摘要
我们对白细胞捕获过程中白细胞与血管壁相互作用的理解受到了对内皮表面层机械特性不完全理解的限制。众所周知，白细胞上的粘附分子相对于表面形貌分布不均匀三地形限制了与其他表面的粘合9生理接触力（≈5.0−10.0 pN/微绒毛）可以将微绒毛压缩至其静止长度的三分之一，增加分子对相反表面的可接近性3, 7。我们认为内皮是一个双层结构，相对刚性的细胞体，加上糖盏，管腔表面的一层柔软的保护性糖衣6研究表明，糖萼可以起到屏障的作用，减少白细胞与内皮表面的粘附4在本报告中，我们开始讨论内皮表面的可变形性，以了解内皮机械刚度如何影响粘结形成。在静态培养中生长的内皮细胞不表达健壮的糖萼，但在生理流动条件下生长的细胞开始接近观察到的糖萼体内
2使用原子力显微镜（AFM）测量内皮细胞体的模量约为5至20 kPa5用电子显微镜研究了糖萼的厚度和结构8，并且已经使用间接方法近似了糖萼的模量，但据我们所知，尚未发表直接测量活细胞中糖萼模量的报告。在本研究中，我们使用新型AFM探针对培养条件下的细胞进行压痕实验，以最大化其糖萼表达，从而直接测量内皮糖萼的模量和厚度。
关键词：生物医学工程，第72期，生物工程，细胞生物学，生物物理学，分子生物学，内皮，血管，膜糖蛋白，受体，白细胞粘附，生物工程（一般），糖萼，机械性能，原子力显微镜，ATM，内皮细胞，白细胞，细胞壁，细胞培养，显微镜，成像
协议
1.方法
1.1细胞流动室
流动室，如所示图1，因此细胞可以在1.0 Pa（10 dyn/cm）的剪切力下生长2)然后直接转到庇护MFP3D AFM（加州圣巴巴拉）。
首先在食人鱼溶液（3:1 H）中清洁玻璃载玻片，为实验准备流动室2SO公司4：H2O（运行）2)15分钟，然后用蒸馏水清洗。然后将其烘干，并在真空沉积室中涂上氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）。
使用Silhouette SD切割工具切割硅胶垫圈。这使我们能够精细地控制流动室的尺寸，以控制细胞生长过程中的流速和剪切应力。通常，从0.4 mm的硅胶板上切下6.4 mm宽、19 mm长的通道。产生1.0 Pa（10 dyn/cm）剪切应力所需的流速2)假设矩形通道中的层流，使用以下方程式进行计算：
哪里问是流速，τ是剪切应力，μ是介质的粘度，此处假设为1.0 mPa（0.01 dyn*sec/cm2),小时是高度和w个是流动室的宽度。
流动室的顶部与细胞培养皿中的垫圈对齐，并用磁环固定。用异丙醇（IPA）填充组件进行消毒。
组装了全流量系统。细胞培养皿中的流动口连接到三通阀。连接阀门以打开30毫升注射器。IPA通过系统冲洗，然后用含4%胎牛血清（FCS）的30 ml McCoy培养基冲洗。然后将20 ml Vec Technologies细胞生长培养基注入系统。注射器顶部盖上了盖子。捕获储液器注射器盖上有一个针头，用于将介质移回进料储液器。将0.2μm无菌过滤器安装在盖子的进气口上，以防止系统受到污染。然后，流动室准备好进行细胞播种。
1.2细胞培养
从Vec Technologies（Rensselaer，NY）购买人脐静脉内皮细胞（HUVEC’s）和生长培养基，并在T25烧瓶中培养汇合。
从烧瓶中取出生长培养基，用2 ml 2.5%胰蛋白酶释放单层细胞。一旦细胞处于溶液中，向烧瓶中添加10 ml细胞培养基，使胰蛋白酶化停止。
将细胞悬液离心5 min，并去除上清液。将细胞重新悬浮在1ml细胞培养基（含血清）中，然后注入流动室。
将细胞悬液（0.5 ml，~50000个细胞）装入注射器，并通过三通阀注入流动室。
在开始流动之前，让细胞沉降并粘附在玻璃基板上2小时。细胞在37°C的培养箱中流动培养1至5天，直至融合。
1.3悬臂制备和单元压痕
在硝酸中清洁Tiples AFM悬臂（瑞士NanoWorld）5分钟，并在蒸汽沉积室中用氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）进行功能化。
制备5 mg/ml（按重量计）NHS-磺基-LC-生物素在汉克缓冲盐溶液（HBSS）中的溶液。将悬臂浸没在溶液中15分钟，使硅烷与N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）化学偶联。
通过将20 ml Vec Technologies细胞培养基（包括血清）与200μl链球菌抗生物素珠培养12小时，制成无生物素培养基溶液。用磁铁将珠从培养基中取出，并通过0.22μm无菌过滤器过滤培养基。
从细胞培养皿中取出流动室，并在37°C无生物素培养基中清洗细胞。
制备1μl 2.4μm涂有链霉亲和素的珠状物在1 ml无生物素培养基中的储备溶液，并将100μl储备液添加到细胞培养皿中。
链霉亲和素珠子是通过将尖端放在珠子旁边的玻璃表面上，缩回，将悬臂顶点置于珠子上，然后将悬臂向下压在珠子上并休息几秒钟，用悬臂捡起的。
悬臂的灵敏度是通过在裸露玻璃的区域上压痕并使用曲线的斜率将尖端偏转设置为电压的函数来测量的。
然后，通过MFP3D软件中的热校准计算悬臂的弹簧常数。
然后使用校准的悬臂压痕样品，如图2这些2.4μm的珠提供了与细胞表面更大的接触面积，因此可以检测到软糖萼层的机械性能。将悬臂放置在靠近细胞核的细胞上，用尖端软接触细胞，将悬臂高度设置在细胞表面上方约3μm处。软件以1μm/sec的速度进行20次重复压痕，最大力为7 nN。连续接触之间大约需要6秒。可以使用不同的压痕速率来测试糖萼的时间依赖性特性，尽管在这些初始实验中，只使用了单个压痕速率（1μm/sec）。
2.压痕理论
可以使用赫兹理论描述半径为R的球体在弹性半空间中的压痕，其中压痕力，F类，由方程式得出：
其中δ是压痕深度E类*是被测材料的折减模量(图3). 如果无限刚性压头撞击均匀弹性半空间，E类*由方程式得出：
哪里E类是弹性模量ν是材料的泊松比。最近对聚合物薄膜的研究启发了确定薄膜模量和厚度的双层模型的发展1我们将此模型应用于细胞生物学，方法是将糖萼视为细胞体表面上均匀的软薄膜。使用该模型，系统的简化模量变为：
在哪里？E类GC公司是糖萼的模量，E类细胞是胞体的模量，P（P）,问和n个是根据聚合物拟合经验确定的常数，以及z（z）由方程式得出：
在哪里？吨是糖萼层的厚度。这些参数的示意图如所示图3已经证明，该模型是一种精确的方法，可以确定刚性衬底上薄膜的模量和厚度1此方程可用于拟合从细胞压痕获得的曲线，以确定内皮细胞糖萼的模量和厚度，如图4.
具有代表性的结果
在一个典型的实验中，从细胞的给定区域获得了20条力与距离的曲线，通常在核周区域，靠近但不在细胞核上（约2μm以内）。校准曲线以说明测量期间的任何样品漂移，然后取平均值以消除悬臂噪声，如所示图4对曲线进行了分析，并与用于确定聚合物薄膜模量和厚度的双层模型进行了拟合1根据25个细胞的曲线拟合，我们确定管腔层的模量为0.7±0.5 kPa，厚度为380±50 nm，如所示图5.胞体模量为16±6 kPa。这些值与以前测量的细胞体模量和糖萼厚度一致5, 8.
图1。我们的细胞培养设备。通过腔室的流动是由重力从贮存器A驱动至C的。细胞被镀在封闭腔室B中，该腔室用磁铁固定在封闭腔体的表面，用于庇护AFM（加利福尼亚州圣巴巴拉市庇护区）。B上的三通阀使我们能够停止流动。硅胶垫圈形成了6.4 mm宽、19 mm长、0.4 mm高的流道。密闭室B很容易拆除，密闭室培养皿直接移入AFM进行实验。通过使用蠕动泵（未显示）将流体从储液罐C泵送至A来维持高度差D。整个组件放置在培养箱中进行细胞培养。
图2。左图：悬臂上有一个2.4μm的珠子（箭头），由生物素-链霉亲和素连接。右图：流下生长的HUVEC单层。
图3。半径珠相互作用的几何形状R（右）缩进距离δ进入牢房。以绿色显示的糖萼的模量为E类GC公司和厚度吨.胞体具有模量E类细胞.珠子对电池施加的力，F类，并获得图4所示的力与距离曲线。
图4。单元格中压痕的平均力与距离曲线以红色绘制。插图中显示了单个压痕。图像中突出显示的是接触点，悬臂首先接触管腔表面，管腔层，其中曲线的斜率由糖萼的刚度决定，以及细胞体，其中斜率主要是细胞体模量的函数。两层压痕理论的拟合曲线以蓝色显示，而弹性半空间的更简单赫兹模型的拟合则以黑色虚线表示。两层拟合中有四个自由参数。为该特定拟合确定的值为：细胞模量=15.9 kPa，管腔层模量=0.33 kPa，管腔内层厚度=420 nm。第四个拟合参数是与糖盏的接触点。x轴原点相对于细胞表面的位置是任意的。单击此处查看大图.
图5。曲线拟合的25个细胞的属性直方图。左侧：E类GC公司测定为0.7±0.5 kPa。右：糖萼的厚度被测定为380±50 nm。
讨论
我们使用两层模型和赫兹理论计算的值来模拟血液中循环的白细胞与内皮细胞壁的相互作用。我们已经计算出，在10pN负载下，直径为50nm的白细胞上的微绒毛将缩进大约150nm到糖盏中，仅为总厚度的一小部分。这表明，具有本实验中测量的特性的糖萼是细胞间相互作用的一个重要屏障，并且可能是白细胞粘附级联过程中细胞必须克服的一个大空间位阻。
在这里使用的模型中，我们将糖萼近似为各向同性弹性结构。虽然我们不知道有任何机械测量表明情况并非如此，但已知的糖萼分子结构表明，这可能过于简单。事实上，糖萼是细胞表面复杂多样的结构。它由定向分子结构组成，缺乏明确的外边界，并且可能在靠近细胞表面的地方变得更加密集。因此，虽然此处使用的双层弹性模型可以深入了解循环细胞观察到的糖萼的相对刚度，但未来的研究可以探索替代的力学描述，以解释其可能的各向异性和厚度方向上的密度变化。也有可能糖盏在细胞表面的不同区域不均匀。从目前的数据集来看，这一点并不明显，因为这里提供的所有数据都是在细胞核周围细胞的中央区域采集的。
糖萼也可能表现出本研究未研究的粘弹性。已经观察到，在静态条件下，毛细血管中的红细胞可以完全压缩糖萼，而循环红细胞则不能10。静态红细胞产生的力可能非常小（~3-10 Pa）。这表明糖萼在缓慢压缩时可能非常柔软，但在快速压缩时会显著变硬。我们以1μm/sec的压痕速度进行了测量，以模拟循环电池可能遇到的刚度，但进一步研究时间相关特性的工作正在进行中。
AFM压痕法已被用于直接测量活细胞中内皮细胞糖萼的模量和厚度。测量结果表明，糖萼可能是细胞间接触和粘附的重要屏障，并可能是炎症期间调节粘附级联的关键因素。
致谢
作者感谢Elena Lomakina、Richard Bauserman、Margaret Youngman、Shay Vaknin、Jessica Snyder、Chris Striemer、Nakul Nataraj、Hung Li Chung、Tejas Khire和Eric Lam对本项目的协助。该项目由NIH#PO1 HL 018208资助。
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