肝素杂志。作者手稿；PMC 2014年3月1日提供。
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NIHMSID公司：美国国立卫生研究院423967
miR-122通过靶向肝星状细胞和抑制P4HA1表达调节胶原蛋白生成
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姜丽
1美国宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学药学院药物科学系药物遗传学中心，邮编15261
穆罕默德·加兹瓦尼
1美国宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学药学院药物科学系药物遗传学中心，邮编15261
张一飞
1美国宾夕法尼亚州匹兹堡大学药学院药物科学系药物遗传学中心，邮编15261
陆建勤
1美国宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学药学院药物科学系药物遗传学中心，邮编15261
李吉龙
1美国宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学药学院药物科学系药物遗传学中心，邮编15261
杰凡
2美国宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学外科，邮编15261
Chandrashekhar R.甘地
2美国宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学外科，邮编15261
三美国宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学医学院托马斯·斯塔兹尔移植研究所，邮编15261
宋丽
1美国宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学药学院药物科学系药物遗传学中心，邮编15261
1美国宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学药学院药物科学系药物遗传学中心，邮编15261
2美国宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学外科，邮编15261
三美国宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学医学院托马斯·斯塔兹尔移植研究所，邮编15261
*通讯作者。地址：美国宾夕法尼亚州匹兹堡市索尔克霍尔637号匹兹堡大学药学院药物科学系药物遗传学中心，邮编15261。电话：+1 412 648 8540；传真：+1 412 648 1664（J.Li）。匹兹堡大学药学院药物科学系药物遗传学中心，美国宾夕法尼亚州匹兹堡索尔克霍尔639号，邮编15261。电话：+1 412 383 7976；传真：+1 412 648 1664（S.Li）。ude.ttip@53lij（J.Li），ude.ttip@4los（S.李） - 补充资料
1
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摘要
背景和目标
微RNA（MicroRNAs，miRNAs）已被证明通过影响其靶基因表达而参与许多生物过程。miR-122在肝癌发生中已被广泛研究。然而，miR-122在肝纤维化中的作用尚不清楚。
方法
mRNA表达水平miR-122型，脯氨酰4-羟化酶亚基α-1(第4页第1页)和CCAAT/增强子结合蛋白α(C/EBPα)通过实时PCR进行评估。采用Western blot和免疫荧光分析P4HA1、C/EBPα和I型胶原α1（COL1A1）的蛋白表达水平。MTT法检测细胞增殖。染色质免疫沉淀（ChIP）法检测C/EBPα与miR-122启动子的结合活性。
结果
miR-122在反式激活HSC和CCl治疗小鼠的肝脏中的表达显著降低4miR-122的过度表达抑制了LX2细胞的增殖。我们还证明了P4HA1型是miR-122的靶基因。mRNA表达水平巴基斯坦航空公司1在HSC和小鼠肝脏中与miR-122呈负相关。miR-122的过度表达通过靶向位于3′-UTR的结合位点显著减弱P4HA1的表达P4HA1型mRNA。我们进一步表明，miR-122过度表达导致胶原蛋白成熟度和ECM生成降低。最后，活化的HSC中C/EBPα与miR-122启动子的结合活性显著降低。
结论
我们的研究表明，miR-122可能在负性调节HSC胶原生成中发挥重要作用，并且在HSC中靶向表达miR-122可以代表一种治疗肝纤维化的新策略。
关键词：miRNAs、miR-122、HSC、P4HA1、胶原成熟、肝纤维化
介绍
miRNAs是真核细胞中发现的短核糖核酸（RNA）分子，通过与靶基因mRNAs的3′-非翻译区（3′-UTR）结合来调节基因表达，以抑制蛋白质翻译或诱导mRNA降解[1]. 到目前为止，已经鉴定出数百种miRNAs。据估计，它们针对大约60%的哺乳动物基因[2]. 对动物模型中特异性miRNAs的研究已经确定了miRNA在诸如发育、细胞增殖、分化和凋亡等细胞功能中的不同作用[三].
肝硬化是世界范围内发病率和死亡率的主要原因，治疗方案有限。这种晚期肝病是对各种原因的初始肝损伤作出病理反应的结果[4]. 肝损伤后，HSC经历一个从储存脂肪的静止表型到高度增殖的肌纤维母细胞表型的激活过程，纤维生成活性显著增加[5]. 过度细胞外基质（ECM）蛋白的积累导致肝纤维化，器官功能受损[6]. 肝纤维化的发病机制和进展是复杂的，可能因潜在病因而异。越来越多的证据表明，某些miRNAs在肝纤维化的不同阶段，包括HSC的激活中起着关键作用[7]，它们的扩散[8]和ECM蛋白的生产[9]. 曼恩的研究等。[7]表明miR-132在HSC的反式激活过程中被显著抑制。miR-132似乎通过负调控编码甲基-CpG结合蛋白2的MeCP2来抑制HSC激活。MeCP2活性增加导致PPAR-γ表达沉默，PPAR-β是HSC反式激活的有效阻断剂。罗德堡等。[9]据报道，在几种肝纤维化小鼠模型中，miR-29家族成员在活化的HSC中显著下调。miR-29成员负调控各种纤维素酶相关基因的表达，包括第1A1列通过靶向其mRNA的3′-UTR[9,10]. 他们进一步表明，NF-κB和/或TGF-β信号的激活在降低活化的HSC中miR-29a的表达方面发挥了重要作用，表明miR-29在NF-κ的B/TGF-[9]. 在Ji的另一项研究中等。[8]miRNA-27a和27b在活化的HSC中表达下调，两种miRNAs在活化HSC中的过度表达导致部分逆转为静止表型。
miR-122是最丰富和肝脏特异性的miRNA，占成人肝脏总miRNA的72%[11]. 已经证明它在调节肝细胞生长发育中发挥作用[12]，差异化[13]，和新陈代谢[14]. miR-122在肝硬化等晚期肝病中降低[15]和肝细胞癌[16]. 其中的老鼠miR-122型在肝细胞中选择性删除，显示脂质代谢改变、肝脏炎症、纤维化和肝细胞癌的高发病率[17,18]. 然而，miR-122在HSC中的作用及其在肝纤维化中的意义尚不清楚。在本研究中，我们表明miR-122是一种重要的miRNA，通过靶向P4HA1参与胶原成熟的调节。miR-122也可能调节HSC的增殖。我们的研究结果表明，miR-122可能在负性调节HSC胶原生成中发挥重要作用，并且在HSC中靶向表达miR-122可以代表一种治疗肝纤维化的新策略。
材料和方法
动物和HSC隔离
来自Charles River Laboratories（马萨诸塞州威明顿）的雄性Sprague-Dawley大鼠用于分离HSC。所有程序都经过匹兹堡大学动物护理和使用委员会的审查和批准。如前所述，分离原代大鼠HSC，并在分离3天后用作静止细胞。分离的HSC纯度>90%[10]. HSC培养7天以允许反式激活。通过腹腔注射四氯化碳（CCl）建立小鼠肝纤维化模型4; 默克公司；0.6 ml/kg体重），每周两次，持续六周。根据文献进行胆总管结扎术[9]. 假手术大鼠作为对照。
miRNA分离和干环实时RT-PCR
所有试剂盒和试剂均来自Applied Biosystems（加利福尼亚州福斯特市）。使用miRVana-miR-NA分离试剂盒从HSC中分离出富含miRNAs的总RNA。为了检测miRNA-122的表达，根据制造商的说明进行了干环实时RT-PCR（SLqRT-PCR）。通过三个不同的实验计算相对miRNA表达。
细胞培养和miRNA转染
LX-2，永生人类HSC线[24]由纽约西奈山医学院S.L.Friedman博士亲切提供。LX-2细胞按照我们之前的报道进行了培养和转染[10].
细胞增殖
将LX-2细胞接种在96孔板上，并用miRNA转染。根据制造商的说明，使用MTT（印第安纳波利斯罗氏诊断公司）检测细胞增殖和细胞存活。
生物信息学分析
使用靶扫描4.1、miRNADA和Microosm分析miR-122序列的预测靶基因。
RNA分离和qRT-PCR
使用TRIzol从HSC中分离出总RNA，并根据制造商的说明合成cDNA（Invitrogen，加州圣地亚哥）。的引物P4HA1型,胶原蛋白1A1,Bcl-w公司,IGFR-1、HNF4、C/EBPα、 以及GAPDH公司来自MWG Biotech。使用ABI Prism 7300（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）合成第一链cDNA，然后合成SYBR绿色qRT-PCR。我们分析了相对表达，并从三个不同的实验中收集了数据，正如我们之前所报道的那样[10].
蛋白质印迹分析
按照我们公布的方法，使用抗COL1A1、抗P4HA1、抗C/EBPα和抗β-肌动蛋白抗体（圣克鲁斯生物技术公司）进行蛋白质印迹[10].
免疫荧光
LX-2细胞在培养箱载玻片上生长，如前所述进行miR-122转染。转染后36小时，在室温下将LX-2细胞固定在4%多聚甲醛/PBS中15分钟，并用PBS清洗三次。用2%牛血清白蛋白在PBS中封闭细胞1小时，然后用抗COL1A1抗体（圣克鲁斯生物技术公司）（1:200）在4°C下培养16小时。用PBS洗涤后，应用FITC-标记的二级抗体（1:1000）并孵育60分钟。再次洗涤后，安装细胞并通过荧光显微镜进行分析。
染色质免疫沉淀（ChIP）分析
如前所述进行ChIP分析[10]. 用于扩增miR-122启动子上含有推测C/EBPα结合位点的片段的引物序列如所示补充表1简单地说，在37°C下用1%甲醛处理静止和活化的细胞10分钟。裂解后，对裂解产物进行超声波处理，将DNA剪切至200至1000 bp的长度。剪切后的染色质用于与正常兔IgG（阴性对照）或5μg抗C/EBPα（14AA，Santa Cruz Biotechnology）免疫沉淀。洗涤、洗脱和去交联免疫沉淀物。蛋白质和RNA经蛋白酶K和核糖核酸酶A降解后，用QIAquick PCR纯化试剂盒（QIAGEN）纯化DNA。在7300实时PCR系统（Applied Biosystems）上，使用SYBR Green Master Mix（应用生物系统）进行实时PCR。
统计分析
所有实验均进行了三次，至少三次。数据表示为平均值±SEM，并使用方差分析和纽曼-凯尔斯检验进行组间多重比较。对<0.05被认为具有统计学意义。
结果
miR-122在活化的HSC和纤维化肝脏中下调
miR-122是肝脏中最丰富的miRNA，在晚期肝病中，如原发性胆汁性肝硬化（PBC）和肝细胞癌（HCC），其在肝脏中的表达降低[14,15]. 为了进一步研究miR-122在肝纤维化中的作用，我们检测了经CCl治疗的小鼠miR-122的表达水平4持续6周，该方案可重复产生肝纤维化。显示重复的CCl4治疗导致小鼠肝脏中miR-122的显著下调。这一结果与PBC患者的观察结果相似[14].
miR-122在活化的HSC和纤维化肝脏中下调（A） CCl处理的小鼠肝脏中miR-122的表达降低4（B）培养激活的大鼠HSC中miR-122的表达降低。（C） CBDL激活的大鼠HSC中miR-122的表达降低。用qPCR检测miR-122的表达。n=每组6个。结果表示为平均值±SE。对<0.05.
所有关于miR-122在肝脏疾病中的研究都检测了其在完整肝脏或培养肝细胞中的表达。目前对miR-122在HSC中的表达及其在慢性肝病（如肝纤维化）中的意义知之甚少。因此，我们检测了miR-122在分离的、静止的大鼠HSC中的表达，并将其与分离的大鼠肝细胞中的表达进行了比较。miR-122在LX2细胞（一种永生化人肝星状细胞系）中的表达也进行了检测。我们的数据显示，miR-122在人和大鼠HSC中都有组成性表达，尽管表达水平相对低于肝细胞中的表达水平(补充图1). 然而，培养诱导激活后，miR-122在大鼠HSC中的表达显著下调(). CBDL后3周，从大鼠分离的HSC中miR-122的表达水平也显著降低().
miR-122过度表达抑制HSC增殖
鉴于激活的HSC中miR-122的表达减少，我们接下来评估了miR-122对LX2细胞的直接作用。用miR-122或对照miRNA瞬时转染LX2细胞。转染5天后，用MTT法检测细胞增殖。如所示与对照组相比，miR-122的过度表达导致细胞增殖受到中度抑制。在血清剥夺条件下进行此实验时，观察到类似的细胞生长抑制().
miR-122过度表达抑制HSC增殖（A） 用miR-122或对照miRNA转染LX2细胞。转染5天后，用MTT法检测细胞增殖。（B） 按照上述方法对细胞进行转染，然后去除血清。剥夺血清72小时后，用MTT法检测细胞增殖。（C）Bcl-w公司和IGFR-1型用qPCR检测miR-122转染LX-2细胞的mRNA表达。数值为三个独立实验的平均值±SE(对<0.05). U.T，未经治疗。
Bcl-2家族成员的过度表达和IGF-1信号增强已被证明在活化星形细胞的高增殖率中起作用[19,20].Bcl-w公司和IGFR-1型是miR-122的两个靶基因[21,22]. 因此，我们检测了miR-122对小鼠骨髓基质细胞mRNA表达水平的影响Bcl-w公司和IGFR-1型.显示用miR-122处理LX2细胞导致两个基因的mRNA表达水平显著下调，这表明密件抄送和IGFR-1型miR-122下调介导的生长抑制。
miR-122通过靶向P4HA1 mRNA的3′-UTR下调P4HA1的表达
在证明miR-122对HSC的生长抑制作用后，我们研究了miR-122是否也影响活化HSC的成纤维活性。初步研究表明，在LX-2细胞中miR-122的过度表达对许多纤维素酶相关基因的mRNA表达没有影响，包括第1A1列(). 这些数据与使用多种算法（Targetscan 4.1、MiRnada和Microosm）进行的生物信息学分析的结果一致，表明它们都不是miR-122的预测目标基因。然而，P4HA1型，编码脯氨酰4-羟化酶的一个组分，脯氨酸4-羟化化酶是胶原蛋白成熟的关键酶，被鉴定为miR-122的一个潜在靶基因。这促使我们检测P4HA1在纤维化肝脏和活化的HSC中的表达水平，并将其表达水平与miR-122的表达水平相关联。表明小鼠肝脏中P4HA1的表达在这两个mRNA上都显著增加()和蛋白质()CCl后的液位4治疗。小鼠纤维化肝中P4HA1的表达水平与miR-122的表达水平呈负相关(). mRNA也观察到类似的结果()和蛋白质表达()培养诱导激活后原代大鼠HSC中P4HA1的表达。P4HA1的表达在这两个mRNA上也显著上调()和蛋白质()CBDL后3周大鼠分离的HSC中的水平。为了研究P4HA1的表达是否确实受到miR-122的调控，我们检测了转染miR-122前后P4HA1在mRNA和蛋白质水平上的表达。如所示miR-122的过度表达显著降低了LX-2细胞中P4HA1的mRNA水平。相反，对照miRNA对P4HA1型mRNA表达。miR-122还以序列特异的方式在蛋白质水平抑制P4HA1的表达()miRNAs通过与特定mRNAs的3′-UTR结合并触发mRNA降解或翻译抑制来调节靶基因的表达。生物信息学分析表明miR-122在3′-UTR中存在一个假定的靶位点P4HA1型mRNA。确认是否P4HA1型确实是HSC中miR-122的直接靶点，是一个约1000-bp的片段P4HA1型将含有假定靶序列的3′-UTR克隆到荧光素酶报告载体（pmiR-122-wt）中(补充图2). 类似地构建了一个控制报告质粒，其中假定的靶位点被删除(补充图2). 然后检测miR-122对CV-1细胞中每个构建体的荧光素酶活性的影响。如所示，miR-122抑制pmiR-122-wt的萤光素酶活性约50%。miR-122抑制剂对报告基因表达没有显著影响，这可能是由于CV-1细胞中内源性miR-122表达水平非常低。当miR-122的假定结合位点从克隆中删除时，miR-122对报告基因表达的抑制作用基本上被消除P4HA1型3′-UTR片段(). 这些数据强烈表明P4HA1型是miR-122的直接靶点。
miR-122通过靶向3′-UTR下调P4HA1的表达第4页第1页信使核糖核酸（A） qPCR检测miR-122转染细胞中胶原1A1的mRNA表达。n=每组6个。CCl患者肝脏P4HA1的（B和C）mRNA（B）和蛋白（C）表达水平4-用qPCR和Western blot分析经处理或经油处理的CD-1小鼠。n=每组6个。用qPCR和Western blot分析培养的活化HSC中P4HA1的（D和E）mRNA（D）和蛋白（E）表达水平。n=每组6个。用qPCR和Western blot分析CBDL激活的HSC中P4HA1（F和G）mRNA（F）和蛋白（G）的表达水平。n=每组6个。用miR-122模拟物或非特异性对照miRNA模拟物转染（H和I）HSC。P4HA1型24 h后（h）用qPCR分析mRNA表达；治疗后36 h，用Western blot检测P4HA1的蛋白表达水平（I）。n=3。第页<0.05 (与。控制miRNA）。（J） 用荧光素酶构建物转染HSCP4HA1型-3′-UTR，在存在miR-122模拟物或非特异性对照miRNA模拟物的情况下。转染24小时后进行荧光素酶检测。（K） HSC转染有P4HA1型-在存在miR-122模拟物或非特异性对照miRNA模拟物的情况下，构建具有miR-122结合位点缺失的3′-UTR荧光素酶。转染24小时后进行荧光素酶检测。面板中显示的数据代表平均值±SE。n=3；对<0.05 (与。控制miRNA）。U.T，未经治疗。
上述数据表明，HSC的激活与miR-122的下调和P4HA1的上调有关。已知TGF-β信号传导在HSC激活中起关键作用。然后我们检测了TGF-β治疗对静止大鼠HSC中miR-122和P4HA1表达的影响。与以前的报告一致，TGF-β治疗导致了大鼠脑组织mRNA表达水平的显著增加第1A1列(补充图3A). TGF-β治疗HSC也导致miR-122表达降低，同时P4HA1表达上调(补充图3B和C)，提示TGF-β信号在调节miR-122表达中的潜在作用。
miR-122的过度表达导致胶原蛋白成熟度降低
P4HA1型编码脯氨酰4-羟化酶的一种成分，脯氨酰4-羟化酶是一种关键参与胶原翻译后修饰（成熟）的酶。如所示miR-122的过度表达对Col1A1的mRNA水平没有影响。然后我们研究了miR-122是否影响HSC中成熟Col1A1的合成。结果表明，与对照组相比，miR-122转染细胞中成熟Col1A1的蛋白表达显著降低。细胞外I型胶原的免疫荧光染色显示，miR-122过表达细胞和对照miRNA处理细胞的染色模式存在显著差异(). 与对照组细胞分泌的胶原纤维相比，miR-122转染细胞分泌的I型胶原纤维稀疏且染色较弱(). 这些结果表明，miR-122的过度表达抑制了HSC中胶原蛋白的成熟。
miR-122过度表达降低胶原蛋白成熟用miR-122模拟物或非特异性对照miRNA模拟物转染HSC。转染后36小时，（A）用Western blot分析成熟Col1A1的表达，（B）在不渗透的情况下对I型胶原进行免疫荧光染色。棒材：50μm。U.T，未经治疗。
HNF4和C/EBPα表达减少在纤维化肝和活化HSC miR-122表达下调中的潜在作用
据报道，miR-122受多种肝脏富集转录因子调节，包括C/EBPα和肝细胞核因子4（HNF4）[12]. 为了初步了解miR-122表达下调的潜在机制，我们检测了小鼠纤维化肝和活化大鼠HSC中C/EBPα和HNF4的表达水平。如所示，CCl后小鼠肝脏中两种转录因子的mRNA水平均显著降低4治疗。培养激活的大鼠HSC中C/EBPα的mRNA表达也降低(). 此外，C/EBPα的表达在两种mRNA上均显著下调()和蛋白质()CBDL激活的HSC中的水平。在静止的大鼠HSC中，HNF4表达低于检测限，当细胞被反式激活时仍无法检测到（数据未显示）。
C/EBP表达减少一激活的HSC中可能导致miR-122的低表达（A和B）mRNA表达水平HNF-4型（A） 和C/EBPα（B） ，在CCl的肝脏中4-用qPCR分析经处理或经油处理的CD-1小鼠。n=每组6个。（C和D）mRNA表达水平C/EBPα用qPCR检测培养中激活的HSC（C）和CBDL激活的HSCs（D）。n=每组6个。结果表示为平均值SE*对<0.05. （E） Western blot检测CBDL激活的HSC中C/EBPα的蛋白表达水平。每组n=6。（F） 用ChIP法分析CBDL激活的大鼠HSC中C/EBPα与miR-122启动子的结合活性。用qPCR分析含有推测C/EBPα结合位点的片段。结果表示为平均值SE*对<0.05.
为了进一步确定C/EBPα转录活性降低在miR-122下调中的作用，我们检测了静止和活化大鼠HSC中C/EBPβ与miR-122启动子的结合活性。如所示与静止的HSC相比，活化的HSC中C/EBPα与miR-122启动子的结合活性显著降低，这可能有助于下调活化HSC中miR-122的表达。
讨论
在这项研究中，我们在HSC中发现了一个新的miR-122调节电路，可能与肝纤维化的发病机制和进展有关。我们的数据表明，miR-122通过下调P4HA1型它编码脯氨酰4-羟化酶的一个组分。此外，miR-122可能通过抑制活化HSC的增殖间接抑制肝纤维化。
据报道，各种miRNAs通过不同的机制调节肝纤维化。一些miRNAs通过抑制HSC的反式激活来抑制肝纤维化（例如，miR-27a，b[8])或促进活化HSC的凋亡（例如miR-15、16[23])而另一些则通过直接调节各种ECM基因的mRNA表达水平来调节肝纤维化[10]. 例如，miR-29家族成员通过靶向一些纤维素酶相关基因mRNA的3′-UTR来抑制肝纤维化[10]. 我们的研究揭示了miRNA-122通过靶向参与胶原成熟过程的脯氨酰4-羟化酶控制肝纤维化的新机制。
胶原蛋白是细胞外基质的主要成分，胶原蛋白的合成始于粗糙内质网核糖体上胶原蛋白mRNA的翻译以及脯氨酸残基通过脯氨酸4-羟化酶羟基化为羟脯氨酸[24]. 经过几次修饰后，形成了具有三个螺旋的前胶原，并被运输到高尔基复合体，以便分泌颗粒中的细胞外分泌[25]. 脯氨酸羟基化在稳定胶原蛋白分子的三螺旋结构中起着重要作用。抑制脯氨酰4-羟化酶产生不稳定的胶原蛋白，与胶原蛋白生成减少相关[26]. 一些脯氨酰4-羟化酶抑制剂已被开发出来，并作为治疗肝纤维化的新疗法进行了检测[27,28]. 脯氨酰4-羟化酶的表达受多种促炎分子调节，包括几种细胞因子[29]. 然而，人们对miRNAs在脯氨酰4-羟化酶调节中的作用知之甚少。我们的数据表明miR-122负调控HSC中脯氨酰4-羟化酶的表达。在小鼠纤维化肝和大鼠活化的HSC中，P4HA1 mRNA表达显著增加，与miR-122呈负相关。miR-122在HSC中的过度表达导致P4HA1在mRNA和蛋白质水平上的表达显著下调。报告者分析表明，miR-122是针对3′-UTR的第4页第1页信使核糖核酸。我们进一步表明，miR-122的过度表达导致了成熟Col1A1生成的显著抑制，这是由Western分析确定的。细胞外I型胶原的免疫荧光染色显示，与对照组细胞分泌的I型胶原纤维相比，miR-122转染细胞分泌的Ⅰ型胶原纤维稀疏且染色较弱。综上所述，我们的数据强烈支持miR-122通过靶向性阻断胶原蛋白成熟过程的观点P4HA1型mRNA。
目前尚不清楚调控HSC中miR-122表达的机制。然而，对肝细胞的研究表明，许多转录因子参与miR-122的调控，包括C/EBPα、HNF1α、FoxA2和HNF4α[22,30]. 为了研究这些转录因子是否同样参与HSC中miR-122表达的调节，我们检测了小鼠纤维化肝和活化大鼠HSC中C/EBPα和HNF4的表达水平。我们的数据显示，HNF4在静止的大鼠HSC中的表达低于检测极限，并且在细胞被反式激活时仍无法检测到。这与HNF4是肝细胞特异性转录因子的观点一致。然而，C/EBPα在静止的HSC中有组成性表达，在活化的HSC其表达显著下调。ChIP分析表明，C/EBPα与两个大鼠原代HSC中miR-122基因启动子中的一个假定结合位点结合()和人类LX2细胞（数据未显示）。更重要的是，与静止细胞相比，活化的HSC中C/EBPα与miR-122启动子的结合活性显著降低。这些数据表明C/EBPα转录活性降低在HSC激活期间miR-122下调中可能起作用。已有研究表明，TGF-β抑制脂肪细胞中C/EBPα和PPAR-γ的表达[31]. 我们的数据显示TGF-β治疗导致miR-122表达下调(补充图3). 这些结果表明TGF-β/C/EBPα信号可能在肝星状细胞miR-122负调控中发挥作用，这需要进一步研究。
除了阻止胶原蛋白成熟外，miR-122在抑制活化的HSC增殖方面也表现出中等作用。作为了解机制的初步途径，我们检测了miR-122对Bcl-w和IGFR-1表达的影响，因为增强的Bcl-2和IGFR信号与活化HSC的快速增殖有关，而Bcl-w和IGFR-1是miR-122的两个靶基因。我们的结果表明，miR-122治疗导致两个基因的表达显著下调。miR-122通过调节几种肿瘤发生相关蛋白，包括ADAM10、IGF1R、CCNG1和ADAM17，在肝癌细胞中也有类似的生长抑制作用[32–34]. 需要进一步研究miR-122介导的HSC生长抑制机制。尽管如此，这可能有利于miR-122的整体抗纤维化作用，因为诱导活化HSC的凋亡是逆转或减少肝纤维化变化的有效策略之一[35].
总之，我们已经表明，miR-122在活化的HSC中的表达水平显著降低，这可能通过上调脯氨酰4-羟化酶的表达和随后过度交联胶原蛋白的产生而促进肝纤维化的发展。值得注意的是，miR-122在原发性胆汁性肝硬化患者的肝脏中下调[15]以及CCl治疗小鼠的肝脏4[36]. 我们认为miR-122靶向肝脏，特别是HSC，可能是治疗肝纤维化的一种新的治疗方法。
致谢
财政支持
NIH拨款HL091828和匹兹堡大学中央研究发展基金的拨款。
我们感谢纽约西奈山医学院S.L.Friedman博士慷慨捐赠LX2细胞。
缩写
| miR公司 | 微小RNA |
| P4HA1型 | 脯氨酰4-羟化酶亚基α-1 |
| C/EBPα | CCAAT/增强子结合蛋白α |
| 第1列 | 胶原蛋白，I型，α1 |
| 高速列车 | 肝星状细胞 |
| CCl公司4 | 四氯化碳 |
| 3′-UTR | 3′-非翻译区 |
| 电解加工 | 细胞外基质 |
| 中国人民银行 | 原发性胆汁性肝硬化 |
| 肝癌 | 肝细胞癌 |
| HNF4型 | 肝细胞核因子4 |
参考文献
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