胃肠病学。作者手稿；PMC 2013年3月29日提供。
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小鼠和人中Hedgehog应答子代的积累与酒精性肝病严重程度平行
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阿莱西亚·奥梅内蒂
*北卡罗来纳州达勒姆杜克大学医学系
Margon Vandongen公司
*北卡罗来纳州达勒姆杜克大学医学系
理查德·米尔顿
‡北卡罗来纳州教堂山北卡罗莱纳大学医学系
伊恩·海因斯
‡北卡罗来纳州教堂山北卡罗莱纳大学医学系
理查德·A·里普
‡北卡罗来纳州教堂山北卡罗莱纳大学医学系
*北卡罗来纳州达勒姆杜克大学医学系
‡北卡罗来纳州教堂山北卡罗莱纳大学医学系
§胃肠病学和肝病学系
∥瑞士日内瓦大学医院病理科
请将转载请求发送至：Anna Mae Diehl，MD，Florence McAlister，Duke University教授兼胃肠科科长，Snyderman Building（GSRB-1），595 LaSalle Street，Suite 1073，Durham，North Carolina 27710。ude.ekud.cm@lheid.eamanna Y.J.和K.D.B作为第一作者对这项工作做出了同样的贡献。
- 补充资料
1
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摘要
背景和目标
改善酒精性肝病（ALD）的预后需要更好地了解习惯性乙醇（EtOH）摄入如何改变肝脏内的正常再生机制。Hedgehog（Hh）通路的激活促进了其他组织中祖细胞群体的扩张。我们评估了慢性EtOH暴露激活肝脏Hh信号的假设。
方法
对喂食食物、高脂饮食（HF）或HF+EtOH 4周的小鼠的Hh信号转导、肝祖细胞、转化生长因子（TGF）-β诱导和肝损伤进行比较。比较Hh反应性肝细胞（如未成熟胆管细胞和卵圆细胞）和成熟肝细胞（对Hh无反应）对TGF-β介导的凋亡的敏感性。对比对照组和ALD患者的Hh反应细胞在肝脏的蓄积，并与预测亚急性死亡率的判别函数（DF）相关。
结果
HF小鼠的Hh信号和Hh反应细胞数量增加，HF+EtOH小鼠的增加最大。在这两种细胞中，祖细胞和基质细胞群都含有Hh反应细胞。HF+EtOH小鼠中的导管型祖细胞和纤维化标记物多于HF小鼠。前者也表达更多TGF-β-1。TGF-β-1治疗可选择性地提高Hh反应性未成熟肝细胞的活性，并使存活的成熟肝细胞产生Hh配体。ALD患者的Hh反应细胞增多。与DF<32的患者相比，DF>32的患者Hh-反应性未成熟导管细胞的小叶积累更大。
结论
ALD中Hh信号增加，可能通过促进未成熟导管细胞在肝脏的积聚而影响ALD结果。
习惯性饮酒会促进肝细胞死亡，并抑制存活的成熟肝细胞的增殖，导致慢性肝损伤。1,2酒精性肝损伤通常伴有导管反应，其特征是非典型胆管细胞（称为导管细胞）和相关基质元素（包括肌纤维母细胞和纤维基质）在门脉周围积聚。与许多其他类型的慢性肝病一样，三在酒精性肝病中，这种导管反应的强度与肝损伤的严重程度密切相关。4随着脂肪肝损伤的进展，导管细胞、肌成纤维细胞和纤维化常常延伸到肝实质、肝细胞包埋物和桥接相邻的门管区。5对患有各种慢性肝病的实验动物和人类的研究一致表明，这些基质细胞和导管细胞具有高增殖活性，并表明其中许多细胞表达未成熟细胞的标志物。6,7这些发现支持这样的观点，即导管反应代表了健康成人肝脏中沿Hering运河分布的典型不明显肝祖细胞的后代的扩张，并表明导管反应参与肝脏修复。8幸运的是，关于调节肝损伤时导管反应的机制的知识正在增长9–13因为这些信息可能会为酒精诱导肝损伤患者提供新的治疗靶点，以减少肝纤维化和促进肝再生。
最近，我们的小组发现参与导管反应的几种主要细胞类型，即双功能肝祖细胞（即卵圆细胞）、未成熟胆管细胞和肝肌成纤维细胞，产生Hedgehog（Hh）配体并对其产生反应。14–16这一观点与肝脏修复有潜在的相关性，因为Hh信号调节胚胎发生以及损伤后许多成人组织的重塑。17–24我们报道，在啮齿动物和人类中，胆管损伤伴随着门脉基质细胞和胆管细胞中Hh信号的强烈诱导。16,25然而，目前尚不清楚慢性饮酒等肝实质损伤是否会导致类似的Hh信号激活。如果酒精性肝损伤确实诱导了Hh信号转导，那么确定细胞类型、相关机制和临床意义将非常重要。
本研究评估了Hh信号在参与慢性酒精诱导肝损伤引起的导管反应的细胞中激活的假设。我们的分析包括培养细胞、酒精诱导脂肪性肝炎小鼠模型和临床晚期酒精性肝病患者的肝活检样本。结果支持我们的假设，并确定了之前未被认识到的Hh应答祖细胞的积累与重度酒精性脂肪性肝炎患者短期死亡率风险之间的联系。
材料和方法
动物研究
16只成年雄性小鼠（来自马萨诸塞州巴尔港市杰克逊实验室）被分为3组。第1组（n=4）随意喂食常规食物，第2组（n=3）和第3组（n/9）通过连续灌胃给予不含（第2组）或含（第3组）乙醇（EtOH）的高脂液体饮食。26在4周的喂养期内，对小鼠进行密切监测，以确保配对喂养组的体重增加率具有可比性。研究结束时，处死所有动物以获取血清和肝组织进行分析。
实验室分析
在当地商业实验室用自动分析仪测量血清转氨酶。从储存在−80°C下的冷冻切片肝脏样品中提取总RNA。在确保RNA质量和浓度后，通过定量逆转录聚合酶链反应（QRT-PCR）分析评估基因表达。16小鼠引物序列总结于补充表（见在线补充表，网址：网址：www.gastrojournal.org). 福尔马林固定、石蜡包埋的肝脏切片用H&E染色以评估一般组织学；天狼星红染色用于评估肝纤维化，16用免疫组织化学方法定位Hh靶基因和其他细胞标志物的表达。25初级抗血清按以下稀释液使用：抗-Ptc（sc-6149，1:50；Santa Cruz Biotechnology，Santa Cru，CA）、抗Gli2（ab 26056，1:1000；Abcam Ltd）、细胞角蛋白（CK）（Pan）（18-0132，1:500；Invitrogen）。在每种情况下，通过证明消除初级抗血清可消除染色，从而确定染色特异性。
细胞培养实验
成熟肝细胞、AML-12细胞（ATCC；CRL-2254）、未成熟胆管细胞、603B细胞（由明尼苏达州罗切斯特市梅奥诊所G.Gores提供）、，27和双功能肝上皮祖细胞（即卵圆细胞）EpC10细胞（由纽约阿尔伯特·爱因斯坦医学院M.Dabeva提供）28在常规培养基中培养，然后在无血清培养基中放置18小时，然后添加浓度为2 ng/mL的转化生长因子（TGF）-β1（明尼苏达州明尼阿波利斯R&D Systems）。在培养过程中的几个不同时间点（从0到48小时）采集总RNA和蛋白质。用QRT-PCR和Western blot检测基因和蛋白表达。根据制造商的建议进行半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3/7分析（G7791，Promega）。简单地说，将细胞接种在约70%的汇合处的96个培养板上，然后将其血清饥饿18小时，然后进行TGF-β1 2-ng/mL处理。通过添加Caspase 3/7底物并测量荧光，在预定时间点对细胞进行分析。AML-12细胞在Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）/F12（Gibco；11330-032）、10%胎牛血清（FBS）、40ng/mL地塞米松（Sigma；D-4902）、5µL/mL胰岛素（Sigma；I-0516）、5ng/mL亚硒酸钠（Sigma；s-5261）、5µg/mL载脂转铁蛋白（Sigma；T-2036）和5mL青霉素/链霉素（Gibco；15070-63）中繁殖。在DMEM（Sigma，D-6429）、10%FBS和5 mL青霉素/链霉素（100×）中培养未成熟胆管细胞和EpC10细胞。
人类研究
从瑞士日内瓦大学医院病理科组织库中获取经生物药物证实的酒精性脂肪性肝炎患者的福尔马林固定石蜡包埋肝脏切片，其中组织样本与匿名的人口统计学和临床数据相关联。将酒精性肝病受试者的结果与3名无慢性肝病、因结肠转移而进行肝切除的对照者的肝脏样本结果进行比较。对照肝组织取自杜克大学医学院组织库共享资源，并按照美国国立卫生研究院和人体研究机构指南进行研究。通过免疫组织化学方法对未染色切片进行评估，以定位Hh靶基因（如上所述）、一个祖细胞标记物CK7（M7018，1:750；Dako）和2个间充质标记物波形蛋白（M7020，1:500；Dako）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）（M0851，1:1000；Dako.）的表达。聚合物辣根过氧化物酶（HRP）抗兔（K4003；Dako）、兔抗羊IgG-HRP（sc-2922，1:500；Santa Cruz生化）或MACH3小鼠AP聚合物试剂盒（MP530，Biocare Medical）用作二级抗体。所有受试者均已根据美国国立卫生研究院和机构指南提供了参与组织库/数据库的知情同意书。
细胞计数
通过形态计量学（MetaView软件；宾夕法尼亚州唐宁顿Universal Imaging Corp）评估天狼星红染色、CK7和斑片（Ptc）免疫组织化学染色。为了量化天狼星红染色，对每只小鼠随机选择的10个×20个区域/节段进行评估。为了量化Ptc染色，每只小鼠每节随机选择8个中层区域，×40。在排除各门管（PT）中的主胆管后，在放大×40倍的条件下，对7个PT/载玻片中Gli2阳性染色的细胞进行计数。选择用于分析的PT包含120至180µm的门静脉。Gli2阳性胆管细胞的平均数量是通过阳性细胞总数除以门管区总数得出的。通过计算每场Gli（+）肝细胞总数并除以每场肝细胞总数来量化Gli2-阳性肝细胞。
结果
乙醇消耗促进高脂饮食诱导的肝脂肪变性向脂肪性肝炎的发展
慢性胃内输注高脂肪（HF）饮食诱发轻度肝脂肪变性和局灶性炎症()但很少诱导肝细胞凋亡(). 同时摄入EtOH和HF饮食加剧了肝损伤，如脂肪变性增加、肝细胞损伤()和TUNEL阳性肝细胞的数量(). 胱天蛋白酶3裂解产物的免疫组织化学评估证实EtOH处理显著增加了肝细胞凋亡。半胱天冬酶3激活阳性染色的肝细胞百分比在喂食对照组为3.6±1.9，在喂食HF小鼠为0.5±0.4，在HF+EtOH组为37.0±20.8(P（P）HF+EtOH与其他对照组相比<.05）（代表性显微照片如补充材料1; 参见在线补充材料网址：www.gastrojournal.org). 此外，EtOH-fed小鼠的血清转氨酶值趋于升高（丙氨酸转氨酶[ALT]（IU/L）:HF，21.6±10.8 vs EtOH，148.3±158），肝脏RNA的QRT-PCR分析显示胶原蛋白（I）α1基因表达更高()，尽管在天狼星红染的肝脏切片中胶原沉积不明显（数据未显示）。
乙醇（EtOH）诱导的脂肪性肝炎小鼠模型。典型高脂肪饮食（HF）的H&E染色肝脏切片(A类)和HF+EtOH-fed(B类)小鼠（原始放大倍数，×40）。盒插入A类和B类分别说明微泡脂肪变性(A类)，脂肪变性膨胀的肝细胞(B类)和凋亡体(B类)在更高的放大倍数下（原始放大倍数，×63）。箭头表示Mallory尸体。典型HF的TUNEL染色肝切片(C类)和HF+EtOH(天)老鼠。喂食对照组中TUNEL（+）细胞的数量(反对的论点，n=4）、HF小鼠（n=4个）和HF+EtOH小鼠（n=9个）(E类). 三个治疗组全肝RNA中胶原蛋白（I）α的QRT-PCR分析(F类). 结果如图所示E类和F类表示为平均值±SD*P（P）< .05; **P（P）< .005.
脂肪肝损伤期间Hh通路激活
脂肪性肝病伴随着Sonic hedgehog（Shh）配体在肝脏的表达增加()和几个Hh靶基因，包括Hh受体，补丁（Ptc，)，Gli-2，一种Hh调节的转录因子(),29和Frizzled相关肽（Frp）-1，一种典型Wnt信号的可溶性抑制剂().30有趣的是，在EtOH-fed小鼠中，Sonic hedgehog配体和Hh信号成分Ptc和Gli-2的诱导作用大于HF对照组，而EtOH的摄入并未增强HF饮食相关Frp-1的增加。
脂肪肝中刺猬配体和刺猬靶基因的表达增加。从饲料对照组的肝脏中分离出RNA(反对的论点、HF小鼠（n=4）和HF+EtOH小鼠（n=9），并通过QRT-PCR进行分析。结果以Sonic hedgehog的平均值±SD表示(嘘) (A类)，已修补(私人投资公司) (B类)，Gli2(C类)和Frizzled相关肽(Frp公司) 1 (天). *P（P）< .05; **P（P）< .005.
EtOH-Fed小鼠肝脏Hh-反应细胞的蓄积
如信使RNA（mRNA）表达数据预测()以及之前的一项研究，16在喂食食物的对照组中，只有罕见的胆管或肝细胞（HEP）细胞表达Hh-靶基因（Gli-2或Ptc）(). HF饮食在一定程度上增加了Hh反应细胞在肝脏的蓄积，表现为胆道和HEP细胞表达Gli2的数量增加()或Ptc(). 在HF小鼠中，Hh反应细胞主要位于PT及其周围。EtOH的摄入导致表达Gli2-和Ptc-的细胞的全面扩张(). 这些Hh反应细胞不仅聚集在PT周围，而且HEP-Gli2/Ptc（+）细胞也延伸到肝小叶的中区/静脉周区。
在HF和HF+EtOH小鼠中表达Hh靶基因Gli2和Ptc的细胞的肝脏积聚。对随机选择的3只小鼠/治疗组的肝脏切片进行免疫组织化学染色。Gli2公司(A类和C类)和修补程序（Ptc）(B类和天)在典型的HF小鼠中(A类和B类)和HF+EtOH小鼠(C类和天)分别为（原始放大倍数，×40）。在7个门静脉三联体（PT）/切片中计数Gli2（+）胆管细胞（BD）和肝细胞（HEP）细胞。Gli2（+）BD表示为每PT的Gli2(线形图)和Gli2（+）HEP细胞表达为Gli2+细胞核/HEP细胞总数的百分比(条形图) (E类). 通过形态计量学测量8个中层区域/截面的Ptc（+）细胞(F类). 绘制所有小鼠的平均±SD结果*P（P）< .05, **P（P）<0.005与CON。
脂肪肝肝祖细胞和导管细胞的扩增
在肝脏和许多其他组织中，成熟的上皮细胞对Hh无反应。然而，分化程度较低、间充质表型较多的细胞往往表现出Hh活性。当这些细胞分化并获得更成熟的上皮表型时，它们通常对Hh配体没有反应。14,31因此，Hh活性增加的证据()HF+EtOH-fed小鼠肝脏中Hh反应细胞的积累()这表明，乙醇诱导的小鼠肝损伤可能促进了相对未成熟的肝上皮细胞对肝脏的重新增殖。
为了研究这种可能性，对肝脏切片进行AE1/AE3染色，AE1/AE是胆管细胞和能够生成肝细胞或胆管细胞的双功能肝祖细胞的标记物。28健康对照小鼠的肝脏只有罕见的表达AE1/AE3的PT细胞(). 相反，在两个HF对照组中，表达AE1/AE3的门脉导管周围细胞数量增加()和HF+EtOH()组。与HF对照组相比，HF+EtOH小鼠的这种非典型导管反应似乎从门脉区延伸到肝小叶。后一项发现表明，摄入EtOH可能会干扰肝祖细胞的分化，有利于导管细胞的积累，而牺牲了更多的肝细胞。QRT-PCR结果支持这一概念。在HF对照组和HF+EtOH-fed小鼠中，双功能祖细胞标记物CK-7的表达增加相当相似，而只有EtOH喂养刺激了胆道发育所需的转录因子HNF-6的表达，32和CK-19，未成熟和成熟胆管细胞的标志物().33
脂肪肝损伤期间肝祖细胞和胆管细胞的扩张。典型食物对照组的AE1/3免疫组织化学染色(A类)，HF鼠标(B类)和2只不同的HF+EtOH小鼠(C类和天)（原始放大倍数，×40）。饲料对照组全肝RNA中CK7、HNF6和CK19的QRT-PCR分析(反对的论点，n=4），HF（n=4，和HF+EtOH小鼠（n=9）(E类). 平均值±标准差*P（P）< .05.
TGF-β-1增加有利于酒精损伤小鼠肝Hh-反应性导管细胞的积累
由于高TGF-β-1促进具有导管表型的细胞聚集，而低TGF-α-1允许在肝脏发育过程中出现表达成熟肝细胞基因的细胞，34我们评估了小鼠TGF-β-1 mRNA的表达。正如其他人报告的那样，35我们发现胃内灌注EtOH可显著增加TGF-β-1的表达()，增加了TGF-β-1可能对EtOH-fed组导管细胞的优势作出贡献的可能性。
脂肪肝损伤诱导TGF-β-1，成熟和未成熟肝细胞的反应不同。喂食对照组（CON，n=4）、HF（n=4，和HF+EtOH（n=9）小鼠全肝RNA中TGF-β-1的QRT-PCR分析(A类). 成熟肝细胞经24小时TGF-β-1治疗（2 ng/mL）后Caspase 3/7活性(AML12型)，未成熟胆管细胞(603亿)和椭圆形细胞(环氧丙烷10) (B类). TGF-β处理的AML12细胞中印度刺猬（Ihh）的表达。QRT-PCR分析结果(C类)和Western blot分析(天). 所有结果均显示为平均值±SD*P（P）< .05, **P（P）<.005 vs CON或车辆。
为了更直接地评估这种可能性，我们用TGF-β-1处理了各种肝上皮细胞系，并检测了其对细胞活力和基因表达的影响。TGF-β-1对细胞活力的影响(). 用TGF-β-1处理成熟肝细胞（AML-12细胞）可显著激活凋亡半胱天冬酶，而相同剂量的该细胞因子未能激活未成熟胆管细胞（603B细胞）或双功能肝祖细胞（卵圆细胞，EpC10）的凋亡。有趣的是，胆管细胞和卵圆细胞，15,16但不是成熟的肝细胞，14,15已知具有Hh响应性。在前两种细胞类型（但不是肝细胞）中，Hh配体抑制凋亡并促进生长。15,16正如其他人最近报告的那样，36TGF-β-1对AML-12细胞的治疗也下调了上皮标记物，但上调了存活细胞中各种间充质标记物的表达（参见补充材料2; 参见在线补充材料网址：www.gastrojournal.org). 有趣的是，我们发现逃避TGF-β杀伤的肝细胞显著上调了Ihh mRNA的生成()和蛋白质(). 然而，在任何评估的时间点，他们都没有表达明显水平的各种Hh靶基因（包括Gli1、Gli2、Gli3、Ptc或frp-1）（数据未显示）。因此，当暴露于TGF-β-1时，成熟肝细胞要么死亡，要么经历上皮-间充质转化，并开始产生Hh配体，这些因素可促进Hh反应性导管和卵圆形细胞群的生存和生长。这些结果支持了这样一个概念，即TGF-β-1的增强暴露有助于EtOH-fed小鼠中具有更多导管表型的细胞的积聚。
Hh反应细胞参与人类对酒精诱导的脂肪性肝炎的导管反应
由于现有的酒精性肝病小动物模型并不能完美地再现人类酒精性肝损伤的所有方面，我们将我们对Hh途径的分析扩展到临床上严重的、经生物病理证实的酒精性脂肪性肝炎患者的福尔马林固定、石蜡包埋肝切片(). 与组织学正常的对照组相比，所有临床严重酒精性脂肪性肝炎患者都有显著的肝纤维化()表达Ptc的肝细胞数量急剧增加()和Gli-2(). 这些Hh反应细胞通常被包裹在纤维隔内和/或局限于纤维隔附近。它们表现出基质细胞、非典型导管细胞或肝细胞的形态学特征。为了更好地表征Hh反应性导管样细胞的表型，我们对α-SMA、波形蛋白和CK-7的表达进行了连续切片评估。在表达间充质标志物α-SMA的导管结构中发现了表达Gli-2的细胞()31和波形蛋白()37以及上皮祖细胞标记物CK-7(). 这些结果表明，伴随人类严重酒精诱导肝损伤的导管反应包括可能正在经历上皮-间充质转化的Hh反应性未成熟细胞群体。
人类酒精性肝病（ALD）的导管反应。典型酒精性肝病患者的天狼星红染色(A类).盒子显示健康肝脏对照患者的天狼星红染色（均为40倍放大）。Ptc的免疫组织化学染色(B类)和Gli 2(C类)ALD代表性患者的肝脏（原始放大倍数，×40）。Gli2和αSMA双重免疫组化染色(天)，波形蛋白(E类)，或CK 7(F类)代表性ALD肝脏。棕色是Gli2，并且蓝色是α-SMA、Vimentin或CK 7。箭头显示增生的导管细胞，Gli2和αSMA或Vimentin双重阳性（原始放大倍数×63）。
表1
病人
数 | 性别 | 年龄，
年 | 乙醇 | 体重指数 | 肝硬化
（是/否） | 脂肪变性
(%) | 脂肪性肝炎
（是/否） | 马德丽
（DF）>32 | 儿童读物
分数 | 比利
（µmol/L） |
|---|
| 1 | M（M） | 39 | 是的 | <25 | 是的 | 80 | 是的 | 不 | 8 | 121 |
| 2 | M（M） | 38 | 是的 | <25 | 是的 | 80 | 是的 | 是的 | 14 | 443 |
| 三 | M（M） | 55 | 是的 | <25 | 是的 | 0 | 是的 | 是的 | 12 | 160 |
| 4 | F类 | 53 | 是的 | <25 | 是的 | 90 | 是的 | 不 | 9 | 243 |
| 5 | M（M） | 62 | 是的 | <25 | 是的 | 50 | 是的 | 是的 | 11 | 72 |
| 6 | M（M） | 44 | 是的 | <25 | 是的 | 70 | 是的 | 是的 | 12 | 361 |
| 7 | M（M） | 59 | 是的 | <25 | 是的 | 20 | 是的 | 不 | 7 | 25 |
| 8 | M（M） | 51 | 是的 | <25 | 是的 | 20 | 是的 | 不 | 8 | 26 |
| 9 | F类 | 56 | 是的 | <25 | 是的 | 70 | 是的 | 不 | 10 | 40 |
临床重度酒精性脂肪性肝炎患者未成熟导管细胞的积聚与生存预测因子的相关性
肝组织学是急性酒精性肝炎患者1个月死亡率的不良预测因素。38一个月的死亡率与肝失代偿的临床特征（如高胆红素血症和凝血病）密切相关。事实上，Maddrey判别函数（DF；DF=4.6×（PT-Control（sec））+胆红素（mg/dL））是一个包含这些临床参数的公式，通常用于识别短期死亡率风险最大的酒精性脂肪性肝炎患者。根据Maddrey DF值预测，高死亡率超过32。39–41鉴于胆红素的清除和凝血因子的合成是成熟肝细胞的功能，因此肝功能障碍更严重、死亡率更高的患者的肝脏可能含有更多未成熟肝上皮细胞。为了评估这种可能性，我们比较了DF＜32患者和DF＞32患者的未鉴定肝脏切片上共表达CK-7的Gli-2（+）细胞的含量和分布。令人惊讶的是，这个简单的评估将患者分为两个离散的亚群。高致死风险患者（DF>32）肝实质的中区和静脉周围区域的Gli2/CK7（+）细胞显著增多()与低死亡率风险患者的可比区域相比（DF<32）(). 当进行线性回归分析以评估Gli2/CK7（+）细胞数量与其他临床/实验室参数之间的相关性时，这些肝祖细胞的积累与DF之间存在显著相关性(R（右）=0.71），Child-Pugh分数(R（右）= 0.80) (P（P）<.05）。较高的血清胆红素值也与肝祖细胞的积累有关(R（右）= 0.64) (P（P）= .09). 这些发现支持这样的观点，即肝功能较差的患者的肝脏中含有更多的Gli2/CK（+）细胞。
酒精性脂肪性肝炎患者中Gli2/CK7双阳性导管细胞的小叶积聚与高短期死亡率相关。Gli2双重免疫组织化学染色(棕色的)和CK7(蓝色)短期死亡率低风险的代表性患者的肝实质内（Maddrey判别函数（DF）<32）(A类)以及另一个具有代表性的短期死亡率高风险患者（Maddrey DF>32）(B类)（原始放大倍数，×63）。通过形态计量学对所有受试者6个实质区域/断面的双（+）细胞进行定量，并比较Maddrey DF<32（n=5）和MaddreyDF>32（n=4）患者的平均±SD结果(C类). *P（P）< .05. Gli2/CK7（+）细胞积累与DF的相关性(天,P（P）<.05），Child-Pugh分数(E类,P（P）<0.05）和血清胆红素（F=0.64）(P（P）< .1).
讨论
这项研究表明，Hh信号在参与小鼠和人类慢性酒精诱导肝损伤引发的导管反应的细胞中被激活。酒精性肝病期间Hh通路激活的新证据补充并扩展了慢性胆汁淤积性肝病时Hh信号增加的证据。16,25累积数据表明，Hh途径激活是动员肝祖细胞群的各种类型肝损伤的共同特征。我们的结果还与Hh途径激活、祖细胞积累、肝功能障碍和肝脏疾病相关死亡率的短期风险增加有关。这些发现为基础研究和翻译研究提供了新的领域。例如，重要的是阐明调节受损肝脏中Hh信号的机制，并确定是否（以及如何）操纵这一过程以最大限度地促进肝再生，同时最大限度地减少肝功能障碍和结构扭曲。
发育生物学的最新进展可能有助于表征和控制成人肝损伤Hh信号传导的进展。Hh信号转导在胚胎发生过程中调节组织重塑已被广泛承认。42,43Hh配体通过充当形态原来协调组织发育。通路激活引发一个复杂的自分泌和旁分泌信号网络，最终以牺牲其他细胞为代价扩大某些细胞群，从而控制各种组织中细胞的组成和定位。17,44显然，类似的机制介导成人组织损伤后的重建，因为据报道，在各种成人组织损伤期间会发生Hh途径激活。45注射Hh配体可以改善梗死心肌和缺血性神经病变的修复，这进一步证明了Hh信号在受伤成人中正常发挥净营养作用的可能性，正如在胚胎中一样。21然而，适当限制Hh途径活性对良好结果至关重要，因为过量的Hh信号转导会导致胚胎发育异常46并促进成人多种癌症的生长，包括肝细胞癌和胆管癌。47目前的结果表明，通过促进损伤肝脏与未成熟细胞和成纤维细胞的再生，成人Hh途径的过度激活也会产生新的、更直接的负面后果（即器官功能障碍）。
在胎儿发育期间，46在成人组织修复过程中，多种机制可能参与Hh反应细胞的调节。TGF-β超家族成员是胚胎发生过程中Hh信号的重要调节剂。48同样，我们发现TGF-β-1诱导成熟肝细胞产生Hh配体，并证明Hh配子和Hh靶基因（如Ptc和Gli2）的表达与损伤肝脏中TGF-α-1的表达平行。鉴于Hh配体促进未成熟肝上皮细胞和肌成纤维细胞的增殖，14,16,25毫不奇怪，我们注意到各种祖细胞和纤维化标记物的表达增加伴随着病变肝脏中Hh通路活性的上调。此外，与胎儿祖细胞一样，成人肝祖细胞中的Hh活性可促进存活。在这里，我们证明了Hh反应性未成熟胆管细胞和双能肝祖细胞16,25受到TGF-β-1介导的细胞凋亡的保护。相反，我们证实了早期报道TGF-β-1促进成熟肝细胞凋亡。49我们还发现了TGF-β-1可能抑制成熟肝细胞群生长的另一种新的间接机制。这涉及Hh靶基因的增加表达，包括Wnt抑制剂Frp-1。30肝细胞增殖需要典型的Wnt信号传导。50因此，Frp-1介导的抑制这一过程预计会限制成熟肝细胞的增殖，为未成熟和成纤维细胞肝细胞提供进一步的生长优势，并有助于解释为什么后2种细胞群的生长与受损肝脏中成熟肝细胞群的增长呈负相关。50
总之，我们的发现为酒精性肝病和其他慢性肝病的进展提供了一种新的模型。肝损伤会刺激各种生长调节细胞因子的产生，包括TGF-β-1。其中一些与损伤相关的细胞因子，如PDGF-BB51和TGF-β-1，上调某些类型的常驻肝细胞生成Hh配体。在存在生长调节细胞因子的情况下，Hh途径敏感性的细胞类型相关差异可能会提供选择压力，有助于扩大Hh应答的未成熟肝细胞和肌成纤维细胞的数量，同时缩小Hh非应答的终末分化细胞（如成熟肝细胞）的数量。因此，肝脏被未成熟的肝上皮细胞和成纤维细胞重新填充。这种导管反应扭曲了正常的肝脏结构，导致一定程度的肝功能障碍，至少在短期内增加了肝脏相关死亡率的风险。另一方面，由于导管反应扩大了祖细胞群，最终生成“新鲜”肝细胞来取代衰老和受损的细胞，8,52Hh信号在肝脏修复中也起着关键作用。然而，成功重建正常肝脏结构/功能可能需要Hh信号的最终下调，因为过度的Hh通路活性会导致畸形发生。42,43因此，我们认为适当的Hh途径激活是最终从酒精介导的慢性肝损伤中恢复的先决条件。
需要进行进一步研究，以评估这些概念的有效性，并确定优化导管反应最有利方面的可行性。进展可能很困难，因为似乎Hh途径激活具有不同的后果，使得在全球范围内增加或减少Hh信号的简单的全或单方法不太可能成功。然而，鉴定特定的信号传导介质，如纤维生成细胞因子和Hh配体，以及在肝损伤期间产生和/或响应这些因子的细胞，是这一过程中重要的初始步骤。
致谢
部分由NIAA 5RO1-A010154（向A.M.D.）提供的资金支持。作者感谢卡尔·斯通的行政支持。
本文中使用的缩写
| CK公司 | 细胞角蛋白 |
| DF公司 | 判别函数 |
| Frp公司 | 卷曲相关肽 |
| Gli2公司 | 胶质母细胞瘤 |
| 高 | 刺猬 |
| 高频 | 高脂肪 |
| 六氟化氢 | 肝细胞核因子-6 |
| 私人投资公司 | 补丁 |
| PT公司 | 门静脉束 |
工具书类
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