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细胞死亡疾病。2013年3月；4（3）：e549。
2013年3月21日在线发布。 数字对象标识：10.1038/cddis.2013.76
PMCID公司：项目经理3615742
PMID：23519118

TiO的代谢作用2纳米颗粒是防晒霜和化妆品的常见成分，作用于人角质形成细胞

P Tucci先生,1,2,* G港口,三 阿戈斯蒂尼,1 D丁斯代尔,1 我是亚维科利,4 K凯恩,1 A Finazi-Agroó,5 G梅利诺,1,5和A威利斯1,*
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充材料

摘要

纳米颗粒的长期健康风险仍然知之甚少，这是一个严重的问题，因为随着工业和家庭使用的增加，纳米颗粒在环境中普遍存在。这些化合物对细胞毒性的贡献程度尚不清楚，尽管已知氧化应激途径的诱导与此过程有关，但与纳米颗粒介导的氧化应激和毒性有关的蛋白质和代谢途径基本上尚不清楚。为了进一步研究这个问题，TiO的影响2对HaCaT人角质形成细胞系进行了检测。数据表明，尽管TiO2这些纳米颗粒不影响细胞周期相分布，也不影响细胞死亡，对线粒体功能有显著而迅速的影响。进行代谢分析以确定268种特定途径的代谢物，发现85种生化代谢物发生显著变化，其中许多已知与细胞应激反应有关。重要的是，纳米颗粒进入培养细胞的吸收仅限于吞噬体TiO2纳米粒子没有进入细胞核或任何其他细胞质细胞器。暴露24小时后，未检测到其他形态变化，这与线粒体在该反应中的特定作用相一致。

关键词：二氧化钛、细胞凋亡、新陈代谢、癌症、防晒霜、化妆品

标准尺寸（>100 nm）二氧化钛（TiO2)粒子在人类和动物中都被归类为生物惰性粒子，1,2因此，它们被广泛用作化妆品和药品等多种产品的赋形剂。三,4,5然而，近年来，随着纳米技术的引入，TiO2的工业应用2以纳米颗粒形式（<100nm）呈指数级增长。目前，TiO2纳米颗粒（TiO2-NP）用作防晒产品、油漆、油墨、橡胶、纸张、糖、水泥、牙膏、薄膜、生物医用陶瓷和植入生物材料、抗菌塑料包装和自清洁卫生陶瓷的添加剂。6,7,8

由于其广泛应用，TiO的潜在生物效应2-NP的重要性与日俱增，人们越来越担心暴露在外的工人和普通人群的健康风险。一些研究表明，纳米颗粒可能比相同材料的较大颗粒毒性更大，因为它们的表面积更大，化学反应性更强，细胞更容易渗透。9为了支持这一点，TiO2-众所周知，NP具有显著的毒性作用，并已被证明会导致大鼠慢性肺部炎症10以及人类内皮细胞的促炎作用。11氧化钛2-NP还被报道引起基因表达途径的改变，包括凋亡相关基因12,13和炎症基因，并促进氧化应激和DNA损伤反应。11,12 体内研究表明，TiO引发的主要致病机制2-NP是炎症反应，因此炎症被用作TiO毒理学测试的标记2.14,15

二氧化钛的生物效应2-NP暴露和反应机制尚不清楚。因此，更详细地了解TiO的毒理行为2-NP需要阐明该材料的毒性途径、氧化应激效应和反应机制。特别是，由于皮肤接触是普通人群以及职业接触该制剂的工人最重要的接触途径之一，因此评估TiO之间的相互作用非常重要2-NP和角质形成细胞。

因此，本研究的目的是研究TiO诱导的早期病理、代谢和毒理过程2-NP通过一种新的、非侵入性和强大的技术，代谢组学。该方法为纳米材料的全细胞反应提供了相对完整的生物学观点。我们在用不同剂量的TiO处理24小时的人角质形成细胞系（HaCaT细胞）中进行了这样的代谢分析2-NP，以表征治疗的代谢效应，并获得组织损伤的详细生化鉴定。

结果

TiO的超微结构效应2

粒径和形状以及颗粒表面特征，例如电荷，是细胞毒性的重要因素。16此外，TiO2颗粒大多是聚集体，17这些聚集体的性质是决定其细胞毒性的重要因素；18在这方面，之前已经表明TiO的尺寸2聚集体影响基因表达途径。19确定是否以及如何TiO2-NP被细胞摄取，电子显微镜检查其与HaCaT细胞的相互作用。直径为10–100 nm的电子致密颗粒被分离出来，并作为吞噬体内的聚集物遍布细胞质(图1a). 较大的吞噬体（1–2μ直径为m）在微管组织中心的区域中特别常见，并且它们的钛含量通过能量色散X射线光谱法得到证实。暴露24小时后，在任何其他细胞质细胞器或细胞核内均未发现颗粒，也未检测到其他形态学变化(图1a). 几个大的粒子团（0.5–3μ在培养基中观察到游离的（直径为m），但没有发现这些物质正在吞噬。

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TiO的影响2形态和细胞周期相分布。(一)50处理的HaCaT细胞的透射电镜μ克/毫升二氧化钛224小时后，在吞噬体/溶酶体内发现聚集的单个颗粒。在细胞核或其他细胞器内未发现颗粒。(b条)用流式细胞仪对不同TiO浓度处理24 h的HaCat细胞进行凋亡和细胞周期分析2如图所示。数据表示平均值±S。三个独立实验的E.M

二氧化钛的作用2细胞活力与线粒体功能

为了确定是否存在与细胞内TiO存在相关的细胞毒性作用2-将NP、HaCaT细胞暴露于一系列浓度的纳米粒子中，并通过FACS分析检测凋亡率(图1b). 数据表明，TiO处理的细胞之间的细胞死亡没有显著差异2和所用时间范围内的控制单元(图1b). 此外，细胞周期曲线没有显著差异。

As细胞内TiO2-在研究间隔时间内，NP未引起细胞周期相分布的任何显著变化或诱导凋亡，进行了更精细的分析。特别是，线粒体功能的作用被调查，因为线粒体活性的降低是已知的毒性损伤的早期标志。先前的研究表明，能量途径对接触有毒物质非常敏感，影响了几种细胞内生化过程（糖酵解、克雷布斯循环、电子传递和氧合磷），导致ATP的异常生成以及热量和化学副产物（乳酸和CO）的释放2)进入细胞外环境。20,21,22,23,24,25,26为了评估TiO2-NP影响线粒体功能，耗氧率（OCR）(图2a和补充图S1A)和细胞外酸化率（ECAR）(补充图S1B)在存在不同浓度TiO的情况下，在连续暴露于线粒体活性调节剂（寡霉素、FCCP和鱼藤酮）的HaCaT细胞中测量2-NP持续24小时。

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TiO的影响2在呼吸方面。(一)在存在不同浓度TiO的情况下，连续暴露于线粒体活性调节剂（寡霉素、FCCP和鱼藤酮）的HaCat细胞的OCR2所示为五个试验中的一个试验。(b条)根据A(c（c）)TiO的影响2对鱼藤酮敏感的OCR，如(一). 中的数据(b条和c（c）)表示平均值±S。三个独立实验的E.M。统计学P（P）-中的值(b条)和(c（c）)与控制相比，显示了。另请参见补充图1三个独立实验的相对累积效应和ECAR

数据显示TiO2-NP导致基础细胞呼吸的显著、抑制剂不敏感、浓度依赖性增加(图2b). 特别是，对鱼藤酮敏感的OCR受到TiO2的影响2-NP公司(图2c). 因此，在对照细胞中，鱼藤酮将OCR降低至其基线速率的20%左右，表明线粒体呼吸占细胞总呼吸的约80%。然而，在暴露于TiO的细胞中2-NP，鱼藤酮可将耗氧量降低至总耗氧量的60%至30%。综合起来，这些数据强烈表明TiO2-NP影响线粒体功能，导致相当一部分电子从常规呼吸链途径逃逸，可能会产生活性氧自由基。为了更详细地了解这些影响，进行了全面的代谢分析。

高剂量TiO2影响能量代谢并增加细胞周转

HaCaT细胞与5、50或100μg/ml氧化钛2-NP持续24 h，通过气相色谱/质谱（GC/MS）或液相色谱/色谱质谱（LC/MS/MS）分析样品。总的来说，共鉴定出268种代谢物(表1和补充图S3，）其中56或85(表1，50或100μ克/毫升与控制，P（P）≤0.05和0.05<P（P）分别<0.10），发现TiO暴露显著改变2-NP。

表1

TiO引起的代谢变化2
 统计比较
韦尔奇的两个样品 t吨-测试带有 P（P）⩽0.05生化制品（↑↓） P（P）⩽0.05生物化学品总数0.05<P（P）<0.10生化制品（↑↓）0.05<P（P）<0.10
5 μg/控制1919/0116/5
50 μg/控制4539/6118/三
100 μg/控制5417/37312/29
50 μ克/5μ克5949/103128/三
100 μ克/5μ克7126/45292/27
100 μ克/50μ克560/56531/52

韦尔奇的两个样品t吨-试验用于确定两个群体的平均值是否不同。共鉴定出268种代谢物。粗体值表示增加，斜体值表示减少。原始数据显示在补充图S3.

TiO最高浓度处理后2，北美+(图3a)、NADH(图3b)和NADP+(图3c)细胞暴露于100μg/ml氧化钛2.辅酶a的数量减少(图3d)、肉碱(图3e)和酰基肉碱(图3f和g)这意味着脂肪酸氧化的改变和乙酰辅酶A的改变(图3h)和乙酰肉碱(图3i).

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TiO的影响2能量代谢和细胞更新。NAD水平+(一)、NADH(b条)、NADP+(c（c）)、CoA(d日)、肉碱(e（电子）)，己基肉碱(（f）)，棕榈酰肉碱(克)，乙酰辅酶A(小时)和乙酰肉碱(我)按照材料和方法进行测量。方框和胡须图例如图所示

虽然TCA中间体似乎没有受到影响（3-磷酸甘油酸，图4b)通过将细胞暴露于TiO2-NP，葡萄糖(图4a)和糖酵解代谢产物，包括丙酮酸(图4c)，在较高剂量的TiO下显著降低2与这些数据一致，戊糖磷酸途径中间产物（如5-磷酸核糖）也有所减少(图4d)和核糖(图4e). 由于这些中间体对核苷酸合成很重要，27,28减少的核糖-5-磷酸可能解释了在100μg/ml氧化钛2-NP。

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TiO的影响2对葡萄糖代谢的影响。葡萄糖水平(一)，3-磷酸甘油(b条)，丙酮酸(c（c）)，核糖-5-磷酸(d日)和核糖(e（电子）)按照材料和方法进行测量。代谢途径如图所示

核苷酸合成减少可能会导致RNA代谢产物（3′AMP、3′CMP和2′、3′-cCMP）升高，从而导致RNA周转增加(图5a和c)50次治疗后μg/ml和100μg/ml氧化钛2类似地，二肽显著增加(图5d和f)表明蛋白质降解和周转更快。

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TiO的影响2能源中间体。TiO处理后蛋白质和RNA降解途径的代谢变化2.3-AMP水平(一)，3-CMP(b条)，胞嘧啶-2,3-环磷酸(c（c）)，甘氨酰缬氨酸(d日)，天冬氨酰亮氨酸(e（电子）)和天冬氨酰苯丙氨酸(（f）)按照材料和方法进行测量

总之，这些变化表明TiO2-NP对合成代谢途径和能量代谢有显著影响。

氧化钛2纳米粒子影响甲基化能力，导致谷胱甘肽水平降低

S-腺苷蛋氨酸（SAM）和S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）是参与蛋氨酸循环近端部分蛋氨酸转化为同型半氨酸的代谢产物。在蛋氨酸腺苷转移酶催化下，由蛋氨酸和ATP合成S-腺苷蛋氨酸。SAM在许多具有重要生物学意义的转甲基化反应中提供甲基。29甲基转移产生的S-腺苷同型半胱氨酸在不同浓度下都能抑制这些反应。29,30,31结果表明，用50和100处理HaCaT细胞后，SAH浓度降低μg/ml氧化钛2(图6a)以及同型半胱氨酸水平下降(图6b)，可通过S-腺苷高半胱氨酸水解酶的反向作用与腺苷反应形成SAH。此外，甲基化能力降低可能反映谷胱甘肽合成减少(图6c)从而导致更大的氧化应激。蛋氨酸对细胞生长也至关重要，是精脒和精胺的氨丙基部分的前体，精胺是转录和翻译所需的关键多胺，并刺激正常和肿瘤细胞分裂。因此，TiO处理2-NP导致蛋氨酸循环障碍和蛋氨酸缺乏(图6d).

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甲基化和谷胱甘肽合成的代谢途径。SAH水平(一)，同型半胱氨酸(b条)，谷胱甘肽(c（c）)，蛋氨酸(d日)，胱硫醚(e（电子）)和半胱氨酸(（f）)按照材料和方法进行测量。代谢途径如下所示

总的基因表达可以通过表观遗传过程调节，包括基因启动子DNA序列中胞嘧啶残基的甲基化。32DNA甲基化过程由SAM和SAH的比率调节，并由DNA甲基转移酶催化，该酶将甲基从SAM转移到胞嘧啶。蛋氨酸和叶酸在同型半胱氨酸转化为蛋氨酸的代谢过程中相互关联。DNA甲基化的失调一直与癌症的发生有关。伴随5-甲基硫腺苷（MTA）的剂量依赖性降低(图7a)这些观察结果表明甲基供体SAM存在潜在缺陷。这种缺陷可能会对使用SAM作为辅因子的酶反应产生重大影响，包括DNA甲基化酶。

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多胺合成的代谢途径。MTA水平(一)，二甲基精氨酸(b条)，精脒(c（c）)，腐烂(d日)，精氨酸(e（电子）)，尿素(（f）)和鸟氨酸(克)按照材料和方法进行测量。代谢途径如右侧所示

胱硫醚的显著剂量依赖性下降(图6e)在TiO中也观察到2-从50开始处理样品μ克/毫升。胱硫醚是半胱氨酸生物合成的中间产物，在100克/毫升剂量处理后，该中间产物似乎减少-μg/ml氧化钛2剂量(图6f). 半胱氨酸水平的降低可能会对谷胱甘肽的合成产生后续影响，最高剂量的TiO也会降低谷胱甘苷的合成2已测试(图6c). 谷胱甘肽在氧化还原平衡中起重要作用；因此，随着谷胱甘肽水平的降低，氧化应激预计会增加。

二甲基精氨酸高度升高(图7b)50次治疗后μg/ml或100μg/ml TiO2将支持增加的氧化应激，因为这种一氧化氮合成调节剂的降解在这种条件下受到抑制。

氧化钛2减少多胺合成并诱导炎症样反应

天然多胺、精胺和精脒及其前体腐胺是与核酸和蛋白质相互作用的脂肪族阳离子。精胺和精脒在包括基因转录、RNA加工和翻译在内的多种细胞内过程中起着至关重要的作用。33细胞的生长、分化和转化需要增加多胺水平。精胺和亚精胺通过清除活性氧，积极参与保护细胞免受氧化应激。34,35,36因此，多胺代谢的任何失衡都可能产生重要后果。因此，例如，多胺合成增加是肿瘤增殖的标志。37,38,39

精脒的显著剂量依赖性降低(图7c)亚精胺合成的副产物MTA(图7a)在TiO中观察到2-处理过的细胞。亚精胺合成减少（通常与增殖相关）可能反映了亚精胺合成酶活性降低，这是由于脱羧基SAM水平低。或者，前体腐胺水平降低(图7d)由于尿素循环的活性降低，可能导致多胺合成减少。精氨酸水平增加(图7e)在50和100μg/ml剂量和尿素减少(图7f)和鸟氨酸(图7g)这与多胺合成减少可能意味着增殖减少的假设是一致的。

2-（D）-羟基脂肪酸是传统的脂质成分，是动物鞘脂的重要组成部分。40,41,42,43,44,45,46羟基被认为增加了鞘磷脂的氢结合能力，有助于稳定膜结构并加强其与膜蛋白的相互作用。虽然2-羟基脂肪酸不是氧化应激的典型指标，但在50μg/ml和100μg/ml浓度(补充图S2A)可能反映了膜脂氧化增加。此外，促炎分子前列腺素E2水平的增加也表明了细胞对应激的反应(补充图S2B)和15-HETE(补充图S2C).

总之，这些生化变化支持了尿素循环和多胺代谢对TiO的显著扰动2-NP治疗，以及炎症反应增加的一些证据。

TiO处理的细胞中葡萄糖醛酸化途径受损2

皮肤中存在所有参与外源性物质代谢的主要酶。47事实上，药物对化学反应代谢物的生物活性化被认为是许多化学毒性的主要步骤。48葡萄糖醛酸化涉及存在于各种结构不相关的底物上的合适官能团与葡萄糖醛酸的结合，并具有重要的细胞保护作用。该反应需要UDP-葡萄糖醛酸盐作为辅因子，并由酶UGT催化。这种代谢途径导致水溶性代谢物的形成。因此，葡萄糖醛酸盐是一种极性很强的分子，它与蛋白聚糖结合，并与胆红素和类固醇激素结合；它还可以与某些药物结合以增加其溶解度。葡萄糖醛酸盐是由糖醛酸途径中的葡萄糖衍生而来的。该途径涉及葡萄糖-6-磷酸氧化为UDP-葡萄糖醛酸盐，是一种葡萄糖氧化的替代机制，不提供产生ATP的手段，但用于生成活化形式的葡萄糖醛酸，即UDP-葡糖醛酸盐。药物和激素的葡萄糖醛酸化通过用UDP-葡萄糖醛酸转移的葡萄糖醛酸盐部分修饰底物来增加其水溶性。有趣的是，UDP-葡萄糖醛酸盐显著降低(图8a)和葡萄糖醛酸盐(图8b)在用100μg/ml氧化钛2这表明该途径也受到纳米处理的影响。

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TiO的影响2葡萄糖醛酸化途径。UDP-葡萄糖醛酸盐的变化(一)和葡萄糖醛酸盐(b条)TiO中的水平2-处理过的细胞。代谢途径如右侧所示

讨论

皮肤是最大的器官，代表身体的保护表面，是局部应用物质的第一个和最外层接触部位。49,50,51,52,53虽然皮肤作为屏障在防止机械和身体伤害方面的作用经常被强调，但对其解毒化学物质的潜力研究较少。然而，皮肤不仅在控制局部应用化学品的渗透和分布，而且在控制其代谢方面起着关键作用，因此是渗透物质的第一道器官。大量实例表明，皮肤新陈代谢不仅具有保护作用，而且有助于皮肤病理，如接触性皮炎或致癌。54,55这意味着需要对化妆品的所有成分进行安全性评估，并需要采用适当的模型来测试化学成分是否有可能引起皮肤刺激和敏化，以及基因毒性损伤。

在工程纳米粒子中，TiO2-NP是最早的工业生产纳米材料，也是目前使用最广泛的白色颜料。它们的不透明性被用来提高产品的白度，如牙膏、洗液、脱脂牛奶、乡村干酪和药物。TiO的含量2-这些不同药剂中的NP在很大范围内变化，最多为5μ食品中的g/ml，介于1和90之间μ在牙膏和防晒霜等外用制剂中，浓度为g/ml至>100μ某些油漆中的含量为g/ml。56由于浓度范围很广，我们在研究中使用了类似的广泛浓度范围。

由于其广泛使用，TiO2-NP已成为一个重要的公共卫生问题，由于环境和职业暴露的增加，需要对这些材料进行适当的风险评估。由于这些原因，在过去十年中在体外和体内已经进行了研究，以调查TiO的潜在毒理效应2-NP暴露。尽管在体外由于TiO颗粒特性和剂量的不均匀性，必须谨慎解释研究2-使用NP，它们确实表明TiO2-NP可在不同细胞系中发挥毒性作用。特别是，它们能够引起细胞反应，包括细胞死亡、细胞因子生成、炎症指数增加和自由基氧物种（ROS）生成。7,14尽管如此，二氧化钛的生物效应2-NP暴露以及细胞反应的机制还远未完全了解。

在这项研究中，我们发现了TiO引起的一些代谢变化2处理，重点关注以剂量依赖方式发生显著变化或在最高TiO浓度下受到影响的生化物质2-NP。尽管文献中有一些相互矛盾的证据，但一些研究报告了TiO对哺乳动物细胞的细胞毒性和氧化应激诱导2 在体外我们自己的数据将支持这些发现，因为我们已经确定了一些生化变化，这些变化表明HaCaT细胞暴露于TiO2引起的氧化应激和能量代谢抑制2-NP。

炎症导致基因毒性事件以及细胞增殖和组织重塑，这些过程增加了突变和向肿瘤病变发展的可能性。57同样，活性氧的产生也与恶性转化和癌症有关，58特别是TiO诱导的致瘤表型的获得2-NP。59然而，TiO作用的诱变或表观遗传机制2-NP在多步骤致癌过程中仍需要更详细的分析。

总之，我们报告了与TiO治疗人类角质形成细胞相关的几个重要生化变化2-需要进一步调查的NP。治疗24小时后出现的大多数变化为100μg/ml氧化钛2表明细胞应激激活和代谢能力降低。这些变化在生物化学和分子水平上扩大了之前对TiO相关细胞毒性的观察2-NP。在我们的实验条件下，我们没有检测到对细胞活力的任何影响，这可能反映了相对短暂的（24小时）暴露。这表明代谢作用先于对生存能力的影响。皮肤接触不仅对使用局部应用化妆品的普通人群很重要，更重要的是，对在TiO制造过程中职业接触的工人也很重要2-NP。由于我们的短期研究显示了显著的（和潜在的致病性）代谢变化，很明显长期系统性体内需要进行研究，以便为风险评估和管理提供充分信息。

材料和方法

细胞培养

人类角质形成细胞细胞系（HaCaT）来自美国型培养物收集（ATCC）。细胞生长在添加了2 mM L-谷氨酰胺、10%胎牛血清（FBS）和1%pen/strep的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）（英国佩斯利Gibco）中。培养物保持在37°C和5%CO下2.

二氧化钛溶液的制备和处理

锐钛矿型二氧化钛（TiO2)纳米粉末购自Sigma（美国密苏里州圣路易斯）。TiO原液2在去离子水中制备纳米颗粒（1 mg/ml），使用声波仪（60振幅）分散10分钟以防止聚集并旋转1分钟。二氧化钛纳米颗粒的储备溶液保持在4°C，并在1周内用于实验。在每次实验之前，将储备溶液在冰上超声10分钟，涡流1分钟，然后立即用介质稀释至工作浓度。氧化钛2-不同浓度的NP（5、50和100μg/ml）添加到含有20ml培养基的细胞培养物中，培养基位于150mm的聚苯乙烯涂层培养皿中。培养24小时后，收获细胞并制备用于代谢组学和其他分析。

透射电子显微镜（TEM）

对于电子显微镜，细胞在4°C的0.1 M碳酸钠缓冲液（pH 7.4）中的2%戊二醛中固定过夜，并在室温下用1%四氧化锇/1%亚铁氰化钾后固定1 h。固定后，对细胞进行染色整体在室温下用5%乙酸铀酰水溶液过夜，脱水并嵌入Taab环氧树脂中（Taab Laboratories Equipment Ltd.，Aldermaston，UK）。用柠檬酸铅对超薄切片进行染色，并使用Megaview 3数码相机和iTEM软件（德国慕尼黑奥林巴斯软成像解决方案有限公司）在Jeol 100-CXII电子显微镜（英国韦尔文花园城Jeol UK Ltd.）中进行记录配备有PCXA-1186能量色散X射线光谱仪（Link Analytical Ltd.，High Wycombe，UK）。

流式细胞仪分析

按照Tucci的描述进行流式细胞术等。60简单地说，在37°C下用0.025%胰蛋白酶处理3分钟后收集HaCaT细胞，然后在PBS中添加10%FCS后，离心细胞，用PBS洗涤并在70%冷乙醇中固定。利用这些条件采集细胞可以获得高产量的未受损细胞。固定后，用PBS清洗细胞，用RNase（100）在37°C下处理15分钟μg/ml），然后用碘化丙啶（10μg/ml，黑暗中放置30分钟）。然后使用FACScan流式细胞仪（Becton Dickinson，San Jose，CA，USA）对样本进行分析。

细胞外通量（XF）分析

将HaCaT细胞接种在XF 24孔细胞培养微板（Seahorse Bioscience，North Billerica，MA，USA）中，以10×10的比例一式三份三 细胞/孔置于1ml生长培养基中，然后在37°C和5%CO中培养2。使用TiO治疗24小时后开始检测2-NP，从每个井中移除生长介质，并用600–900替换μl预加热至37°C的分析培养基。细胞在37°C下培养30分钟，使培养基温度和pH值在第一次速率测量前达到平衡。在每次速率测量之前，XF24分析仪（Seahorse Bioscience）在每个孔中轻轻混合分析介质10分钟，以使氧气分压达到平衡。混合后，在3-5分钟内同时测量耗氧率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR），以确定基线速率。然后在每次速率测量之间再次轻轻混合分析培养基3-5分钟，以恢复细胞周围微环境中的正常氧张力和pH值。基线测量后，75-90μ然后将1升在分析介质中制备的测试剂注入每口井，以达到所需的最终工作浓度。然后混合5-10分钟，以加速化合物暴露于细胞蛋白，然后进行OCR和ECAR测量。通常，测量两到三个基线率和两个或两个以上的应答率（在化合物添加后），并使用两个基线率或测试率的平均值进行数据分析。对于时间分辨实验，在指定的时间点进行多次测量以及化合物注射。OCR和ECAR的值反映了细胞的代谢活动和被测细胞的数量。对于将复合暴露后的代谢率与暴露前基线进行比较的相对测量，即当数据表示为OCR或ECAR变化相对于基线的百分比时，井中存在的细胞数量与分析相同的细胞群无关。

代谢组学分析

样品立即储存在−80°C下，在分析时，采用标准代谢溶剂萃取法进行萃取和制备以进行分析。将提取的样品分成等份，通过气相色谱/质谱（GC/MS）或液相色谱/色谱质谱（LC/MS/MS）平台进行分析。还包括从含有少量所有研究样品的均质池中创建的几个技术复制样品。未经处理的HaCaT细胞（对照，CTRL）和用不同剂量TiO处理24小时的细胞的全球生化特征2纳米颗粒：5μ克/毫升，50μg/ml和100μg/ml，进行比较。

平台的LC/MS部分基于Waters ACQUITY UPLC（Waters，Milford，MA，USA）和Thermo-Finnigan LTQ质谱仪（Thermo-Electron Corporation，San Jose，CA，USA。将样品提取物分为两等分，干燥，然后在酸性或碱性与LC-相容的溶剂中重新配制，每个溶剂包含11个或更多固定浓度的注射标准品。一份样品使用酸性正离子优化条件进行分析，另一份使用碱性负离子优化条件，在两次独立进样中使用单独的专用柱进行分析。使用水和甲醇梯度洗脱在酸性条件下重构的提取物，两者都含有0.1%甲酸，而同样使用水/甲醇的碱性提取物含有6.5mM碳酸氢铵。MS分析使用动态排除在MS和数据相关的MS2扫描之间交替进行。

用于GC/MS分析的样品在真空干燥条件下重新干燥至少24小时，然后使用双三甲基硅三氟乙酰胺（BSTFA）在干燥氮气下衍生。GC柱为5%苯基，16分钟内温度变化范围为40至300°C。样品在使用电子碰撞电离的Thermo-Finigan Trace DSQ快速扫描单四极质谱仪上进行分析。该仪器每天进行质量分辨率和质量精度的调整和校准。从原始数据文件输出的信息被自动提取。

对于计数>200万的离子，可以进行精确的质量测量。可以对母离子和碎片进行精确的质量测量。典型质量误差小于5 ppm。计数小于200万的离子需要更大的努力来表征。碎片谱（MS/MS）通常以数据相关的方式生成，但如有必要，可以使用目标MS/MS，例如在低电平信号的情况下。通过与纯化标准物或反复出现的未知实体的库条目进行比较来鉴定化合物。已知化学实体的识别基于与纯化标准品的代谢库条目的比较。色谱特性和质谱的结合表明了与特定化合物或等压实体的匹配。

数据质量：仪器和过程可变性

仪器可变性是通过计算内部标准物的中位数相对S.D.来确定的，内部标准物在注入质谱仪之前添加到每个样品中。通过计算100%基质样品中存在的所有内源性代谢物（即非仪器标准物）的中位数相对S.D.来确定整个过程的变异性，这些基质样品是合并客户样品的技术复制品。

代谢物概要和显著改变的生化物质

如上所述，代谢分析共鉴定了268种命名的生化物质。对Bradford分析测定的总蛋白进行归一化后，对每种化合物进行对数转换和最小观察值插补。韦尔克的两个样品t吨-然后使用这些测试来识别实验组之间差异显著的生化物质。具有统计学意义的生物化学品数量汇总(P（P）⩽0.05），以及接近显著性（0.05<P（P）<0.1），显示为表格和补充表格在“结果”部分中。

错误发现率的估计(q个-值）的计算考虑了基于代谢的研究中通常出现的多重比较。例如，当分析200种化合物时，我们预计会看到大约10种化合物符合P（P）⩽0.05随机截断。这个q个-value描述错误发现率；低q个-价值(q个<0.10）表示对结果有很高的信心。虽然较高q个-值表示信心减弱，但不一定排除结果的重要性。

鸣谢

我们要感谢Judy McWilliam和Tim Smith在透射电子显微镜方面提供的技术支持。这项工作得到了英国医学研究委员会的支持；由“Allenza contro il Cancro”（ACC12-ACC6）、MIUR/PRIN（RBIP06LCA9_0023）、AIRC（2008–2010_33–08）（编号5471）（2011-IG11955）、AIRC5xmille（编号9979）、意大利人类蛋白质组网RBRN07BMCT、Min.Salute（Ricerca oncologica 26/07）、IDI-IRCCS RF06（conv.73）和RF07（conv.57）向GM提供的赠款。

词汇表

氧化钛2二氧化钛
NP公司纳米粒子
光学字符识别耗氧量
ECAR公司细胞外酸化率
山姆S-腺苷蛋氨酸
SAH公司S-腺苷同型半胱氨酸
ROS公司活性氧物种

笔记

作者声明没有利益冲突。

脚注

补充信息附在细胞死亡与疾病网站上的这篇论文(网址：http://www.nature.com/cddis)

RA Knight编辑

补充材料

补充图1

补充图2

补充图3

补充图形图例

工具书类

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