proBDNF在GABA能突触形成中作用的NMDA依赖性转换

电生理记录

用Axopatch 200B放大器（Axon仪器）对CA3锥体神经元进行全细胞斑贴记录。用以下溶液（mM）填充微电极（4–8 MΩ）：CsCl（110），K-葡萄糖酸盐（30），N个-2-羟乙基哌嗪-N个′-2-乙基磺酸（HEPES）（10）；乙二醇双（β-氨基乙醚）-N个,N个,N个′,N个′-四乙酸（EGTA）（1.1），CaCl₂（0.1）、MgATP（4）和NaGTP（0.3）。在一些实验中，将MK801（1 mM）添加到吸管溶液中。使用Axoscope 8.1（Axon Instruments）监测并存储自发突触活动。在记录过程中，对串联电阻进行监测，以响应5 mV脉冲。自发GABA_A类受体介导的突触后电流（sGABA_A类-PSC）记录在NBQX和D-AP5中。诱导GABA能突触可塑性的方案包括在15分钟内洗去谷氨酸能拮抗剂(Kuczewski等人，2008年). 在一些实验中，细胞外钾浓度仅在洗脱期增加到5 mM，以增加BDNF的分泌，而BDNF是诱导GABA能量可塑性所必需的(Kuczewski等人，2008年). 因为，3.5或5 mM的活性恢复导致了类似的结果（分别为38±10%(n个=18）和30±12%(n个=8）sGABA增加_A类-PSC频率），将数据汇总。平均而言，sGABA的频率和振幅_A类-PSC从4.5±0.4赫兹增加到5.7±0.5赫兹(P（P）=0.0001）和82±12至100±9 pA(P（P）= 0.002) (n个= 26,图1A类,C类). 在一些实验中，在记录结束时外源性应用γ-氨基丁酸（5μM）证实了自发PSC的身份。sGABA公司_A类-使用Mini Analysis 6.0软件（Synaptosoft）离线分析PSC和串联电阻（Rs）。为了生成平均sGABA-PSC，丢弃了多个重叠事件，其余事件在上升阶段对齐。使用Kolmogorov–Smirnov（K-S检验）将有效可塑性量化为活动恢复前10分钟和活动恢复后20–30分钟之间的平均频率或振幅sGABA-PSCs。我们使用配对学生的t吨-测试以评估各组之间的差异。

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图1。

抑肽酶揭示了GABA能突触活动中活动依赖性的长期抑制。(A类)上部记录道：sGABA-PSC的代表性记录，说明控制ACSF活动恢复后事件频率的增加。平均sGABA-PSC以较高的时间尺度显示。该图显示了同一神经元中sGABA-PSCs频率修改的时间过程。在本图和下图中，sGABA的频率_A类-PSC表示为控制预恢复值的百分比，并根据时间绘制（bin=30 s）。(B类)上迹线：说明补充抑肽酶（3μg/mL）的ACSF活性恢复后sGABA-PSCs频率增加的代表性记录。该图显示了同一神经元中sGABA-PSCs频率修改的时间进程（bins=30 s）。(C类)sGABA的平均时间进程_A类-控制ACSF中活动恢复前后的PSC频率（开放符号，n个=26）或抑肽酶（3μg/mL，填充符号，n个= 17). (天)对照组ACSF（开放符号）或抑肽酶（填充符号）活动恢复30分钟后频率和振幅变化的百分比。每个符号表示单个单元格的结果。

免疫组织化学

如前所述，对P4大鼠副甲醛固定脑的横向海马冷冻切片进行处理(佛罗伦萨等人，2009年)，使用主要抗体：鸡抗proBDNF（1:000，Chemicon MAB351）和兔抗p75NTR（1:500；Abcam 8874）。使用了针对鸡和兔IgG（1:1000；Chemicon）的Cy3-共轭二级抗体。使用NeuroTrace绿色荧光尼塞尔染色（1:1000；Invitrogen）对海马切片进行复染。使用Vectashield（Vector）清洗切片并安装盖玻片。使用10倍物镜的激光扫描共聚焦显微镜（Zeiss LSM 510 Meta）观察免疫反应性。

磷酸CREB活化

在海马脑片上对非磷酸化和磷酸化形式的CREB进行免疫染色，其程序与电生理研究中使用的程序相似。将海马切片转移到浸没式记录室，并灌注NBQX和D-AP5（3 mL/min，34°C）10 min。在第一系列实验中，在抑肽酶存在或不存在的情况下，将NBQX与D-AP5冲洗15 min。在另一系列中，在NBQX和D-AP5存在的情况下，应用mBDNF（10 ng/mL）或CR-proBDNF，持续15分钟。对照实验包括将切片保存在NBQX和D-AP5中30分钟。处理后立即将切片在4%多聚甲醛的0.1 M磷酸盐缓冲液中固定过夜。在PBS-TritonX-100（0.3%）-山羊血清（3%）中预孵育恒冷器切割海马切片（30μm）（1 h），并在4°C下与小鼠抗CREB（1:1000）和兔抗磷酸-CREB（pCREB，1:1000）抗体共同孵育过夜（Cell Signaling Technology Inc）。pCREB和CREB的免疫反应性分别用Alexa 488-偶联（A488）兔二级抗体（1:500；FluoProbes）和Cy3-偶联小鼠二级抗体进行检测（1:500，Jackson Immunoresearch Laboratories）。使用Vectashield（Vector）和复染的4′，6′-二氨基-2-苯基吲哚清洗切片并安装盖玻片。使用LSM 510（蔡司）共焦显微镜对切片进行成像，使用A488（pCREB）和Cy3（CREB）荧光的连续双通道记录。光学切片被数字化（1024×1024像素），并使用Image J软件进行处理。pCREB与CREB强度比表示为pCREB-A488染色强度与CREB-Cy3染色强度的平均值比。平均数据以控制切片的百分比表示。我们使用了未成对学生的t吨-测试以评估各组之间的差异。

Elisa BDNF免疫检测

BDNF夹心ELISA试剂盒（Chemicon International，Temecula，CA，USA）用于量化海马切片中BDNF的数量，该切片的程序与电生理研究中使用的程序类似。处理后，立即对切片进行称重，并在液氮中快速冷冻，并在−80°C下储存。对于BDNF的提取，20–30 vol/wt的提取缓冲液由100 mM Tris/HCl组成，pH值7.0，含有1 M NaCl、4 mM EDTA、2%Triton X-100和蛋白酶抑制剂10μg/mL抑肽酶、10μg/mL亮氨酸肽和17μg/mL苯甲磺酰氟（PMSF）。将匀浆离心（14000×克持续20秒）。收集上清液并用商业双抗体夹心ELISA（BDNF E_最大值免疫分析系统；Chemicon）根据制造商的协议。用Bradford蛋白质测定法测定每个上清液的总蛋白质含量。BDNF水平表示为BDNF与总可溶性蛋白浓度的比值。使用未配对学生的t吨-测试。

BDNF转录物的相对定量表达

使用Q-PCR（Roche LC 4PO）定量完整海马中BDNF mRNA的水平。对海马进行BDNF与GAPDH mRNA配对作为看家基因的分析。使用从海马提取的mRNA绘制每个基因的标准曲线，并稀释300倍以上，证明了在研究值范围内响应的线性(对²=0.998对于BDNF和对²=0.999（对于GAPDH）。PCR在3个重复中进行，并得出平均值C类_P（P）根据标准曲线绘制值以进行转换C类_P（P）将样本数据转换为浓度。BDNF mRNA的相对浓度归一化为GAPDH mRNA的浓度。结果表示为平均值±标准误差。使用未配对学生的t吨-测试。

激活p75^NTR公司和细胞内钙²⁺LLD需要升高_GABA-A公司归纳

接下来我们问p75^NTR公司激活有助于LLD_GABA-A公司归纳。我们首先对proBDNF和p75进行免疫染色^NTR公司.前BDNF和p75^NTR公司在新生大鼠海马CA1和CA3区以及齿状回中有区别(图2A类). 在锥体细胞体和从胞体到放射层的轻度短突起中染色显著。染色模式与其他人获得的相同(Yang，Siao等人，2009年). 测试p75的贡献^NTR公司在LLD中_GABA-A公司诱导，海马脑片与p75孵育^NTR公司功能阻断抗体（1/100）或含TAT-pep5（2μM），一种p75的细胞渗透抑制剂^NTR公司信号(山下和东山2003). 在这两种情况下，活动恢复都未能诱发LLD_GABA-A公司(图2B类). sGABA的频率和振幅_A类-PSC分别从3.7±0.7 Hz变为4.5±1.2 Hz(n个= 9,P（P）=0.2）和从83±8到101±17 pA(n个= 9,P（P）=0.06），在TAT-pep5处理的切片中，从3.7±0.8到4.9±1.1 Hz(n个= 7,P（P）=0.07）和从87±7到101±14 pA(n个= 7,P（P）=0.1），p75^NTR公司功能阻断抗体处理切片。确定p75的位置^NTR公司，在移液管溶液中加入TAT-pep5（2μM）。LLD公司_GABA-A公司在TAT-pep5负载神经元中未观察到(图2C类，从2.1±0.7到2.5±1赫兹(n个= 7,P（P）=0.12）和75±7至90±12 pA(n个= 7,P（P）= 0.2)). 虽然我们不能完全排除TAT-pep5从突触后神经元向突触前终末的扩散，但这些观察表明突触后p75的激活^NTR公司LLD需要_GABA-A公司.

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图2。

p75的内源性激活^NTR公司LLD需要_GABA-A公司归纳。(A类)proBDNF和p75的免疫荧光检测^NTR公司在一只4天大的大鼠海马中（红色信号，上部图像），叠加在神经追踪免疫荧光上（Nt，绿色信号，下部图像）。p75^NTR公司高倍镜下显示CA3锥体层的免疫荧光信号（右栏）。(B类)sGABA的平均时间进程_A类-控制中活动恢复前后的PSC频率（灰色符号，n个=6），TAT-pep5处理切片（开放符号，n个=9）和p75^NTR公司功能块抗体处理切片（填充符号，n个= 7). (C类)sGABA的平均时间进程_A类-TAT-pep5负载神经元活动恢复前后PSCs的频率(n个= 7).

接下来，我们对这一结论提出质疑，并测试了BDNF调节分泌可能导致LLD的假设_GABA-A公司.因为，L型钙²⁺通道是BDNF突触后分泌所必需的，有助于诱导BDNF依赖型GABA能突触可塑性(Gubellini等人，2005年;Mohajerani等人，2007年;Kuczewski等人，2008年;Sivakumaran等人，2009年)，我们研究了L型钙的作用²⁺通道阻滞剂硝苯地平。硝苯地平（10μM）阻止LLD的诱导_GABA-A公司（2.1±0.4至2.2±0.5赫兹，P（P）= 0.2,图3A类; 69±17至87±10 pA，P（P）= 0.09,n个=5，未显示）。确定L型钙²⁺通道激活负责proBDNF的分泌，我们测试了抗裂解形式的proBDNF（CR-proBDNF，10 ng/mL）是否可以绕过硝苯地平的作用。活动恢复期间应用CR-proBDNF拯救LLD_GABA-A公司硝苯地平(图3A类，从4.3±0.9到3.4±0.7赫兹，P（P）= 0.04; 从90±27到110±24 pA，P（P）= 0.2,n个=6，未显示）。拯救LLD_GABA-A公司在p75中未观察到通过浴敷CR-proBDNF^NTR公司功能阻断抗体处理切片。sGABA的频率和振幅_A类-PSC分别从1.8±0.3 Hz变为2.1±0.4 Hz(P（P）=0.3）和90±10至110±20 pA(P（P）= 0.2,n个=5，未显示）在p75中应用CR-proBDNF后^NTR公司经抗体处理的切片。因此，这些结果表明Ca²⁺-需要依赖性分泌proBDNF来触发p75^NTR公司-有限责任公司_GABA-A公司.

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图3。

LLD需要调节性分泌proBDNF_GABA-A公司归纳。(A类)sGABA的平均时间进程_A类-在没有抑肽酶和硝苯地平（10μM）的情况下（对照组，开放标志，n个＝6）或CR前BDNF的存在（CR前BDNF中的冲刷、填充符号，n个=6）在恢复期内。(B类)sGABA的平均时间进程_A类-缺席情况下活动恢复前后的PSC频率（控制、开放符号、，n个=9）或存在CR-proBDNF（CR-proBNF中的冲刷，填充符号，n个=6）在BAPTA负载神经元的恢复期。(C类)sGABA的平均时间进程_A类-在没有抑肽酶和NBQX（5μM）的情况下（对照、开放符号、，n个=8）或存在CR-proBDNF（CR-proBNF中的冲刷，填充符号，n个= 6).

加深钙之间的关系²⁺和LLD_GABA-A公司诱导，钙²⁺将螯合剂BAPTA添加到吸管溶液中。LLD公司_GABA-A公司BATA负载神经元的诱导被阻止(图3B类，从5.3±0.5到5.9±1.2赫兹，P（P）=0.2，从79±9到82±13 pA，P（P）= 0.4,n个= 9). 虽然平均变化不显著，但sGABA的持续增强_A类-在记录的9个BAPTA负载神经元中，有4个神经元观察到PSCs频率（4.1±1.3至7.4±2.9 Hz）。这一观察表明，阻断细胞内钙²⁺-依赖过程可能揭示GABA能突触活动的增强（见下文）。

对这一结果的一种可能解释是，BAPTA阻止了Ca²⁺-导致LLD的前BDNF依赖性分泌_GABA-A公司另一种解释是LLD_GABA-A公司诱导需要钙^2+-依赖，但L型钙²⁺通道依赖性，突触后信号级联。为了解决这个问题，我们研究了浴用CR-proBDNF是否可以拯救LLD_GABA-A公司BAPTA负载神经元。在冲洗期间应用CR-proBDNF对频率没有显著影响(图3B类，从4.5±0.7到4.6±0.8赫兹，P（P）= 0.4,n个=6）和振幅（从58±8到62±8 pA，P（P）= 0.2,n个=6，未显示）的sGABA_A类-PSC。因此，除了激活p75下游^NTR公司，突触后钙²⁺-诱导LLD需要依赖信号级联_GABA-A公司.

在之前的研究中，我们发现AMPA受体的激活是通过激活L型钙来维持高水平BDNF分泌的必要条件²⁺冲刷期间的河道(Kuczewski等人，2008年). 确定诱导LLD是否也需要激活AMPA受体_GABA-A公司AMPA受体拮抗剂NBQX在洗脱期使用。LLD公司_GABA-A公司在NBQX（5μM）存在下未观察到(图3C类，从3.3±0.5到3.7±0.7赫兹，P（P）= 0.1,n个= 8). 然而，在活动恢复期间应用的CR-proBDNF（10 ng/mL）挽救了LLD_GABA-A公司在NBQX中(图3C类，从3.1±0.4到2.5±0.5 Hz，P（P）=0.007，从103±9到109±13 pA，P（P）= 0.3,n个= 6).

总的来说，这些实验表明，抑肽酶活性剥夺后的短暂恢复通过级联作用诱导GABA能突触活动的持续抑制，级联作用涉及AMPA受体的激活，在L型钙的控制下，促BDNF的分泌²⁺通道和突触后钙²⁺-依赖性和p75^NTR公司-依赖信号级联。

mBDNF-TrkB信号的抑制不考虑LLD_GABA-A公司归纳

激活p75^NTR公司据报道会导致轴突退化(Singh等人2008)或细胞死亡(Song等人，2010年)，至少部分是通过抑制Trk受体依赖的信号通路。因为，LLP_GABA-A公司诱导需要内源性BDNF激活TrkB受体(Kuczewski等人，2008年)我们想研究抑肽酶是否会损害mBDNF-TrkB受体信号传导。我们首先使用qRT-PCR和ELISA分析研究抑肽酶是否影响BDNF的产生。我们发现BDNF mRNA没有显著差异(n个=每种情况下4个完整的海马，P（P）=0.3）和蛋白质水平(n个=每种情况下4片，P（P）=0.7）在对照组和抑肽酶处理的切片之间(图4A、 B类).

接下来我们测试了mBDNF对sGABA的影响_A类-PSC。浴敷mBDNF（10 ng/mL）诱导sGABA的持续增强_A类-PSC频率和振幅（从3.4±0.9到4.3±1.1 Hz，P（P）=0.005，从68±5到90±8 pA，n个= 8,P（P）=0.04）和存在（从3.4±1.2到4.4±1.5 Hz，66±9到85±8 pA，n个= 7,P（P）=0.04）抑肽酶(图4C类). 我们还测试了外源性mBDNF（10 ng/mL）是否可以缓解LLP的不足_GABA-A公司在抑肽酶中。在对照实验中，sGABA_A类-PSC频率和振幅分别下降了25±5%和10±12%(n个=5），在抑肽酶活性恢复后30分钟(图4天). 当在抑肽酶恢复期应用mBDNF时，sGABA的频率和振幅_A类-PSC分别增加了13±17%和35±14%(n个= 6,图4天). 因此，在抑肽酶恢复期应用mBDNF可显著增强sGABA_A类-与单用抑肽酶的活性恢复相比，PSC的频率和振幅(P（P）=0.001，未配对t吨-测试）。因此，这些结果表明mBDNF-TrkB信号不受抑肽酶的影响。

为了证实这一观察结果，我们使用磷酸化形式的cAMP反应元件结合蛋白（CREB）来监测内源性BDNF对TrkB受体的激活(佛罗伦萨等人，2009年). 为了使不同切片的结果标准化，对pCREB与CREB的比值进行了量化。对照ACSF中突触活动的恢复显著增加了pCREB/CREB比率，TrkB-IgG阻止了这一作用，但TrkA-IgG没有阻止这一作用(图5). 当用抑肽酶恢复活性时，未观察到pCREB/CREB比率的增加(图5). 然而，抑肽酶并没有消除对外源性mBDNF的反应(图5)从而支持mBDNF-TrkB信号不受抑肽酶影响的结论。

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图5。

内源性BDNF诱导CREB磷酸化。(A类)CREB的免疫荧光信号（红色，上部面板）、磷酸化CREB（pCREB，绿色，中部面板）以及叠加在神经追踪免疫荧光上的合并CREB和pCREB信号（Nt，蓝色信号，下部面板）。白色虚线分隔了金字塔层。(B类)不同条件下的平均pCREB/CREB比率（3片，每片10至15个神经元）。

总的来说，观察到与Trk受体家族偶联的蛋白酪氨酸激酶膜透性抑制剂k252a并不能揭示LLD_GABA-A公司(Kuczewski等人，2008年)这些数据表明p75的活化^NTR公司而不是mBDNF-TrkB信号的失活，这是LLD所必需的_GABA-A公司抑肽酶的诱导。

ProBDNF-p75信号通路诱导发育中大鼠海马GABA能突触活性的双向控制

BDNF是作为前体合成的，前体经过蛋白水解裂解生成成熟形式。是否分泌了前BDNF一直存在争议(松本等人，2008年;Yang，Siao等人，2009年). 在本研究中，我们提供的证据表明，新生大鼠海马中有很大一部分BDNF作为前体分泌，并通过p75发出信号^NTR公司诱导GABA能突触活动的双向控制。因此，我们发现在不同蛋白酶中抑制纤溶酶活性的细胞不耐丝氨酸蛋白酶抑制剂抑肽酶的活性恢复(Teng等人，2005年)-可以抑制或增强GABA能突触活动水平。两种塑性形式都依赖于proBDNF-p75^NTR公司因为它们被p75的阻滞剂阻止而发出信号^NTR公司在阻止调节的BDNF突触后分泌的条件下（即硝苯地平或NBQX；Lessmann等人，2003年;Kuczewski等人，2008年;Matsuda等人，2009年). 此外，实验表明，镀液中应用CR-proBDNF会导致p75^NTR公司-在没有GABA的情况下，分别施加GABA能突触活性的增强或抑制(图3A、 C类)或在场(图7A、 C类)NMDA受体拮抗剂D-AP5，清楚地证明了proBDNF-p75的双向作用^NTR公司GABA能突触活动的信号传导。因此，NMDA受体的活性依赖性激活可以转换proBDNF-p75的作用^NTR公司GABA能突触活动的增强途径（p75^NTR公司-有限责任合伙_GABA-A公司)至抑郁症（p75^NTR公司-有限责任公司_GABA-A公司).

BDNF的调节分泌是诱导GABA能突触可塑性的必要条件

BDNF可以从轴突和树突分泌²⁺-依赖）和本构（Ca²⁺-独立）方式(Lessmann和Brigadski 2009年). 先前的研究报告称，L型钙可以阻止BDNF的树突状释放²⁺通道阻滞剂(Kolarow等人，2007年;Matsuda等人，2009年)而轴突BDNF的释放被N型钙阻止²⁺通道阻滞剂(Balkowiec和Katz 2002;Wang等人，2002年;Matsuda等人，2009年). 在本研究中，L型钙²⁺通道阻滞剂硝苯地平阻止p75的诱导^NTR公司-有限责任公司_GABA-A公司和p75^NTR公司-有限责任合伙_GABA-A公司，通过外源性应用CR-proBDNF挽救的效果。除了发现GABA能中间神经元本身不产生神经营养素外(Ernfors等人，1990年;Gorba和Wahle 1999年)这一结果表明，CA3锥体神经元分泌的前BDNF的树突状分泌物需要诱导p75^NTR公司-有限责任公司_GABA-A公司和p75^NTR公司-有限责任合伙_GABA-A公司(图8). 即使L型Ca²⁺在记录的神经元中，通道不太可能被激活（电位被钳制在−70 mV），L型钙²⁺位于邻近细胞上的通道在活动恢复过程中被激活，并将有助于BDNF的分泌，从而导致GABA能突触可塑性(Kuczewski等人，2008年). 我们进一步表明，AMPA受体拮抗剂NBQX可阻止两种形式的可塑性诱导，外源性应用CR-proBDNF可挽救NBQX的抑制作用。这些观察结果表明，在活动恢复期间激活AMPA受体是触发前BDNF分泌和随后GABA能突触可塑性的必要条件。与这一假设相一致，使用ELISA BDNF免疫检测，我们之前已经证明，在发育中的大鼠海马中AMPA受体介导的突触活动恢复期间，BDNF分泌上调(Kuczewski等人，2008年). 此外，在神经元培养物中观察到突触前强直刺激谷氨酸能末端后，树突状AMPA受体依赖性分泌BDNF-GFP(Hartmann等人，2001年). 总的来说，这些观察结果支持这样的观点，即受调节的树突状分泌的前BDNF在p75的诱导中起着指导作用^NTR公司-有限责任公司_GABA-A公司和p75^NTR公司-有限责任合伙_GABA-A公司在发育中的大鼠海马(图8).

我们要感谢L.Aniksztejn博士、C.Rivera博士和I.Medina博士批判性地阅读了手稿的早期版本。利益冲突：未声明。