大-中性氨基酸转运蛋白1(LAT-1）是一种在大脑、睾丸和胎盘中发现的钠非依赖性交换器，在那里它介导大的中性氨基酸（如酪氨酸）和甲状腺激素（如三碘甲状腺原氨酸）穿过细胞膜的转运(1). 更具体地说，LAT-1在血脑屏障（BBB）的血和脑细胞膜中高度表达，为中枢神经系统（CNS）提供必需的营养素，并帮助维持神经微环境(2). LAT-1也是一个重要的药物靶点，因为它可以运输多种处方药，例如抗帕金森病药物L（左）-多巴和抗惊厥药加巴喷丁穿过血脑屏障，从而发挥其药理作用(三,4). BBB的这一功能通过修饰CNS-不渗透药物，使LAT-1成为药物输送的靶点，使其成为LAT-1底物，并增强了BBB的渗透性(5,6).
此外，LAT-1在多种癌症中的表达水平增加，包括非小细胞肺癌和多形性胶质母细胞瘤（GBM）(7,8). LAT-1的表达随着癌症的进展而增加，导致高级别肿瘤和转移中的高表达水平(9). 尤其是，LAT-1通过为生长中的肿瘤细胞提供必需氨基酸，在癌相关的重新编程代谢网络中发挥关键作用，这些氨基酸被用作营养物质来构建生物量，并通过激活进展通路（如哺乳动物靶点雷帕霉素（mTOR）通路）来增强信号分子的增殖(10). 此外，抑制LAT-1功能可减少肿瘤细胞增殖，这表明它可能是新型抗癌治疗的可行靶点(11–13). 因此，以LAT-1为靶点的癌症药物可以是LAT-1抑制剂，该抑制剂可以剥夺癌细胞的营养成分，也可以是具有细胞内靶点（例如代谢酶）的细胞毒性LAT-1底物。
LAT-1是一种大蛋白，具有12个假定的跨膜螺旋(14). 为了跨膜运输溶质，LAT-1与SLC3A2结合，SLC3A2是一种糖蛋白，具有单个跨膜螺旋，作为LAT-1的伴侣(14). 人类LAT-1的原子结构尚不清楚，但LAT-1与原核转运蛋白（如氨基酸/多胺/有机阳离子转运蛋白（APC）家族成员）具有显著的序列相似性，其代表性结构最近已通过X射线晶体学测定(15–19). 精氨酸的结构：胍丁胺反转运蛋白AdiC大肠杆菌(15,17,18)和肠道沙门菌(20)在不同的构象中，显示出内部的双重假对称性，类似于钠和氯依赖性亮氨酸转运蛋白LeuT的结构(19,21). 这些数据与其他相关运输工具的结构相结合(22)和分子动力学（MD）模拟(23)，提出了LAT-1同源物和LeuT之间的共同转运机制，其中钠在LeuT中的作用被认为是由一些APC转运蛋白中的质子模拟的(23). 因此，LAT-1也可能通过交替进入转运机制跨细胞膜转运配体(22,24,25).
在本研究中，我们采用综合计算和实验方法来表征先前未知的LAT-1配体。我们基于原核生物同源APC家族转运体的结构构建LAT-1的结构模型，然后根据这些模型对代谢物和处方药物库进行虚拟配体筛选，以预测小分子配体。通过使用顺式-抑制实验和反式-分别进行刺激试验。此外，我们还描述了选定的验证配体对细胞增殖的影响。最后，我们描述了我们的结果的药理意义，包括所发现配体的预期和非预期作用如何通过LAT-1在BBB上的转运介导，以及它们作为化学工具来表征LAT-1对癌症的作用的潜在用途。
结果
LAT-1预测结构和配体结合。
LAT-1是根据精氨酸/胍基转运体AdiC的X射线结构建模的大肠杆菌在向外封闭的精氨酸结合构象中(17)和APC转运体ApcT的结构詹氏甲烷球菌向内-阿波罗构象(16) (图S1和SI材料和方法). 最后的LAT-1模型包含蛋白质的整个跨膜结构域（即12个跨膜螺旋），包括构成预测配体结合位点的残基。比较模型首先使用Z-DOPE评分，Z-DOPE是一种基于已知蛋白质结构的归一化原子距离相关统计电位(26). 顶级模型的Z-DOPE分数为-0.3，表明其60%的Cα原子位于其正确位置的3.5º以内(27) (表S1). 每个模型还根据其区分已知配体和可能的非结合物（诱饵）的能力，通过使用从配体锁计算得出的富集曲线进行评估(28). 最终改良LAT-1模型的logAUC得分为31.9(表S1)，表明它适合于预测实验测试中的配体(28–30).
LAT-1与苯丙氨酸相互作用的模型表明，LAT-1和氨基酸配体的羧基和氨基之间的大多数关键极性相互作用在LAT-1及AdiC模板结构之间保守(和图S1). 例如，预测LAT-1残基T62、I63、I64、S66、G67、F252、A253和G255的主链极性基团与苯丙氨酸形成极性相互作用(). 这些残基对应于AdiC的A22、I23、M24、S26、G27、W202、S203和I205，它们与配体精氨酸的羧基和氨基有类似的相互作用(17). 因为羧基和氨基在所有其他已知的LAT-1配体中都是保守的，例如甲状腺素和加巴喷丁()，我们假设它们与LAT-1有类似的相互作用。
预测LAT-1结构和配体结合模式。(一)LAT-1–苯丙氨酸复合物的预测结构。LAT-1（灰色）和苯丙氨酸（青色）显示为棒状模型；氧、氮和氢原子分别用红色、蓝色和白色表示；苯丙氨酸和LAT-1之间的关键氢键（包括残基Thr-62、Ile-63、Ile-6、Ser-66、Gly-67、Phe-252、Ala-253和Gly-255）显示为灰色虚线。(B类)典型LAT-1基板的结构。已知的LAT-1底物，包括代谢产物（色氨酸、甲硫氨酸和甲状腺素）和处方药（美法仑，L（左）-多巴和加巴喷丁）使用MarvinView 5.4.1.1（Chemaxon）显示。
相反，LAT-1和AdiC配体偏好的差异可以用LAT-1模型和AdiC结构结合位点的两个主要差异来解释(图S2). 首先，具有疏水性侧链的几个残基（即I139、V148、F252、F402和W405）位于LAT-1结合位点，可能有助于通过范德华相互作用和疏水效应（例如色氨酸吲哚环）增加疏水性氨基酸对LAT-1的配体结合亲和力。LAT-1同源物中的一些疏水残基被非疏水残基取代，包括模板结构AdiC和其他SLC7成员。例如，LAT-1中的芳香族残基W405对应于AdiC中的极性T361。第二，AdiC中的几个结合位点残基被LAT-1中具有较小侧链的残基所取代，从而在LAT-1的结合位点中创造了更大的体积，可以容纳更大的氨基酸。例如，AdiC中的M104、I205和W293对应于LAT-1中较小的V148、G255和S342(和图S2).
药物和代谢物的虚拟筛选。
我们计算筛选了来自京都基因和基因组百科全书（KEGG）药物和KEGG配体化合物数据库的6436和12730个小分子的过滤文库(28)分别针对两个LAT-1模型(和表S1). 先前显示，一些得分最高的配体是LAT-1配体，这增加了我们对结合位点模型的信心。例如，已知基底L（左）-Trp在KEGG LIGAND COMPOUND对接屏幕上排名第50位。手动分析了200（3.1%）KEGG药物和500（3.9%）KEG-COMPUND对我们的前两个模型的最高得分命中率。根据三个标准选择一种化合物进行实验测试：(我)与LAT-1复合物中已知配体对接姿势的相似性(28); (ii（ii）)其支架的化学新颖性，尤其是在得分最高的化合物中频繁出现时；和(三)其药理作用(28).
LAT-1配体的预测结合模式。预测对接屏幕中发现的已知底物色氨酸（绿线）和四种配体的结合模式。与配体发生极性相互作用的残基用棒子表示；碳原子为白色，氮原子为蓝色，氧原子为红色；氢键由灰色虚线表示。已知LAT-1配体色氨酸的预测姿势用绿线表示。所示化合物为3-碘-L（左）-酪氨酸(一)，3,5-二碘-L（左）-酪氨酸(B类)，芬克罗宁(C类)和杀螨素(D类). 发现的配体中的卤素原子被染成紫色（碘）和绿色（氯）。
预测配体的实验验证。
用人LAT-1 cDNA稳定转染HEK细胞，获得LAT-1过表达细胞系。HEK-LAT1细胞表达的LAT-1 mRNA水平比HEK-EV细胞高20倍，并显示LAT-1对既定系统L底物、加巴喷丁和L（左）-亮氨酸(图S3一–D类).十二种得分最高的分子被挑选出来进行实验测试顺式-抑制试验(,表S2、和). 通过测定每个分子在10和100μM浓度下抑制HEK-LAT1细胞中已知LAT-1底物转运的能力，将其作为LAT-1配体进行测试(和图S3E类). 已知的LAT-1抑制剂2-氨基双环-（2,2,1）-庚烷-2-羧酸（BCH）也作为阳性对照。在100μM时，对细胞内加巴喷丁积累的抑制范围为88%（3,5-二碘-L（左）-酪氨酸）至<10%（胱氨酸、甲苯咪唑和诺卡唑），含代谢物3,5-二碘-L（左）-酪氨酸和3-碘-L（左）-酪氨酸、色氨酸羟化酶抑制剂芬克罗宁和抗癌药物阿西维辛均显示出对加巴喷丁和L（左）-亮氨酸转运(和图S3E类). 使用JCDisimilarityCFTanimoto评分，阿昔霉素也获得了0.74的差异评分，该评分基于化学指纹计算分子之间的差异，表明它是一种化学上新颖的LAT-1配体(和材料和方法).
预测LAT-1配体的实验验证。预测的LAT-1配体通过顺式-抑制加巴喷丁摄取。(一)细胞与12个预测配体和一个阳性对照（BCH）在100μM（填充条）或10μM（开放条）浓度和加巴喷丁（1μM未标记和10 nM放射性标记）浓度下共培养。每个条形图描述了两到四个独立实验的平均值；误差条代表SEM(B类和C类)3,5-二碘对加巴喷丁（1μM未标记10nM放射性标记）积累的剂量依赖性抑制-L（左）-酪氨酸（IC50=7.9μM）和杀螨素（IC50=340μM）。每个点是两个或三个单独实验的平均值；误差条代表SEM。统计分析一采用单因素方差分析和Dunnett的多重比较测试*P（P）< 0.05.
通过测定IC进一步确定所选活性配体的效力50抑制HEK-LAT1细胞中加巴喷丁积累的值。集成电路50数值范围为7.9μM（3,5-二碘-l-酪氨酸；)至340μM（杀螨素；). 在10μM时，抑制加巴喷丁积累的范围从61%（3,5二碘-l-酪氨酸）到<10%，3,5-二碘-l酪氨酸和3-碘-l-酪氨酸显著抑制加巴喷丁转运(). 有趣的是，3,5-二碘-1-酪氨酸是比阳性对照BCH更强的抑制剂。总之，三分之一（12个中的4个）被选作实验测试的得分最高的分子是能够抑制加巴喷丁和L（左）-HEK-LAT1细胞中的亮氨酸转运。
LAT-1基板的识别。
通过以下方法进一步分析了HEK-LAT1细胞中显著抑制加巴喷丁积累的四种分子作为推测底物反式-刺激试验。该测定利用了LAT-1的强制性转运交换机制，通过交换细胞内L（左）-仅当其为LAT-1底物时，含有细胞外分子的预加载HEK-LAT1细胞中的亮氨酸。三种已知的LAT-1底物作为阳性对照，能够诱导L（左）-来自HEK-LAT1细胞的亮氨酸流出，包括L（左）-亮氨酸（43%）、加巴喷丁（36%）和BCH（30%）(). 相反，甘氨酸被用作阴性对照，因为已知它不是LAT-1底物，并且没有诱导任何L（左）-亮氨酸流出。在我们的顺式-抑制试验也诱导L（左）-亮氨酸流出。阿维星和芬克罗宁诱导L（左）-亮氨酸流出量分别为27%和29%，表明它们是通过LAT-1转运的。这些结果表明，在中枢神经系统中均具有药效作用的类药物分子阿昔单抗和芬克罗宁可能是LAT-1底物。令人惊讶的是，这两种更有效的LAT-1抑制剂，代谢物3,5-二碘-L（左）-酪氨酸和3-碘-L（左）-酪氨酸仅能诱导7.9%和5.4%L（左）-亮氨酸流出，分别表明它们是仅结合LAT-1但不通过LAT-1转运的抑制剂。最后，还研究了胍法辛和鲁非那胺，两者均未诱导显著性差异L（左）-亮氨酸流出。
预测配体的底物测定和细胞毒性表征。预测的LAT-1配体在顺式-抑制试验通过以下方法进行底物测定反式-刺激L（左）-亮氨酸流出（1μM未标记，10 nM放射性标记）。(一)细胞预先加载L（左）-随后添加浓度为1 mM的每种受试化合物诱导亮氨酸流出。加巴喷丁，L（左）-亮氨酸和BCH作为阳性对照，甘氨酸和胍法辛作为阴性对照。(B类)阿维辛（100μM）和3-碘的细胞毒性作用-L（左）-描述了针对T98G胶质母细胞瘤细胞稳定表达针对LAT-1（T98G-KD；填充条）或EV（T98G-EV；开放条）shRNA的酪氨酸（1 mM）。将细胞系和处理条件的细胞增殖归一化为处理第0天的细胞密度，然后在48小时进行溶媒对照处理。每个条形代表三个或四个单独实验的平均值，误差条形代表SEM一通过单因素方差分析和Dunnett的多重比较测试B类通过双向方差分析和Bonferroni校正进行多次测试*P（P）< 0.05.
抑制LAT-1依赖性细胞增殖。
LAT-1在各种癌细胞中高度表达，为它们提供营养物质和生长信号分子。因此，靶向癌症中LAT-1的药物可以是剥夺癌细胞营养物质或具有细胞内靶标的细胞毒性底物的抑制剂。因此，我们研究了选定的经验证的LAT-1配体的抗增殖作用，包括LAT-1底物阿维辛和抑制剂3-碘-L（左）-酪氨酸，通过高LAT-1表达GBM细胞系T98G的细胞增殖试验(8). 在对照细胞（T98G-EV）和LAT-1表达的细胞中测定了每个配体对细胞生长的LAT-1特异性作用(图S4一)和功能(图S4B类)击倒（T98G-KD）。抗癌药物阿维辛是T98G-EV（生长减少75%）比T98G-KD（生长降低51%）更有效的生长抑制剂(). 类似地，3-碘-L（左）-酪氨酸对T98G-EV细胞的作用更强，使其生长减少27%，而对T98G-KD细胞没有影响(). 这些结果表明3-碘-L（左）-酪氨酸和阿维辛能够通过两种不同的机制，包括营养剥夺和细胞毒性，以LAT-1依赖性的方式抑制癌细胞增殖。
讨论
我们的研究得出了三个关键发现。首先，与中枢神经系统中不同蛋白质相互作用的两个类药物分子也是LAT-1的底物。这一发现可能解释了这些药物穿透BBB到达中枢神经系统靶点的机制。这也为优化这两种药物的血脑屏障通透性提供了一个起点。其次，发现的两种LAT-1配体，包括一种抑制剂和一种底物，抑制癌细胞的增殖。这一结果表明，LAT-1可以通过不同的机制靶向癌症治疗，并揭示了进一步表征LAT-1在癌症中作用的化学工具。第三，经鉴定的LAT-1配体通过与多个靶点相互作用，实现其对中枢神经系统或癌症的药理作用（正或负）。这一发现表明，通过将建模和对接方法应用于包括路径和网络在内的整个系统，可以获得有效的治疗。我们依次采用三个关键发现中的每一个。
LAT-1–介导的BBB药物渗透性。
长期以来，被动扩散被认为是大多数药物通过血脑屏障渗透中枢神经系统的主要机制(31). 载体介导的转运对这一过程的贡献被认为是最小的，尽管不同类别的膜转运蛋白已被证明限制和/或促进药物、营养素和毒素进入中枢神经系统(32–34). LAT-1是一种已知的内流转运蛋白，可在血脑屏障中运输营养物质和外源性物质。在这项研究中，我们确定了两种以前未知的LAT-1底物，包括阿维辛和芬克隆宁，它们也可能通过LAT-1介导的转运穿过血脑屏障。发现两者都可能是LAT-1底物反式-刺激性研究()众所周知，这两种药物对中枢神经系统都有药效作用。尽管以前的研究使用反式-刺激以确定特定转运体是否可以运输不同的化合物(35–37)，该分析提供了间接证据，证明化合物可能是特定转运体的底物。然而，在一项临床试验中评估了阿昔洛韦对不涉及中枢神经系统的各种实体肿瘤的治疗效果，但由于中枢神经系统相关的毒性副作用（如嗜睡和精神错乱），这些试验均未通过(38). 此外，当同时给予阿昔洛韦与氨基酸混合物（包括原型LAT-1底物）时，这些副作用被逆转，L（左）-亮氨酸。这些观察结果高度暗示LAT-1在调节人类阿昔单抗的中枢神经系统通透性中的作用。第二种分子，芬克罗宁，是一种不可逆的色氨酸羟化酶抑制剂，用于消耗人类疾病动物模型中的中枢神经系统血清素水平(39). 结合我们的研究结果，LAT-1可能通过在BBB中运输芬克罗宁来调节CNS中的作用。因此，内流转运蛋白（如LAT-1）可能是中枢神经系统药物疗效和毒性的重要介质，对药物穿透血脑屏障的作用比先前认为的更大。
靶向LAT-1用于癌症治疗。
细胞代谢的变化与癌症密切相关。膜转运蛋白通过向转化细胞提供营养物质，在这种重新编程的代谢网络中发挥着关键作用。例如，葡萄糖转运蛋白（GLUT1；SLC2A1型)在各种癌症中上调，以提供葡萄糖作为碳源，以适应合成代谢细胞反应速度的增加，并维持有利于癌细胞的微生态系统(40). 此外，LAT-1通过输出通过谷氨酰胺转运体ASCT2带入癌细胞的谷氨酰胺，进口作为营养素和促增殖信号分子的必需氨基酸(10). 因此，针对LAT-1的治疗可以(我)选择性阻断LAT-1和/或ASCT2转运，剥夺癌细胞增殖所需营养素的抑制剂，或(ii（ii）)通过LAT-1和/或ASCT2进入细胞以作用于细胞内靶点的细胞毒性底物。在我们的筛选中发现了通过这些机制发挥作用的LAT-1配体(–和).
第一，3-碘-L（左）-酪氨酸是一种甲状腺激素衍生物，通常用于治疗激素缺乏症和作为放射性制剂。在这里，顺式-3-碘的抑制和细胞增殖实验-L（左）-酪氨酸作为有效的LAT-1抑制剂()减少T98G胶质母细胞瘤细胞的增殖()可能是由于LAT-1提供的营养物质使这些细胞饥饿。我们的结果表明，除了其可能的抗癌应用外，3-碘-L（左）-酪氨酸可作为诊断显像剂，用于识别与LAT-1上调相关的肿瘤和其他疾病状态(41).
第二，阿西维辛是一种具有抗肿瘤活性的细胞毒药物，靶向嘌呤和嘧啶生物合成中依赖谷氨酰胺的酰胺转移酶(42).变速箱-刺激和细胞增殖实验表明，acivicin可能是LAT-1底物()这表明LAT-1可以作为阿昔单抗进入肿瘤细胞的靶点。有趣的是，由于与CNS相关的毒性副作用，阿昔洛韦在各种临床试验（例如，用于晚期实体恶性肿瘤）中失败(38)或疗效不足(43). 因此，用LAT-1底物药物靶向肿瘤中的LAT-1可能不是一种合理的治疗策略，因为LAT-1也会促进药物进入中枢神经系统。然而，LAT-1的其他细胞毒性底物的设计，与有害的中枢神经系统作用无关，可能代表了一种可行的癌症药物开发策略。虽然细胞增殖实验表明，多种转运体可能会介导阿昔单抗在细胞内的积累，但T98G-KD和-EV细胞对阿昔单克隆抗体敏感性的显著差异清楚地表明，LAT-1对细胞增殖具有特异性影响，很可能是通过介导阿西单克隆抗体的摄取。
使用组合结构药理学方法瞄准生物系统。
虽然多臂医学可以用于改善各种神经系统疾病和癌症的治疗，但它也可能导致毒性。针对LAT-1模型的虚拟筛选确定可能通过与多个蛋白质相互作用实现药理作用的配体。目前设计治疗复杂疾病的试剂（包括药物或化学工具）的努力包括优化一个或多个分子对多个靶点的结合亲和力。配体发现的比较建模和分子对接的最新进展，再加上包括转运体在内的许多膜蛋白结构的测定，使我们能够通过基于结构的配体发现来靶向单个通路（例如mTOR）或器官（例如BBB）的多个组分。重要的是，一些新确定的结构代表不同的蛋白质构象，允许生物信息学根据不同构象的比较模型筛选小分子，以显示化学上不同的配体。例如，一种基于结构的方法预测，与GABA转运体2外向构象模型结合的分子在化学上与预测结合闭塞模型的分子不同(44). 因此，随着LAT-1同源物的更多结构被发现，我们的结果可以被改进，以确定新的LAT-1配体，用于有效治疗和研究中枢神经系统疾病和癌症。
总之，我们基于远亲原核同源物的原子结构构建了LAT-1的结构模型。然后根据这些模型对两个含有内源性代谢物和处方药的小有机分子库进行了虚拟筛选。通过实验测试了一些排名靠前的对接命中，确定了四种先前未知的LAT-1配体：3,5-二碘-L（左）-3-碘酪氨酸-L（左）-酪氨酸、芬克罗宁和阿西维辛。此外，杀螨素和3-碘-L（左）-在GBM癌细胞系中发现酪氨酸具有LAT-1介导的抗增殖作用。这些发现为阐明膜转运蛋白作为潜在药物靶点以及在调节组织对小分子有机物的渗透性方面的作用提供了化学工具。需要进一步研究来阐明这些配体与LAT-1相互作用的机制。
材料和方法
比较模型构建。
根据精氨酸/胍基转运体AdiC的X射线结构，使用MODELLER-9v11对LAT-1进行建模大肠杆菌在向外封闭的精氨酸结合构象中[蛋白质数据库（PDB）ID代码3L1L](17). 我们还根据来自詹纳西伊先生向内-阿波罗构造（PDB ID代码3GI9）（参考。16;SI材料和方法). 我们依赖于已公布的路线(15)以及从Promals3D服务器获取的路线(45)间隙主要存在于预测的细胞外循环中，但不仅存在于预测细胞外环中，并且通过人工调整(SI材料和方法和图S1). 对于每个模板结构和对齐，使用MODELLER-9v11的标准“automodel”例程生成100个模型(46). 使用Z-DOPE（基于已知蛋白质结构的归一化原子距离相关统计势）对初始模型进行评估(26). 对于选定的LAT-1模型，通过使用Scwrl4重新包装固定主干上的侧链来优化结合位点(47). 虚拟筛选的最终模型是根据其利用配体闭锁计算得出的富集曲线区分已知配体和诱饵化合物的能力来选择的(SI材料和方法) (28,29,48). 这些最终模型也基于残留物疏水性进行了评估(49)和进化保护概况(SI材料和方法和图S5) (50).
虚拟筛选和配体对接。
使用半自动对接程序对LAT-1模型进行虚拟筛选(29)依赖DOCK 3.5.54(51). 数据库分子的对接姿势根据DOCK分数进行排序，DOCK得分是范德瓦尔斯、泊松-玻尔兹曼有限差分静电和配体脱溶惩罚项的总和。通过肉眼检查来自每个对接屏幕的500种最高等级化合物的位置，以确定用于实验测试的化合物的优先级(SI材料和方法) (28,48).
化学相似性计算。
使用Instant JChem（5.7.0版；ChemAxon）首次评估了热门歌曲的化学新颖性。具体地说，我们计算了ChEMBL数据库中的顶级小分子点击和44个已知LAT-1配体之间的化学差异性测量值JCDissimilarityCFTanimoto(52)和UniProt(53)以及文学作品(1); 预测的值大于0.7的配体被归类为化学新配体。
细胞系。
按照制造商的说明，通过使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）转染含有全长人类LAT-1 cDNA（HEK-LAT1）和空载体（HEK-EV）的pcDNA5/FRT（Invit罗gen）载体，建立稳定转染的HEK 293细胞。将转染的细胞保存在DMEM-H21中，DMEM-H21含有10%（vol/vol）FBS、100单位/mL青霉素、100µg/mL链霉素和200µg/mL潮霉素B，温度为37°C，CO浓度为5%2.通过感染2×10，产生稳定的LAT-1敲除细胞5加州大学旧金山分校（UCSF）慢病毒RNAi核心产生的T98G GBM细胞慢病毒(54)携带表达绿色荧光蛋白（GFP）的pSicoR载体和抗LAT-1 shRNA（T98G-KD；表S3)或感染倍数等于10的空载体（T98G-EV）。感染一周后，UCSF综合癌症中心的细胞分析实验室通过荧光激活细胞分选（FACS）分析分离GFP+细胞。GFP+T98G-KD和T98G-EV细胞经LAT-1 RNA和功能敲除验证，如SI材料和方法T98G、T98G-KD和T98G-EV细胞保存在含有10%FBS、100单位/mL青霉素和100µg/mL链霉素的DMEM-H21中，温度为37°C和5%CO2.
抑制[三H] -加巴喷丁吸收。
按照说明进行摄入研究(55). 简单地说，HEK-LAT1细胞以2×10的密度接种5poly中每孔的细胞数-D类-赖氨酸涂层24孔板（BD Falcon）并生长到80-90%的汇合处。用预先加热的无钠胆碱缓冲液在pH 7.4（140 mM氯化胆碱、2 mM氯化钾、1 MgCl）下冲洗细胞2mM，1氯化钙2mM，1 M Tris），然后在含有1μM未标记加巴喷丁和10 nM的0.3 mL预热胆碱缓冲液中培养[三H] -加巴喷丁（美国放射性标记化学品）在37°C下，在10μM和100μM试验化合物（Sigma-Aldrich）存在下放置3分钟。用1.0 mL冰镇胆碱缓冲液洗涤细胞两次，然后添加700μL裂解缓冲液（0.1%SDS vol/vol，0.1 N NaOH），终止反应。细胞内放射性通过闪烁计数测定，并通过双钦酸蛋白质测定法（Pierce）测定每孔蛋白质含量。在与单点测量相同的条件下测量浓度依赖性抑制。用0.5、1、10.0、50.0、100.0和200.0μM 3,5二碘代烷孵育细胞-L（左）-酪氨酸或10.0、50.0、100.0、400.0、800.0和1600.0μM抗坏血酸。50%的浓度[三H] -加巴喷丁积累被抑制（IC50)通过使用GraphPad Prism（5.0版）拟合数据进行计算。
变速箱-刺激[三【H】-L（左）-亮氨酸流出。
变速箱-刺激性研究通过监测细胞内L（左）-通过细胞外添加已知或推测的LAT-1底物刺激HEK-LAT1细胞的亮氨酸流出。HEK-LAT1细胞在相同的抑制实验条件下接种。用预热的胆碱缓冲液冲洗细胞，然后用[三【H】-L（左）-亮氨酸（Perkin Elmer），通过在37°C下将细胞在0.3 mL预温胆碱缓冲液中孵育5分钟，该缓冲液含有1μM未标记和10 nM放射性标记的底物。用1.0 mL冰镇胆碱缓冲液洗涤细胞两次，终止摄取，并且[三【H】-L（左）-然后通过在37°C下在预热的胆碱缓冲液中加入1mM测试化合物（Sigma-Aldrich）1分钟来诱导亮氨酸流出。变速箱-用1.0 mL冰镇胆碱缓冲液洗涤细胞两次，然后添加700μL裂解缓冲液（0.1%SDS vol/vol，0.1 N NaOH），终止刺激。如上所述测定细胞内放射性。
细胞增殖试验。
T98G-KD和-EV细胞接种于2.5×10三96周平板中每孔的细胞数（康宁生命科学公司），第二天将细胞暴露于含有药物或载体（0.85%盐水溶液）的生长培养基中48小时。在治疗当天和治疗后48小时，使用CellTiter-Glo细胞活力试剂盒（Promega）测量细胞密度根据制造商的说明。细胞裂解物被转移到白色不透明的96-well板上（科宁生命科学公司），生物发光在Globax光度计（Promega）上测量。首先将48小时后每个细胞系的增殖归一化为治疗日（0小时）测得的密度，然后将药物与载体治疗归一化。
统计分析。
数据分析采用单因素方差分析、Dunnett多重比较检验、双向方差分析、Bonferroni校正多重检验或双尾非配对检验t吨测试。概率值<0.05被认为具有统计学意义。
