的激活方面完全不足，导致pErk激活相对较低，正如在RasGRP缺失的亲代细胞中观察到的那样(图6a). S332A突变体RasGRP1的表达量与野生型RasGRP2转染体中观察到的表达量相当(补充图6)，确保这种影响不是由于缺乏表达或蛋白质稳定性降低所致。然后我们检测了该突变体支持DAG介导的Erk激活的能力。

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图6

需要对S332 RasGRP1进行磷酸化，以使RasGRP2恢复Ca²⁺-RasGRP缺陷细胞的依赖性Erk激活

用WT或突变的Myc标记的人类RasGRP1构建物瞬时转染RasGRP缺陷的Stim1过度表达细胞。按指示刺激细胞，并分析pErk反应。图中显示了刺激后pErk随时间的MFI。（a、b）S332A突变对thapsigargin诱导pErk反应的影响（a）或在EGTA存在下通过BCR交联（b）数据代表至少四个独立实验。（c、d）S332D突变对thapsigargin诱导pErk反应的影响（c）或在EGTA存在下通过BCR交联（d）数据代表两个独立实验（e）使用ModWeb服务器和模板鼠标RasGRF1（pdb 2IJE）对小鼠RasGRP1的Cdc25域的三维结构进行建模。丝氨酸332（蓝色条）的潜在磷酸化位点位于紧靠螺旋发夹的flap2中。S332 3.2Å范围内的残留物以棒状表示。

值得注意的是，当细胞在EGTA存在下用抗BCR刺激时，S332A突变体RasGRP1能够支持Erk的激活，尽管比野生型RasGRP2少(图6b). 这一结果表明，S332A突变不会导致完全不活跃的核苷酸交换因子，而是代表了调节交换因子对钙的选择性反应的关键位点²⁺-感应信号。为了进一步说明S332磷酸化是否参与钙²⁺-诱导Erk激活后，我们产生了一个磷酸拟态S332D RasGrp1突变体。S332D突变体具有完全功能，并诱导Erk激活以响应Ca²⁺与野生型RasGRP1相同(图6c). DAG-依赖性BCR反应也是如此，通过在EGTA存在下用抗BCR刺激进行测量(图6d). 这些结果表明，S332的磷酸化对钙是绝对必要的²⁺-依赖性，但不适用于DAG-依赖性BCR诱导的Erk激活。有趣的是，表达磷酸化突变体RasGrp1的细胞在未刺激的细胞中没有表现出组成性Erk激活，这表明尽管需要磷酸化S332，但可能不足以组成性激活该途径。

考虑到S332A突变对RasGRP1介导Ca的能力的强大影响²⁺-依赖Erk激活，我们使用ModWeb服务器进行同源建模⁴⁰和模板鼠标RasGRF1（pdb 2IJE）⁴¹深入了解该位点在RasGRP1活性调节中可能发挥的作用(图6e). 有趣的是，该模型预测S332位于CDC25结构域的“flap2”区域，磷酸化事件可能影响Ras结合和/或催化螺旋发夹的定位。

Stim1、RasGRP和PKCδ的发育调控

为了确定蛋白表达的发育调控是否在阴性选择期间选择性激活该途径中发挥作用，我们对骨髓B细胞亚群进行了分类，并检测了Stim1、PKCδ和RasGRP蛋白的表达。与此途径在抗原诱导的凋亡中的作用一致，RasGRP1、RasGRP3、PKCδ和Stim1的表达在骨髓过渡期均增加，此时出现负选择(补充图7). 这一阶段也是thapsigargin诱导的SOCE波幅更高、动力学更快的阶段(补充图8)并且出现了最大的thapsigargin诱导的pErk反应(图3). 成熟B细胞中RasGRP1、PKCδ和Stim1的表达随后下调，而成熟B细胞的RasGRP3丰度进一步增加。PKCδ的表达模式与先前发表的检测PKCδ表达的结果一致LacZ公司基因被引入Prkcd公司位于Prkcd公司^−/−老鼠²¹.

同样，骨髓过渡性B细胞中RasGRP1和PKCδ蛋白的增加也与免疫基因组研究项目（IMMGEN）网站上报告的mRNA丰度的显著变化一致(http://www.immgen.org/databrowser/index.html). 这些结果表明，RasGRP1、PKCδ和Stim1的瞬时增加可能有助于Ca²⁺-发育中的B细胞中的Erk通路，以及成熟B细胞中这些蛋白的下调可能导致对抗原诱导的凋亡失去敏感性。相反，RasGRP3的表达模式表明该蛋白也可能参与成熟B细胞中DAG介导的Erk信号传导。

钙²⁺-发育中B细胞的Erk信号需要PKCδ

Ca可能需要PKCδ的概念²⁺-鉴于B细胞的表型，B细胞阴性选择期间依赖性Erk的激活是很有趣的Prkcd公司^−/−老鼠^21,22这些小鼠脾脏和淋巴结中的B细胞数量分别增加了两倍和七倍。在这些小鼠中，自我激活的B细胞发育，最终分化，但未能成为无活性细胞。这个Prkcd公司^−/−小鼠产生抗核抗体，并因自身免疫性疾病在9-12个月大时过早死亡。以前对这些小鼠的研究主要集中在外周血B细胞内稳态的缺陷，这些缺陷有助于表型⁴²然而，基于Ca的发育调节²⁺-依赖性Erk激活，我们假设Prkcd公司^−/−小鼠可能至少部分是由于不能激活钙²⁺-在B细胞阴性选择过程中调节Erk通路。我们进行了竞争性再种群实验，其中Prkcd公司^−/−将野生型骨髓细胞以1:1的比例混合，并注射到受致命照射的小鼠体内。正如预期的那样Prkcd公司^−/−B细胞超过野生型细胞(图7a). 有趣的是，观察到这种效应的最早发育阶段与Ca的骨髓阶段一致²⁺-依赖性Erk激活发生，Stim1表达增加增强了阴性选择，而在抗原受体表达之前的发育阶段没有观察到。这一观察表明Prkcd公司^−/−B细胞与发育阶段特异性信号的改变有关。

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图7

Ca需要PKCδ²⁺-骨髓细胞发育过程中依赖性Erk激活

（a） Prkdc公司^−/−并将携带不同CD45先天性标志物的WT骨髓细胞以1:1的比例混合，并注射到致命照射的宿主中。注射后6-8周对小鼠进行分析。图表显示了Prkdc公司^−/−B细胞发育过程中WT细胞。数据代表两组小鼠中的一组。误差线：s.e.m(n个=8只小鼠）（b） Prkcd公司^−/−如图所示，用thapsigargin刺激WT对照骨髓细胞。流式细胞术分析pErk反应。（c）相对于静止细胞，每个骨髓亚群3A中pErk MFI的折叠诱导。数据代表至少四个独立实验。

然后我们假设Prkcd公司^−/−骨髓移行B细胞可能与促凋亡Ca的丧失有关²⁺-发育阶段的Erk信号。Thapsigargin诱导的SOCE在Prkcd公司^−/−细胞比野生型细胞(补充图8). 然而，Ca²⁺-依赖性Erk激活在Prkcd公司^−/−骨髓发育中的B细胞(图7b、c). BrdU掺入率显示，所分析的细胞群包含两种基因型中新生成的B细胞的数量相当(补充图9). 因此，钙的损失²⁺-过渡期依赖性Erk信号Prkcd公司^−/−骨髓B细胞可能会增加自身反应性B细胞的存活率，否则这些细胞会发生凋亡，从而为先前描述的自身免疫表型奠定基础(补充图10a、b). 相反，通过增加Stim1浓度来增强该途径的激活(图4)可能导致该途径的激活增加，导致负选择增加(补充图10c).

老鼠

Prkcd公司^−/−之前描述过老鼠²¹C57BL/6和BoyJ小鼠购自Jackson实验室。UCSF动物护理和使用委员会（IACUC）审查并批准了小鼠实验。

抗体、试剂和抑制剂

小鼠IgD（11–26）、IgM（II/41）、B220（RA3-6B2）、CD45.1（A20）、CD44.2（104）、CD43（S7）、CD21（7G6）、CD23（B3B4）、CD93（AA4.1）与FITC、PE、PerCP-Cy5.5、PE-Cy7、太平洋蓝、别藻蓝蛋白或Alexa Fluoro 647偶联的抗体来自eBioscience、Biolegend或BD Bioscienses。与PE或太平洋蓝偶联的膜联蛋白V来自BD Biosciences和Biolegend。DAPI来自罗氏公司。FITC-偶联F（ab）单体片段和与别藻蓝蛋白偶联的山羊抗兔IgG Abs是从Jackson ImmunoResearch Laboratories获得的。与PE或别藻蓝蛋白结合的CD16抗体从Caltag实验室获得。Phospho-Erk（#197G2）、total Erk（#9102）、RasGRP3（C33A3）和PKCδ（#2058）抗体来自Cell Signaling，RasGRP1（m199）抗体来自Santa Cruz，Stim1（#610954）抗体来自BD。Thapsigargin、Gö6976和GF-109203X来自Calbiochem。IL-3、IL-6和干细胞因子来自Peprotech。Lipofectamine 2000来自Invitrogen。使用BD的BrdU标签套件，按照制造商的说明进行BrdU标记。

质粒、逆转录病毒、转染和感染

pDS SP-YFP-Stim1和pEF-Flag-hDGKζ质粒先前已有描述¹³²⁸对于DT40转染，细胞被清洗并重新悬浮在6.6×10⁷无血清RPMI中的细胞/ml。使用方波电穿孔器（BTX ECM 800）在300V电压下电穿孔10毫秒，休息15分钟，然后在不含抗生素的完整DT40培养基中电镀细胞。

逆转录病毒eYFP和eYFP-Stim1构建物是通过末端结扎将这些基因亚克隆到MSCV-IThy1.1载体中产生的。用NheI和Not1消化peYFP-N1质粒（Clontech），用NheI-BglII消化eYFP-Stim1质粒，用NotI消化载体。使用钝端结扎试剂盒（Takara）对所有消化的DNA片段进行钝化和结扎。通过将这些构建物与pCL-Eco共转染（按照制造商的说明进行）到φNX-Eco细胞中，产生逆转录病毒。在转染后24和48小时收集上清液。用病毒上清液感染3T3细胞，用流式细胞术（FACS）根据eYFP表达细胞的百分比测定病毒滴度。只有滴度高于10的上清液⁶粒子/ml（假设每种病毒感染一个细胞，细胞在感染后不分裂）用于原代骨髓细胞的感染。对于感染，MACS-纯化的造血干细胞在补充有15%FCS、20 ng/ml IL-3、10 ng/ml IL-6和100 ng/ml SCF的完整DMEM中培养过夜。第2天，将细胞重新悬浮在补充有8μg/ml聚布雷恩、15%FCS、20 ng/ml IL-3、10 ng/ml IL-6和100 ng/ml SCF的病毒上清液中，并将其置于6孔板上。细胞在30°C下离心2小时，并在37°C下培养过夜。第3天重复感染，第4天注射（见骨髓重建部分）。

免疫沉淀、免疫印迹和质谱分析

将DT40细胞在补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的1%NP40缓冲液中裂解10⁷细胞/ml。分选的骨髓细胞在5×10的条件下进行裂解⁶细胞/ml。免疫印迹和免疫沉淀基本上如前所述²⁵为了进行质谱分析，4G10免疫沉淀物用SDS-PAGE溶解，用胶体蓝（Invitrogen）染色，感兴趣的条带被切除并用胰蛋白酶消化。将色氨酸消化液提交给加州大学旧金山分校生物分子资源中心质谱设施，用于纳米电喷雾LC/MS/MS和肽质量指纹分析。

细胞内钙²⁺测量

按照制造商的说明，用Indo-1（分子探针）装载细胞。钙²⁺-游离钙²⁺-用荧光计（日立F-4500或分子器件Flexstation3）测量细胞刺激期间的结合发射。如前所述，通过多色流式细胞术分析原代细胞⁹.

细胞内pErk染色

在预先加热的无血清DMEM上采集原始骨髓细胞，DMEM补充有pH 7.2的HEPES、非必需氨基酸、丙酮酸钠、β-巯基乙醇、青霉素、链霉素和L-谷氨酰胺。细胞在37°C下放置在含有1:5000稀释的非刺激性FITC-标记F（ab）单体片段的培养基中1 h，然后用thapsigargin刺激指定时间，用预先加热的细胞修复剂（BD）固定15 min，用流式细胞仪缓冲液洗涤两次，并在冰镇甲醇中渗透45 min。然后将细胞清洗三次，在含有pErk（细胞信号）抗体和4%小鼠血清的流式细胞术缓冲液中培养45分钟，清洗两次，并用抗兔二级抗体以及抗B220和IgD抗体染色。然后通过流式细胞术分析细胞（详见补充方法). DT40细胞遵循相同的方案，除了在补充有β-巯基乙醇的无血清RPMI中进行刺激，并且仅对pErk进行染色（除了暂时转染的细胞，其对CD16进行共染色）。

骨髓重建

采集每个实验所需的供体小鼠骨髓细胞，使用MACS干细胞纯化试剂盒（Miltenyi Biotech）纯化干细胞，并在含有IL-3、IL-6和SCF的完整培养基中培养过夜。然后用携带eYFP或eYFP-Stim1的逆转录病毒感染细胞。细胞计数，以1:1的比例混合，与相同基因型的未感染载体骨髓的1:1混合物混合，并注射到辐照CD45.2中^+/+宿主收件人。注射后8-10周采集受者骨髓、脾脏和淋巴结，并进行流式细胞术分析。

流式细胞术

从骨髓、淋巴结（LN）和脾脏制备单细胞悬液。用大鼠抗CD16/32（克隆2.4G2；BD Biosciences）阻断Fc受体。1–3 × 10⁶用指示的Abs对细胞进行染色，并在FACSCalibur（BD Biosciences）、CyAN ADP（Beckman Coulter）、Gallios（Beckman-Coulter）或LSRII（BD bioscience）流式细胞术系统上进行分析。正向和侧向散射排除通常用于识别活细胞。对于骨髓嵌合体的分析，与DAPI联合用于排除死亡细胞。使用FlowJo（8.8.4版）软件（Tree Star）进行数据分析。使用MoFlo系统进行细胞分选。

我们要感谢加州大学旧金山分校Sandler-Moore质谱核心设施在蛋白质鉴定方面的协助；该核心项目由桑德勒家庭基金会、戈登和贝蒂·摩尔基金会以及NIH/NCI P30 CA82103癌症中心支持基金资助。我们感谢加州大学旧金山分校病理与糖尿病中心流式细胞术核心设施的帮助。我们感谢Gary Koretzky提供pEF-Flag-hDGKζ质粒。我们感谢A.Roque在畜牧业方面的帮助，感谢H.Phee和M.Hermiston批判性地阅读手稿并提供有益的建议，感谢B.Au-Yeung和H.Wang在尾静脉注射方面的帮助以及Weiss实验室成员的有益讨论。这项工作得到了霍华德·休斯医学研究所和西德尼·金梅尔基金会（JPR）的支持。