疾病相关者（GGGCCC）_n个从重复C9或72基因形成依赖于通道长度的单分子和多分子RNA G-四链体结构^*

摘要

介绍

肌萎缩侧索硬化症（ALS），⁴常被称为Lou Gehrig病，是一种致命的神经退行性疾病(1). ALS是包括额颞叶痴呆（FTD）在内的一系列疾病的一部分(2). 最近有报道称，（GGGCC）_n个·（GGCCCC）_n个在非编码区域内重复C9或72可能导致ALS和FTD(三,4). 未受影响的个体有2到19次重复，而受影响的个人有250到1600次重复，并且症状可能只有20到22次重复(5). 这个C9或72扩增重复序列的转录物异常聚集成RNA核焦点(4). 这表明ALS-FTD可能与r（CUG）的强直性肌营养不良症共享一条有毒的RNA致病途径_n个含有RNA的重复序列螯合与扩增的重复序列结合的MBNL1蛋白。这个C9或72重复扩张是遗传性ALS-FTD最常见的原因(三,4).

基因特异性重复序列的扩增是许多神经和神经肌肉疾病的诱因突变，包括强直性肌营养不良1型（DM1）脆性X型A、脆性X震颤共济失调综合征（FXTAS）、亨廷顿病和许多脊髓小脑共济失调(6). ALS-FTD是DNA重复扩增疾病的最新成员。扩张的重复道可通过多种机制引起疾病。扩建（CTG）_n个·（复合年增长率）_n个强直性肌营养不良蛋白激酶中的重复序列(DMPK公司)基因导致由扩张的r（CUG）形成的长而稳定的RNA发夹结构_n个重复序列，结合并隔离核病灶的肌盲样（MBNL）剪接调控因子家族(7,8). MBNL的缺失导致其许多靶RNA的错误拼接，从而导致发病(8). （CGG）的扩展_n个·（CCG）_n个在中重复FMR1（飞行管理1级）基因可导致三种不同的综合征，即脆性X智力低下、原发性卵巢功能不全和脆性X相关共济失调，后者被认为是通过隔离与FXTAS脑核病灶中发现的含有有毒CGG的RNA结合的RNA结合蛋白介导的(9). 编码CAG重复序列的扩增，如在亨廷顿病和一些脊髓小脑共济失调中发生的，会导致有毒的聚谷氨酰胺蛋白，但一些聚谷氨酰胺疾病也被认为含有有毒的CAG RNA(10). 所有重复性疾病的一个基本特征是（通常是双向的）转录重复道的扩张，它有可能形成不寻常的DNA和RNA结构(6,8,11).

ALS-FTD重复序列的富G特性使其成为二级结构形成的候选(6). 富含G的DNA和RNA可以形成不寻常的结构，称为G-四倍体在体外以及体内（请参见图1) (12–14). 在G-四联体中，四个鸟嘌呤通过围绕中心单价阳离子的平面构型中的Hoogsteen键相互作用形成G-四连体（参见图1,A–C) (12,13). 鸟嘌呤残基可以与同一核酸分子的其他鸟嘌呤s相互作用，形成单分子G-四链体（参见图1B类)或与来自不同分子的鸟嘌呤形成多分子G-四链体（参见图1C类) (12,13). G-四链体与生物过程相关，包括遗传不稳定性、端粒调节、基因调节、免疫球蛋白类开关重组、剪接和RNA翻译调节(15–19).

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图1。

ALS-FTD RNA重复序列的电泳迁移。 A类，通过Hoogsteen键与4个鸟嘌呤残基相互作用的G-四重奏示意图(虚线)由钾离子或钠离子稳定。B类，三个G-四聚体显示形成单分子平行的G-四聚体，其中鸟嘌呤在同一分子内相互作用。C类，三个G-四分体显示由四个核酸分子形成多分子G-四链体。也可以进行其他配置。天，[γ]迁移-³²P] 天然6%聚丙烯酰胺凝胶或6%变性中的ATP末端标记RNA（室温下冷冻和解冻）8米尿素测序凝胶。电子，[γ]迁移-³²P] ATP最终标记r（GGGCC）₄或r（CCCCGG）₄样品或两者的混合物（在95°C下加热，在室温下冷却5小时）置于6%聚丙烯酰胺凝胶上。F类，[γ的迁移-³²P] ATP末端标记的传感链r（CUG）₁₅或用未标记的反义链r（CAG）标记的义链₁₅6%聚丙烯酰胺凝胶中的寡核苷酸。G公司，RNA浓度对缓慢迁移r（GGGCC）的影响₄产品。100 fmol的[γ-³²P] ATP最终标记r（GGGCC）₄在95°C下用0、25、50或100 pmol的未标记r（GGGCC）加热寡核苷酸₄在室温下孵育5h，转移至4°C，保存过夜。随后，在8%天然聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳之前，将样品在冰上冷冻1小时。缓慢迁徙的物种由箭头所示。H（H），阳离子对缓慢迁移r（GGGCC）的影响₄产品。[γ-³²P] 将ATP末端标记的RNA寡核苷酸在95°C下加热，并在室温下培养1 h，同时增加LiCl和NaCl（0、10、100和1000 m）的量米). 缓慢迁徙的物种由箭头所示。我重复长度和侧翼序列对构造形成的影响。[γ-³²P] ATP最终标记r（GGGCC）_n个(n个=4、6或8）重复单位或n个=基因组侧面的4+15个核苷酸（r（AGGAGUCGCUA）r（GGGCC）₄)100米米KCl在6%天然聚丙烯酰胺上进行电泳分离。箭头指出存在于n个=6-和8-重复RNA。

在这里，我们报告了在ALS-FTD r（GGGCC）的RNA序列中形成极稳定的单分子和多分子G-四链体结构_n个重复，但不是互补的富C链。G-四链体的形成和复杂性受到重复次数以及侧翼序列的影响。两者都不是（GGGGCC）_n个或r（GGCCCC）_n个重复序列能够结合MBNL1蛋白，但r（GGGGCC）_n个可以绑定ASF/SF2拼接调节器。我们的研究结果表明，通过r（GGGCC）形成G-四联体_n个重复拖拉机C9或72可能阐明重复序列的正常和致病作用。

实验程序

结果

C9orf72重复RNA形成电泳慢迁移结构

确定r（GGGCCC）_n个和r（GGCCCC）_n个重复序列有可能形成替代结构，评估RNA寡核苷酸在天然聚丙烯酰胺凝胶上的电泳迁移。冷冻，[γ-³²P] ATP末端标记的寡核苷酸在室温下解冻，并在天然或变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳。放射自显影术显示r（GGGCC）有两种不同的产物₄在天然凝胶上，但变性凝胶上只有一种产品，表明结构形成异常(图1天). 富C重复序列没有显示出相同程度的缓慢迁移产品(图1天). 值得注意的是，mfold预测r（GGGCC）₄和r（GGCCCC）₄序列会出现发夹，但其他结构预测软件（如EuQuad）预测富G序列的G-四联体形成。发夹形成可能与G-四联体或其他结构形成竞争或促进其形成。

当寡核苷酸首次加热到95°C 5分钟并冷却5小时至室温时，我们观察到缓慢迁移蛋白（GGGCC）的数量减少₄产品(图1电子,顶部箭头). 这表明，迁移速度较慢的物种可能是分子间G-四链体，在高温下变性，在冷却过程中没有足够的时间重组。多分子复合物形成非常缓慢。这些假定的多分子r（GGGCC）结构可能对冷冻很敏感，正如其他G-四链体形成序列所证明的那样(21). r的变性和复性（GGGCC）₄存在互补r的RNA（GGCCCC）₄RNA只产生了很小比例的双链移位物种(图1电子,下箭头)，表明绝大多数未迁移物种处于高度稳定的替代结构状态，这对于常规的Watson-Crick碱基配对是不可用的。迁移较慢的r（GGGGCC）₄产品不同于双绞线r（GGGCC）₄·r（GGCCCC）₄相反，当DM1-associated r（CUG）₁₅发夹在其互补序列的存在下变性和复性，完全形成双链、移位的物种(图1F类). 总的来说，这些观察结果表明r（GGGCC）₄RNA采用单分子和多分子G-四链体，慢迁移产物为多分子形式，快迁移产物为单分子形式，但也可能包含mfold预测的一定比例的稳定发夹。

慢速迁移器（GGGCC）₄结构对RNA浓度敏感

多分子G-四链体依赖于分子浓度。进一步证实r（GGGGCC）的多分子性₄物种，我们在增加RNA浓度的情况下进行了变性/复性实验(图1G公司). 我们观察到缓慢迁移蛋白（GGGCC）的浓度依赖性增加₄物种(图1G公司). 这是形成多分子G-四链体的有力证据。

慢迁移r（GGGCC）的离子依赖性₄结构

G四链体的特征是由钾或钠离子稳定，并由锂不稳定(12,13) (图1,A–C). 我们观察到的迁移较慢的电泳物种在钾离子存在下形成，支持其作为多分子G-四链体的特性(图1,D–G型). 为了证实这一点，我们评估了锂离子或钠离子的影响(图1H（H）). 锂浓度不利于缓慢迁移r（GGGCC）₄物种，而钠对其有促进作用；这两个观察结果都与多分子G-四链体的形成相一致(图1H（H）). r（GGCCCC）未观察到缓慢迁移物种₄(图1H（H）).

重复长度和侧翼顺序对构造形成的影响

重复道长度是包括ALS-FTD在内的重复疾病疾病严重程度的重要决定因素(6). 增加重复次数可以通过端粒重复影响G-四联体的形成，通过（CAG）/（CTG）和（CGG）/(22–26). 这里我们分析了r（GGGGCC）的增加_n个重复长度n个=4、6和8个单位(图1我). 我们观察到一个缓慢迁移的物种在6和8 r（GGGCC）_n个重复4个重复，但我们也观察到其他迁移速度更快和较慢的物种，其中6和8个重复在4重复RNA中不明显(图1我,箭头). 这些产物与报道的具有不同重复数的端粒寡核苷酸的快速和缓慢迁移G-四链体物种相似(22). 额外和独特电泳物种的形成与随着重复长度增加而形成的单分子和多分子G-四链体一致(图1我). 这些寡核苷酸在变性凝胶上只显示了一个物种，证实了天然凝胶上的迁移变化是由于二级结构引起的（数据未显示）。因此，r（GGGGCC）的分子数量增加₄(图1G公司)以及增加每个分子的重复数(n个=4、6和8次重复）(图1我)增加了多分子G-四链体的形成。

有兴趣确定r（GGGCC）₄重复形成的G-四链体C9或72因为紧邻G-四联体形成序列的序列可能会导致结构改变(27). 包含15个核苷酸C9或72重复序列上游的基因增加了产物的异质性(图1我). 变性凝胶上没有的天然凝胶电泳显示出多种物种（数据未显示）。这表明r（GGGGCC）_n个四联体可以稳定在多种构象中C9或72成绩单。

圆二色性表明r（GGGCC）_n个重复形成一个平行G-四联体

CD光谱是评估RNA中G-四联体形成的生物物理方法(28,29). r的CD分析（GGGCC）₄钾缓冲液中的重复出现在260nm左右的正峰和240nm左右的负峰(图2A类). 这些光谱特征是平行RNA G-四链体的特征(28,29). 我们观察到r（GGGCC）重复长度的类似CD光谱₂, -₅, -₆，以及-₈共占种群非扩张重复长度的～90%(4) (图2B类). 值得注意的是，G-四联体相关CD信号的重复道长度依赖性增加（较高的260 nm峰和240 nm负峰），进一步支持G-四联体形成的重复道距离依赖性。光谱呈钾离子依赖性，具有G-四链体的特征；在锂中获得的光谱显示了光谱的偏移，从260 nm到270 nm，以及240 nm处负峰的偏移，类似于mfold预测的a型RNA发夹(图2C类). 反义r（GGCCCC）的CD分析₄钾离子中的重复序列在270 nm处出现正峰，在240 nm处没有负峰，表明r（GGCCCC）₄没有形成G-四联体(图2C类). 同样，如前面对r（CUG）所述，接近270 nm的峰和缺少240 nm的负峰是A型RNA的典型特征_n个发夹(29)并且可以类似于mfold发夹预测。因此，CD光谱进一步支持r（GGGCC）形成G-四联体_n个重复。

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图2。

ALS-FTD RNA重复序列的CD光谱和蛋白质结合。 A类，5μCD光谱米r（GGGCC）₄100米重复米钾缓冲液。D.E.公司。，Delta Epsilon。mdeg公司，毫度。B类，5μCD光谱米r（GGGGCC）_2–8100米重复米钾缓冲液C类，5μCD光谱米r（GGGCC）₄或r（GGCCCC）₄100米米KCL或100米米氯化锂。天，6.7μCD光谱米r（GGGCC）₄100米重复米温度升高时的钾缓冲液。电子，带有指示的[γ]的人MBNL1 EMSA-³²P] ATP末端标记的RNA寡核苷酸（10fmol）和0、1、5和10pmol纯化的含有两组锌指的人MBNL1 N末端蛋白。RNA-蛋白复合物由箭头所示。F类，人类ASF/SF2 EMSA，带有指示的[γ-³²P] ATP末端标记RNA寡核苷酸。这个上部面板使用10 fmol RNA和0、1、5或10 pmol全长人类ASF/SF2（Abcam）。这个下部面板使用5 fmol RNA和0、5、10或20 pmol全长人类ASF/SF2（Abcam）。RNA-蛋白复合物由箭头.

r（GGGCC）₄G-quaplex显示出异常高的热稳定性

形成G-四链体的其他序列在其热稳定性方面表现出很大的可变性。测试由r（GGGGCC）形成的结构的热稳定性₄重复，我们在不断升高的温度下测量了CD光谱(图2天). 在较高温度下，CD信号明显减少，这与温度有关。令人惊讶的是，尽管CD信号减少，但CD数据并没有表明G-四链体在95°C时完全解离(图2天). 此外，即使将钾浓度降低到10 m，也无法熔化重复物米在UV熔融实验中（数据未显示）。这种极端的热稳定性以前曾在富G-四链体形成序列中观察到(30).

r（GGGCC）₄重复不结合MBNL1，但可以体外结合ASF/SF2拼接因子

由r（CUG）致病性扩张形成的发夹等结构化重复RNA_n个重复序列是剪接调控因子muscleblind-like 1（MBNL1）的靶点。MBNL1特别与r（CUG）相互作用_n个重复发夹(7,31). 确定MBNL1是否可以识别结构化C9或72RNA重复，我们用纯化的人MBNL1蛋白和放射性标记RNA进行电泳迁移率变化分析(图2电子). 在绑定r（CUG）的条件下，MBNL1既没有绑定G-rich重复序列，也没有绑定C-rich重复片段₆重复(图2电子). 这表明MBNL1对r（CUG）显示绑定首选项_n个发夹但不是r（GGGCC）_n个G-四联体。

RNA中的G-四链体通过作为外显子剪接增强子与调节选择性剪接相关(32,33). 德赫苏斯·埃尔南德斯等。(4)报道了三种不同的剪接亚型C9或72成绩单，其中（GGGCC）_n个重复序列位于启动子（v1）或两个非编码外显子（v2,3）之间的第一内含子。为了确定剪接调控因子是否能特异识别r（GGGCC）重复序列，我们在ESEfinder中进行了候选搜索(34)确定了ASF/SF2关键拼接调节器。正如预测的那样，ASF/SF2结合r（GGGCC）₄重复但不重复r（GGCCCC）₄重复(图2F类). 我们比较了ASF/SF2与r（GGGCC）的结合₄ 对先前报道的ASF/SF2 SELEX鉴定的共识序列r（AGAGAAC），当存在于三个拷贝中时，可以作为一个强剪接增强子(35). 在相同条件下，ASF/SF2以对r（GGGCC）的某些偏好绑定这两个序列₄超过r（AGAAGAAC）_三(图2F类).

讨论

在这项研究中，我们提供了富G-细胞形成G-四联体的证据C9或72RNA重复。我们证实了最近的一项研究，证明了r（GGGCC）的单分子G-四联体形成₄排序并扩展此发现(36). 我们使用的寡核苷酸模型在未受影响/未受影响的细胞中存在重复长度C9或72基因；未受影响的人群有2-19个（GGGCC）_n个单位，受影响的人口可以n个=20–1600个单位。我们证明：1）该重复序列采用极稳定的单分子和多分子G-四链体，由钾和钠而非锂稳定；2） 结构的形成和复杂性受RNA浓度、重复长度和侧翼序列的影响；和3）两个重复都不受r（CUG）的约束_n个发夹式绑定MBNL1，但可以绑定在体外通过ASF/SF2拼接调节器。

重复扩张性疾病的重复道长度与疾病严重程度呈正相关(6). 例如，在DM1的情况下，随着个体年龄增长到数千倍长度（CTG），>100个重复的遗传扩展可能会进行_n个重复，随着疾病严重程度的增加和长期扩张的进展(6). 这些重复序列的转录导致含有扩增r（CUG）的毒性RNA_n个折叠成发夹的重复序列将MBNL1蛋白隔离到核糖核病灶中，阻止其正常活动(8). ALS-FTD患者被认为遵循与DM1相同的毒性RNA发病机制，因为他们有长时间（GGGCC）_n个像DM1一样，可以形成核糖核焦点的扩张，表明突变C9或72转录本可能是一种结构有毒的RNA，可能与蛋白质结合(三,4). 事实上，我们观察到r（GGGCC）_n个重复序列形成多重G-四链体，其形成对重复长度敏感，表明分子间G-四联体相互作用可能有助于RNA焦点的形成。

r形成G-四联体（GGGCC）_n个重复但不重复r（GGCCCC）_n个重复序列可能会影响其在患有以下疾病的患者大脑中转化为聚集二肽重复序列的能力C9或72扩张(37,38)通过第页重剑-一有关联的n个on-ATG翻译（RAN翻译）(39)，正如Ranum及其同事最初在三核苷酸重复疾病中观察到的那样(40). Ranum和同事(40)提出通过扩展r（CAG）形成发夹结构_n个和r（CUG）_n个启动RAN翻译需要重复。如果RAN转换发生在相反的链r（GGCCCC）_n个，这可能是通过一个独特的结构实现的，因为我们没有用这个序列观察到G-四联体的形成。应该注意的是，富C和富G重复链都可能像mfold预测的那样形成发夹，因此，确定这些结构如何影响RAN翻译，从而导致细胞二肽重复聚集体是一个需要进一步研究的重要问题。

识别G-四链体结构的蛋白质也可能有助于核糖核聚集。重要的是要确定哪些蛋白质与这些扩增重复序列结合，以及它们如何影响含有扩增重复序列的ALS-FTD患者的聚集。

我们发现MBNL1既不结合有义RNA重复序列，也不结合反义RNA重复序列，这表明ALS-FTD可能不涉及MBNL1的螯合。我们不能完全排除MBNL1可能与超长致病性r（GGGCC）相互作用的可能性_n个通过间接关联重复或与核糖核病灶相关，如FXTAS(41). 由于ALS-FTD被怀疑与毒性RNA的发病机制有关，如DM1，因此识别与扩张RNA结合的蛋白质C9或72r（GGGCC）_n个重复很有趣。

重复序列中G-四联体的形成可能有助于C9或72基因转录本。G-四联体可以影响选择性剪接(33,42). （GGGCC）_n个repeat位于C9或72基因，可选择性剪接到三种亚型(三,4). ALS-FTD患者组织和细胞中这些剪接亚型的相对丰度表明，在重复序列扩增的个体中，相对于v2和v3，v1减少了50%，但在重复序列未扩增的个体则没有(4). 虽然是初步的，但这些结果表明_n个重复可能潜在地自我调节C9或72拼接(4). 我们观察到r（GGGCC）_n个重复可以假设G-四联体打开了这样一个问题：这种结构是否会影响C9或72剪接结果，与其他基因一样(33,42). 我们发现剪接调控因子ASF/SF2结合在体外到C9或72重复，根据序列特异性预测(34). ASF/SF2在C9或72转录代谢包括G-四联体形成的影响尚不清楚。需要更多的研究来验证C9或72剪接与重复扩增、RNA结构的作用以及涉及的蛋白质。

针对某些DNA和RNA G-四链体形成序列的治疗靶向性调控疾病已经引起了相当大的关注(43–45). 各种小分子被用来靶向G-四链体形成序列，以增强或干扰结构形成，从而调节端粒长度或基因活性的维持(43–45). 如果RNA焦点的形成在ALS-FTD中起到了毒性作用，并且它们的形成在一定程度上由于G-四链体的分子间多聚而加剧，那么破坏这些焦点可能会产生有益的结果。应用G-四链相互作用小分子可能调节ALS-FTD的发病机制。

对C9或72重复形成G-四链体是指任何基于反义寡核苷酸重复的治疗方法都必须考虑寡核苷酸的结构。值得注意的是，GGGCC重复序列形成G-四倍体可能会影响形成互补杂种的能力，因为CTG和CAG重复序列形成发夹并不能覆盖DM1吗啉类药物的杂种形成(46).

确认

参考文献