小鼠胰高血糖素受体的肝特异性破坏导致α细胞增生

葡萄糖激发和血浆代谢物的测量。

按照说明进行葡萄糖耐量试验(18,19). 为了测定血浆胰岛素和胰高血糖素，在肝素化管中葡萄糖给药后的0分钟和15分钟内，从尾静脉采集血样（100μL）。使用小鼠胰岛素ELISA试剂盒（Alpco）测量血浆胰岛素，使用小鼠Milliplex试验（Millipore）测量血浆胰高血糖素、GIP、GLP-1和白细胞介素-6水平。使用研发系统的小鼠CXCL12/SDF-1α量化因子ELISA试剂盒测定SDF-1水平。使用Diazyme的总胆汁酸测试试剂盒（酶循环）测量血浆总胆汁酸量。

胰高血糖素和胰岛素耐受性试验。

为了激发胰高血糖素，小鼠禁食5小时，然后腹腔注射胰高血糖激素（16毫克/千克体重）。为了测试胰岛素对血糖的影响（胰岛素耐受性试验），通过腹腔注射给禁食5小时的小鼠0.7单位/kg人胰岛素（Novolin GE；Novo Nordisk）。

高胰岛素-正常血糖钳夹。

如前所述，在导管植入后5-6天，对清醒无束缚的小鼠进行高胰岛素-正常血糖钳夹(21).

组织学。

称量胰腺重量，将其固定在10%中性福尔马林缓冲溶液中48 h，然后按照说明嵌入石蜡或4%多聚甲醛/0.1 mol/L PBS中(20,22). 为了评估α细胞和β细胞的质量，对胰腺切片进行胰岛素和/或胰高血糖素免疫染色，然后使用ScanScope CS系统（Aperio Technologies）在×20倍放大下进行扫描。使用ScanScope软件（Aperio Technologies）分析数字图像。使用奥林巴斯荧光显微镜或ScanScope FL数字幻灯片扫描仪（加利福尼亚州维斯塔阿佩里奥）进行免疫荧光成像。使用Meta Imaging Series 7.1（Metamorph）软件进行细胞计数。使用Spectrum Analysis软件（Aperio）进行α细胞和β细胞质量分析，使用质量分析算法将胰高血糖素或胰岛素染色面积归一化为总淀粉酶染色面积，作为胰腺总面积的近似值。

RNA制备和实时PCR。

使用Trizol试剂（密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich）从肝脏提取RNA。使用TaqMan基因表达测定通用PCR Master Mix（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）和ABI Prism 7900序列检测系统（应用生物系统）进行实时定量PCR反应。mRNA转录物的值标准化为PPia公司组之间没有差异。

胰岛移植实验。

胰岛是从野生型和Gcgr公司^−/−小鼠肾包膜下移植(20,22). 移植前，将分离的手抓胰岛在罗斯韦尔公园纪念研究所培养基（RPMI）5.6 mmol/L葡萄糖和10%FBS中培养过夜。从14周龄野生型或Gcgr公司^−/−将动物移植到14周龄受体的肾包膜下（野生型，Gcgr公司^−/−Gcgr公司^弗洛克斯、和Gcgr公司^Hep−/−老鼠）。1周、4周或8周后，取下含有胰岛移植物的肾脏，并按所述进行处理。如前所述，对薄片（5µm）进行胰高血糖素、胰岛素和Ki67染色(22).

胰腺、分离的胰岛和移植的胰岛移植物中的激素含量。

在0.1 mol/L PBS中解剖整个胰腺并称重。对于分离的胰岛，分离胰岛并手工采集60个大小匹配的胰岛。为了进行移植物测量，从肾实质上解剖胰岛移植物。用组织撕裂器或小型手持式均质器在0.14 N HCL/95%乙醇中均质组织。使用放射免疫分析法测量等分样品中的胰岛素、C肽和胰高血糖素，或使用范德比尔特激素和分析核心的小鼠Milliplex分析法（均来自Millipore）测量GLP-1。

删除Gcgr公司在肝细胞中导致轻度低血糖，并消除对急性胰高血糖素激发的高血糖反应。

Gcgr公司^{Hep公司−/−}与窝友对照组相比，小鼠体重正常(补充图2A类)减少禁食(图1A类)和随机血糖水平(补充图2B类)，类似于Gcgr公司^−/−老鼠(11,16). 对照小鼠对外源性胰高血糖素的反应使血糖水平迅速升高；然而，Gcgr公司^{Hep公司−/−}小鼠在急性胰高血糖素激发后未能表现出血糖反应(补充图2C类)，也报告了Gcgr公司^−/−老鼠(10).

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图1。

肝细胞消融Gcgr公司导致低血糖和改善葡萄糖耐量。A类：12周龄男性的血糖Gcgr公司^{Hep公司−/−}和室友控制装置禁食5小时或16小时(n个=每组10–12只小鼠）。B类：9周龄男性腹腔内（IP）葡萄糖挑战Gcgr公司^Hep−/−和室友控制装置禁食16小时(n个=8–10只小鼠）。血浆胰高血糖素(C类)和胰岛素(天)IP葡萄糖注射前和注射后15分钟测量的水平(n个=每组8-10只小鼠）。E类：注射IP葡萄糖前和注射IP葡萄糖后15分钟的胰岛素-葡萄糖比率。F类：8周龄时口服葡萄糖挑战Gcgr公司^{Hep公司−/−}雄性和室友对照禁食16小时(n个=每组10–12只小鼠）。血浆胰高血糖素(G公司)和胰岛素(H（H）)口服葡萄糖前和口服葡萄糖后15分钟测定的水平(n个=每组10–12只小鼠）。我：口服葡萄糖注射前和注射后15分钟的胰岛素/葡萄糖比值。数据为平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，以及***P（P）<0.001，与野生型小鼠相比。

两者都有Gcgr公司^−/−和Gcgr公司^Hep−/−小鼠表现出葡萄糖耐量改善，空腹胰岛素降低，血浆胰高血糖素水平升高。

腹膜内(图1B类)和口腔(图1F类)葡萄糖耐量在Gcgr公司^{Hep公司−/−}与同窝对照组相比，小鼠的研究结果与Gcgr公司^−/−老鼠(10). 血浆胰高血糖素水平在Gcgr公司^{Hep公司−/−}老鼠(图1C类,G公司)和报告的水平类似Gcgr公司^−/−老鼠(10,11). 此外，在空腹状态下，血浆胰岛素水平降低，但在葡萄糖激发期间无显著差异Gcgr公司^{Hep公司−/−}小鼠与野生型和Gcgr公司^弗洛克斯室友控制(图1天,H（H）)，如中所述Gcgr公司^−/−老鼠(10). 然而，空腹血糖和胰岛素较低，胰岛素与葡萄糖的比值在Gcgr公司^{Hep公司−/−}葡萄糖激发后与对照组小鼠的比较(图1B类,天–F类,H（H）,我). 代谢表型的相似性Gcgr公司^−/−和Gcgr公司^{Hep公司−/−}小鼠的肝脏Gcgr在Gcgr公司^−/−老鼠。

Gcgr公司^Hep−/−小鼠的胰岛素敏感性增加。

胰岛素激发导致了Gcgr公司^{Hep公司−/−}老鼠(图2A类)但总体血糖波动无差异(图2B类)，如前所示Gcgr公司^−/−老鼠(10). 此外，Gcgr公司^−/−与对照组相比，小鼠的胰岛素敏感性增加Gcgr公司^+/+室友控制(图2C类,天). 胰岛素敏感性在Gcgr公司^{Hep公司−/−}老鼠(图2E类,F类). The comparable phenotypes ofGcgr公司^−/−与Gcgr公司^{Hep公司−/−}小鼠表明，胰高血糖素对葡萄糖耐量和胰岛素敏感性的影响在很大程度上是由肝胰高血糖激素受体介导的。

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图2。

烧蚀Gcgr公司在肝细胞中增加胰岛素敏感性。A类：13周龄男性的腹膜内（IP）胰岛素耐受性试验Gcgr公司^{Hep公司−/−}和室友控制装置禁食5小时(n个=8–10只小鼠）。B类：IP胰岛素耐受性测试的曲线下面积（AUC）葡萄糖，如A类.清醒状态下进行高胰岛素-正常血糖钳夹Gcgr公司^−/−(C类,E类)或Gcgr公司^{Hep公司−/−}(E类,F类)雄性和室友对照禁食5小时(n个=5-7只小鼠）。C类和E类：稳定期和稳态期的血糖漂移。天和F类：稳定状态下的葡萄糖输注率，以维持正常血糖。数据为平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）与野生型小鼠相比<0.01。

肝脏GCGR信号的中断导致胰腺重量增加、α细胞增殖和α细胞增生。

Gcgr公司^−/−小鼠的血浆胰高血糖素水平显著升高，整个胰腺和胰岛的重量增加，α细胞增生(图3A类,B类) (10,11). 尽管β细胞总质量在Gcgr公司^−/−和Gcgr公司^{Hep公司−/−}老鼠(补充图3A类,B类)，这种增加继发于胰腺本身的增大，因为20周龄时每克胰腺的β细胞质量相似Gcgr公司^−/−和野生型室友控制(图3C类). 此外，胰高血糖素和GLP-1的含量Gcgr公司^−/−小鼠的胰岛素和C肽含量显著增加，而校正胰腺重量的变化后，其含量不变(补充图2天). α细胞质量增加(图3天)伴随着α细胞增殖的显著增加(图3E类–G公司). 尽管保存了Gcgr公司胰腺中的表达(补充图1C类),Gcgr公司^{Hep公司−/−}小鼠血浆GLP-1和胰高血糖素水平显著升高(补充图4A类和图1C类,G公司)，胰腺重量增加(图4B类)，和β细胞绝对质量(补充图3B类)，但每克胰腺的正常β细胞质量(图4C类)，与Gcgr公司^−/−老鼠(图3和补充图3A类,B类). 虽然GIP是在α细胞中产生的(23)，血浆GIP水平在Gcgr公司^−/−和Gcgr公司^{Hep公司−/−}老鼠(补充图4C类,天). 尽管保留了胰腺Gcgr公司表达式，Gcgr公司^{Hep公司−/−}小鼠α细胞增殖增加，胰岛和α细胞增生(图4A类,D–G型)表明该过程由肝脏GCGR信号的丢失介导。

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图3。

全身消融Gcgr公司增加胰腺重量、α细胞质量和α细胞增殖。A类：组织切片胰岛素染色(左侧面板)或胰高血糖素(右侧面板).B类：20周龄婴儿的胰腺重量Gcgr公司^−/−男性和室友控制体重校正(n个=8–10只小鼠）。胰腺β细胞团(C类)和α细胞质量(天)每克胰腺。数据为平均值±SEM***P（P）<0.001与。Gcgr公司^+/+22周龄婴儿的dapi（蓝色）、胰高血糖素（绿色）和Ki67（红色）的代表性免疫荧光切片Gcgr公司^−/−老鼠(F类)和同窝对照(E类).F′：Ki67阳性细胞核的高倍放大F类.白色箭头表示α-细胞的Ki67阳性细胞核。G公司：α细胞增殖率（胰高血糖素百分比⁺/基辅67⁺每总胰高血糖素的细胞数⁺细胞，n个=每组4个；3个深度/胰腺）。数据为平均值±SEM*P（P）<0.05与。Gcgr公司^+/+.

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图4。

烧蚀Gcgr公司肝细胞导致胰腺重量增加和α细胞增生。A类：有代表性的组织学切片，胰岛素染色(左侧面板)或胰高血糖素(右侧面板).B类：20周龄婴儿的胰腺重量Gcgr公司^{Hep公司−/−}男性和室友控制体重校正(n个=8–10只小鼠）。胰腺β细胞团(C类)和α细胞质量(天)每克胰腺。数据为平均值±SEM***P（P）<0.001 vs.野生型。22周龄婴儿的dapi（蓝色）、胰高血糖素（绿色）和Ki67（红色）的代表性免疫荧光切片Gcgr公司^Hep−/−老鼠(F类)和室友控制(E类).E′和F′：α细胞中含有Ki67阳性细胞核（用白色箭头表示）的切片放大倍率较高。插图是选定的α-细胞Ki67阳性细胞核（白盒）的放大图。白色比例尺代表50μm。G公司：α细胞增殖率（胰高血糖素百分比⁺/基辅67⁺每总胰高血糖素的细胞数⁺细胞，n个=每组4人；3个深度/胰腺）。数据为平均值±SEM***P（P）<0.001与。Gcgr公司^弗洛克斯.

胰岛α细胞增殖增加Gcgr公司^−/−老鼠。

胰岛和α细胞增生的发现Gcgr公司^{Hep公司−/−}小鼠暗示，肝脏中GCGR信号的破坏会引发信号，这些信号可能通过神经通路或循环因子传递给胰腺，从而促进α细胞增殖。为了确定增殖信号是否依赖于胰腺的位置，我们移植了14周龄的胰腺Gcgr公司^+/+14周龄（野生型）胰岛Gcgr公司^+/+和Gcgr公司^−/−小鼠移植8周(图5A类). 我们还移植了Gcgr公司^−/−胰岛进入对侧肾脏Gcgr公司^+/+和Gcgr公司^−/−老鼠。在这种方法中，移植受者体内的内源性胰岛作为对照。14周龄的隔离胰岛Gcgr公司^−/−与对照组相比，移植前小鼠的胰高血糖素和GLP-1含量较高，但胰岛素和C肽含量较低Gcgr公司^+/+小岛(图5B类). 值得注意的是，移植Gcgr公司^+/+肾包膜下的胰岛Gcgr公司^−/−小鼠导致移植物中胰高血糖素和GLP-1含量显著增加(图5C类). 胰岛素也有少量增加Gcgr公司^+/+移植物Gcgr公司^−/−受体小鼠。移植的胰高血糖素阳性细胞的面积Gcgr公司^+/+胰岛也增加了Gcgr公司^−/−收件人(图5E类,F类,我). 此外，Gcgr公司^+/+胰岛移植到Gcgr公司^−/−与对照组相比，小鼠α细胞增殖显著增加Gcgr公司^+/+受体的α细胞增殖率与Gcgr公司^−/−胰腺(图3G公司和6B类,E类). 相比之下，α细胞在移植后增殖极低Gcgr公司^+/+小岛变成Gcgr公司^+/+老鼠(图6A类,E类). 相反Gcgr公司^−/−胰岛移植到Gcgr公司^+/+小鼠的胰高血糖素和GLP-1含量降低(图5天)减少α细胞增殖(图6C类,F类)与相比时Gcgr公司^−/−受体，而α细胞面积没有显著差异(图5G公司,J型).

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图5：。

Gcgr公司^+/+胰岛移植到Gcgr公司^−/−小鼠出现α细胞增生。A类：显示14周龄胰岛的实验示意图Gcgr公司^+/+或Gcgr公司^−/−14周龄左右肾被膜下移植的小鼠Gcgr公司^+/+或Gcgr公司^−/−小鼠。8周后取出含有胰岛移植物的肾脏进行分析。B类：14周龄新鲜分离胰岛的激素含量Gcgr公司^+/+（开放式酒吧）和Gcgr公司^−/−（封闭酒吧）老鼠。数据为平均值±SEM*P（P）< 0.05, ***P（P）<0.001与。Gcgr公司^+/+小岛。C类：的激素含量Gcgr公司^+/+22周龄小鼠移植物Gcgr公司^+/+（开放式酒吧）和Gcgr公司^−/−（浅灰色条）移植后8周的受体小鼠。数据为平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01与。Gcgr公司^+/+收件人。天：的激素含量Gcgr公司^−/−22周龄小鼠移植物Gcgr公司^+/+（封闭钢筋）和Gcgr公司^−/−（深灰色条）受体小鼠移植后8周。数据为平均值±SEM*P（P）< 0.05, ***P（P）<0.001与。Gcgr公司^−/−收件人。代表性胰岛移植切片Gcgr公司^+/+（捐赠人）至Gcgr公司^+/+（收件人；E类)和Gcgr公司^+/+（捐赠人）至Gcgr公司^−/−（收件人；F类)胰岛素（绿色）和胰高血糖素（红色）染色的小鼠。E′和F′：插入E类和F类（白色方框）。代表性胰岛移植切片Gcgr公司^−/−（捐赠人）至Gcgr公司^+/+（收件人；G公司)和Gcgr公司^−/−（捐赠人）至Gcgr公司^−/−（收件人；H（H）)小鼠的胰岛素（绿色）和胰高血糖素（红色）染色。G′和H′：插入G公司和H（H）（白色方框）。白色比例尺代表50μm。胰高血糖素染色阳性的胰岛移植物百分比Gcgr公司^+/+捐赠者(我)和Gcgr公司^−/−供体胰岛(J型)进入Gcgr公司^+/+和Gcgr公司^−/−老鼠(n个=3/只小鼠，3节/胰岛移植）。胰高血糖素面积百分比定义为胰高血糖激素面积/总胰岛素+胰高血糖因子面积的百分比。数据为平均值±SEM***P（P）<0.001与。Gcgr公司^+/+受体移植物。

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图6。

Gcgr公司^+/+胰岛移植到Gcgr公司^−/−受体表现出α细胞增殖增加。来自的胰岛移植物切片Gcgr公司^+/+（捐赠人）至Gcgr公司^+/+（收件人；A类)和Gcgr公司^+/+（捐赠人）至Gcgr公司^−/−（收件人；B类)对小鼠进行Ki67（红色）、胰高血糖素（绿色）和dapi（蓝色）染色。A′和B′：插入A类和B类（白色方框来自A类,B类). 白色箭头表示Ki67阳性α细胞。胰岛移植切片Gcgr公司^−/−（捐赠人）至Gcgr公司^+/+（收件人；C类)和Gcgr公司^−/−（捐赠人）至Gcgr公司^−/−（收件人；天)对小鼠进行Ki67（红色）、胰高血糖素（绿色）和dapi（蓝色）染色。C′和D′：插入C类和天（白色方框来自C类,天). 白色箭头表示Ki67阳性α细胞。白色比例尺代表50μm。14周龄胰岛移植物中α细胞的增殖率Gcgr公司^+/+(E类)或Gcgr公司^−/−(F类)14周龄的小鼠（供体）分别移植到左右肾包膜下Gcgr公司^+/+（收件人）或Gcgr公司^−/−（受体）小鼠。8周后取出含有胰岛移植物的肾脏进行分析(n个=3/小鼠，3个切片/胰岛移植物）。数据为平均值±SEM**P（P）与对照移植物（相同基因型的供体和受体）相比，<0.01。G公司：14周龄胰岛移植物中α细胞的增殖率Gcgr公司^+/+14周龄左右肾被膜下移植的小鼠Gcgr公司^+/+或Gcgr公司^−/−老鼠。1周后取出含有胰岛移植物的肾脏进行分析(n个=4–6/只小鼠，3节/移植物）。数据为平均值±SEM*P（P）<0.05与。Gcgr公司^+/+受体移植物。

为了研究α细胞对增殖刺激的反应速度以及神经支配是否参与了α细胞增殖的增加，将14周龄的野生型胰岛移植物移植到Gcgr公司^−/−小鼠，在发生再神经化或完成血运重建之前的一个时间点(20,24). 我们观察到α细胞增殖在Gcgr公司^+/+胰岛移植物Gcgr公司^−/−受体移植后1周(图6G公司).

因为α细胞增殖和增生都发生在胰腺Gcgr公司^−/−和Gcgr公司^{Hep公司−/−}我们测试了野生型胰岛是否移植到小鼠体内Gcgr公司^{Hep公司−/−}受试者重述了在Gcgr公司^−/−收件人。Gcgr公司^+/+胰岛移植到Gcgr公司^{Hep公司−/−}与移植到Gcgr公司^弗洛克斯老鼠(图7A类–F类). 胰高血糖素面积增加的幅度Gcgr公司^+/+胰岛移植到Gcgr公司^{Hep公司−/−}4周后的受试者比移植后的受试者少Gcgr公司^+/+小岛变成Gcgr公司^−/−小鼠8周后。

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图7。

野生型胰岛移植到Gcgr公司^{Hep公司−/−}受体4周后α细胞面积和增殖增加。代表性胰岛移植切片Gcgr公司^+/+（捐赠人）至Gcgr公司^弗洛克斯（收件人；A类)和Gcgr公司^+/+（捐赠人）至Gcgr公司^{Hep公司−/−}（收件人；B类)小鼠的胰岛素（绿色）和胰高血糖素（红色）染色。A′和B′：插入A类和B类（白色方框）。C类：胰高血糖素染色阳性的胰岛移植物百分比Gcgr公司^+/+供体胰岛进入Gcgr公司^弗洛克斯（收件人，开放酒吧）和Gcgr公司^{Hep公司−/−}（受体，封闭栏）小鼠(n个=4只小鼠，3个切片/胰岛移植）。胰高血糖素面积百分比定义为胰高血糖激素面积/总胰岛素+胰高血糖因子面积的百分比。数据为平均值±SEM*P（P）<0.05与。Gcgr公司^弗洛克斯受体移植物。胰岛移植切片Gcgr公司^+/+（捐赠人）Gcgr公司^弗洛克斯（收件人；天)和Gcgr公司^+/+（捐赠人）至Gcgr公司^{Hep公司−/−}（收件人；E类)对小鼠进行Ki67（红色）、胰高血糖素（绿色）和dapi（蓝色）染色。D′和E′：插入天和E类（白色方框）。白色箭头表示Ki67阳性α细胞。白色比例尺代表25μm。F类：α细胞的增殖率Gcgr公司^+/+胰岛移植物（供体）移植到Gcgr公司^弗洛克斯（收件人，开放式酒吧）或Gcgr公司^{Hep公司−/−}（受体，封闭栏）小鼠(n个=4只小鼠，3个切片/胰岛移植）。数据为平均值±SEM**P（P）<0.01与。Gcgr公司^弗洛克斯受体移植物。

这项工作得到了加拿大卫生研究院向D.J.D.授予MOP93739的支持，加拿大调节肽研究主席和Banting and Best Diabetes Centre–Novo Nordisk Incretin Biology主席向D.J.D、国际青少年糖尿病研究基金会、VA研究服务部提供的支持，国家卫生研究院（DK-66636，DK-69603）、β细胞生物学联合会（DK72473，DK89572）、范德比尔特小鼠代谢表型中心（DK59637）、，范德比尔特糖尿病研究和培训中心（DK20593，胰岛采购和分析核心，激素检测和分析服务核心，细胞成像共享资源）。

没有报告与本文相关的潜在利益冲突。

C.L.、A.M.R.、E.D.D.、C.D.、S.A.、V.D.C.和I.M.设计并进行了实验，并编写和审查了手稿。P.M.V.、M.J.C.、A.C.P.和D.J.D.设计了实验，审查了结果，并撰写了手稿。A.C.P.和D.J.D.是这项工作的担保人，因此，他们可以完全访问研究中的所有数据，并对数据的完整性和数据分析的准确性负责。

作者特别感谢Courtney Thompson和Greg Poffenberger（范德比尔特大学）提供的技术援助。