脊髓和延髓肌萎缩诱导的多能干细胞源神经元雄激素受体聚集增强^*

摘要

介绍

脊髓和延髓肌萎缩（SBMA），²也称为Kennedy-Alter-Sung综合征(1)是一种X连锁隐性运动神经元病，其特征是进行性延髓和近端肢体无力和萎缩，以及轻度雄激素不敏感的迹象，如男性乳房发育症、睾丸萎缩和生育能力下降。这种疾病是第一种由三核苷酸（CAG）重复扩增引起的神经退行性疾病。SBMA的特征是雄激素受体（AR）基因外显子1中的聚谷氨酰胺（polyQ）扩增(2).

多晶谷氨酰胺区域通常在9到37个谷氨酰胺残基之间，平均约22个残基。SBMA患者的AR通常包括38种以上的相邻谷氨酰胺(三——6). 重复扩增具有遗传不稳定性，这意味着它们的长度在父系传播期间经常发生变化。SBMA等PolyQ障碍具有预期和体细胞嵌合体等临床特征。CAG重复序列长度与疾病发病之间存在相关性，尽管在polyQ疾病中致病基因普遍表达，但仍存在选择性神经元参与(7,8).

SBMA的定义病理学是受影响神经元群中的核内AR内含物。突变AR的错误折叠和改变降解也可能参与SBMA的发病机制。在polyQ疾病中，SBMA的独特之处在于突变AR具有一种特殊的配体睾酮。结果来自果蝇属小鼠AR过表达模型清楚地表明，突变AR在配体结合反应中向细胞核移位是发病的关键(9——12). 然而，没有直接的生化证据表明，SBMA患者的活的人类神经元中，突变AR对配体结合的反应发生移位，因此，polyQ扩增是如何导致神经退行性变的尚不清楚。

最近，人类诱导多能干细胞（iPSCs）已成为研究许多疾病（包括神经退行性变）发病机制的有用工具(13——15). 以前关于神经退行性疾病分子发病机制的信息来自于利用死后脑组织或转基因动物进行的研究，因为进入活体人类中枢神经系统具有侵入性。iPSC技术的出现使分析活体疾病特异性人类神经元成为可能在体外越来越多的研究使用了来自神经疾病患者的iPSCs(15)许多人关注其在排斥耐受个性化细胞替代治疗中的应用潜力。近年来，患者衍生iPSCs被用于重述一些神经疾病的表型，从而拓宽了我们对许多神经疾病发病机制的理解，包括晚发性疾病的发病机制(16——27). 据报道，亨廷顿病和脊髓小脑共济失调3型（SCA3）患者产生了polyQ疾病特异性iPSCs(17,27——29). 使用SCA3特异性iPSC衍生的神经元，Koch等。(27)最近发现，谷氨酸诱导的兴奋（但不是患者的成纤维细胞、iPSCs或分化的胶质细胞）对蛋白质水解和ataxin 3异常的不溶性聚集至关重要，从而解释了神经元特异性变性的原因。

尽管SBMA是描述的第一种polyQ疾病，但尚未使用iPSC技术对其进行建模。在这里，我们报道了从SBMA患者尸检中获得的成纤维细胞生成iPSCs及其向运动神经元的分化。我们还发现CAG重复序列在重编程、长期传代和分化过程中是稳定的。此外，我们检测了AR的表达及其在SBMA-iPSCs分化的神经元细胞中的聚集状态。我们的研究结果表明，患者来源的神经元代表了一种用于研究polyQ疾病的新模型，它们可以为候选药物的识别和验证提供重要线索。

实验程序

结果

从SBMA患者生成iPSC

利用含有五种因子OCT4、SOX2、KLF4、LIN28和NANOG的逆转录病毒转导，我们从一名80岁男性SBMA患者的原代人成纤维细胞中建立了两个iPSC克隆（KAS01#2和#3）。患者的第一个症状是58岁时的上肢束状，当时通过基因分析发现AR基因重复扩增，他被诊断为SBMA。肢体无力和吞咽困难进展缓慢，捐赠者死于呼吸肌麻痹导致的呼吸衰竭。在获得捐赠者家属的知情同意后，使用庆应义塾大学批准的方案在死后获得皮肤成纤维细胞。两个先前描述的iPSC系（PD01#24和#26）来自男性散发性PD患者，作为神经系统对照(25). KAS01#2和#3 iPSC克隆均显示出多能干细胞的典型特征：与胚胎干细胞形态相似，多能干标记的表达，包括Tra-1–60、Tra-1–81、SSEA3和SSEA4(图1,A–J)逆转录病毒转基因的沉默，以及表明多能性的内源性基因的重新激活(图1K（K）). 克隆KAS01#2和#3的分化能力得到确认在体外荧光免疫染色法测定通过类胚体形成产生三个胚层(图1,L–Q（L–Q）)和体内通过HE染色确定的畸胎瘤形成(图1,右-西)和荧光免疫染色（数据未显示）。

在单独的窗口中打开

图1。

KAS01#2和#3 iPSCs的产生及其多能性的测定。 A–J，KAS01#2和#3 iPSC株均表现出多能性标记(A–E，KAS01#2；F–J型，KAS01#3）。所有iPSC均表达多能性标记Tra-1–60、Tra-1–81、SSEA3和SSEA4。SSEA1被用作未分化干细胞的阴性表面标记。细胞核用DAPI染色。比例尺，200微米。K（K）转基因OCT3/4、SOX2、KLF4和内源性人类胚胎干细胞标记基因的RT-PCR分析。逆转录病毒转导6天后，患者成纤维细胞的转基因呈阳性。人纤维蛋白原，健康对照成纤维细胞；RT（−），健康对照样品，无RT-PCR。L–Q（L–Q），来源于KAS01#2和KAS01#1 iPSC的类胚体表达胚层特异性标记，包括α-胎蛋白(法新社，内胚层），α-平滑肌肌动蛋白（α座椅模块组件，中胚层）和βIII-管蛋白（β三、浴缸（外胚层）。左旋-右旋，KAS01#2，O–Q公司：KAS01#3。比例尺，100μm。右-西来自SCID小鼠的畸胎瘤，注射KAS01#2和KAS01#1 iPSCs。显示了畸胎瘤切片的苏木精和伊红染色的代表性图像(R–T型，KAS01#2；U–W型，KAS01#3）。代表所有三个胚胎胚层的组织，包括腺体结构（内胚层）、软骨（中胚层）和色素上皮（外胚层），在两个iPSC系的细胞中都可见。比例尺，50微米。

SBMA-iPSCs向神经元的分化

SBMA患者特异性iPSCs的神经分化使在体外疾病发病机制的建模。为了确定来自SBMA-iPSC的神经元是否表现出SBMA表型，将KAS01#2和#3 iPSC系以及对照PD-iPSC系诱导分化为神经细胞(32,33)并在N2培养基的Matrigel-coated培养皿中培养2周。我们证实了神经元标记物βIII-管蛋白和MAP2的表达(图2). 大约80%从SBMA-iPSCs分化出来的神经细胞βIII-管蛋白阳性（201B7，81.0±5.8%；KAS01#2，78.1±5.8%，KAS01#3，79.6±5.0%(n个=3）），我们没有发现与我们在先前报告中描述的人类iPSCs在SBMA-iPSCs神经元生成方面的明显差异(25,35).

在单独的窗口中打开

图2。

SBMA-iPSCs的运动神经元分化和分化神经元中AR的表达。 A类和B类运动神经元祖细胞标志物胰岛-1的表达(A类,绿色)和GFP在HB9型成熟神经元标记的启动子(绿色)βIII-管蛋白阳性（βIII-分接头,红色)单元格(B类).比例尺，100μm。C类和D类，用抗MAP2和抗AR抗体对分化的神经元进行双重染色。AR主要定位于细胞核。比例尺在里面C类，200微米。比例尺在里面D类，20微米。

将来自SBMA-iPSCs的神经细胞在运动神经元培养基中培养2周，然后通过检测运动神经元祖细胞标记物胰岛-1的表达和特异性报告细胞活性来评估其分化为运动神经元的能力同源盒Hb9（也称为锰x1或血红蛋白9)编码成熟运动神经元特异表达的转录因子的基因(36). 如所示图2(A类和B类)胰岛1蛋白和血红蛋白9报告基因在来自SBMA-iPSCs的分化神经元中表达。

SBMA衍生iPSC中CAG重复数的稳定性

据报道，Friedreich共济失调衍生iPSCs中GAA·TTC重复数和强直性肌营养不良衍生人类胚胎干细胞中CTG重复数在培养过程中随着时间的推移而不稳定(26,28). 为了确定SBMA衍生iPSCs中CAG重复数的稳定性，我们测量了成纤维细胞、长期传代iPSCs、分化神经元和畸胎瘤中AR基因在重编程和分化阶段的重复长度(图3). GeneScan片段分析和直接测序结果显示，患者来源的成纤维细胞中重复数为47和49，这表明存在体细胞嵌合体。KAS01#2和#3 iPSCs只有47个重复，这些细胞系的长期传代并不影响重复数。此外，分化的神经元和畸胎瘤具有相同数量的CAG重复序列。通过检测来源于DRPLA患者的成纤维细胞和iPSCs中阿托品-1基因的重复数，也评估了另一个polyQ疾病特异性iPSCs系中CAG重复数的稳定性，其特征是在父系传播过程中重复数显著增加，导致显著的预期(图4). DRPLA-ipCS的阿托品-1基因中的CAG重复数12和68也相当稳定，长期培养后保持不变。这些发现表明，在iPSCs的重编程、维持和分化过程中，polyQ疾病的致病基因中的CAG重复数是稳定的。

在单独的窗口中打开

图3。

AR基因中的CAG重复数在重编程和分化过程中是稳定的。GeneScan分析表明，成纤维细胞在AR基因中有47和49个CAG重复序列。KAS01#2和#3 iPSCs即使在长期传代后也只有47个重复。分化（分化神经元和畸胎瘤）不影响CAG重复次数。DRP01#7包含AR基因中正常的20个CAG重复序列，用作对照iPSC系。P（P）表示通道编号。

在单独的窗口中打开

图4。

在重编程过程中，萎缩蛋白-1基因中CAG重复序列的数量是稳定的。GeneScan分析显示，DRP-01成纤维细胞和DRP-01#6和DRP-01#7 iPSC具有相同数量的CAG重复序列：12个（正常等位基因）和68个（突变等位基因）。

神经分化和二氢甾酮上调AR表达

AR激动剂睾酮和睾酮衍生物二氢睾酮（DHT）导致AR的核移位，并调节神经元组织中AR的稳定(10,37——41). 一些证据表明，突变体AR被其激动剂激活是SBMA发病机制中的关键步骤。为了从生化角度表征SBMA-iPSCs中AR表达的动力学，我们研究了成纤维细胞、iPSCs和分化神经元中AR的表达。尽管通过Western blotting可以在成纤维细胞中检测到AR的表达，但在SBMA-iPSCs或控制散发PD-iPSCsPD01#24和PD01#26中无法检测到AR(图5A类). 然而，AR的表达在iPSC衍生的神经元中再次出现，表明AR的表达在多能状态下受到抑制。尽管AR表达水平存在一些克隆变异，但在培养基中添加DHT导致来自所有受检iPSCs的分化神经元中AR表达急剧上调。在添加DHT后总AR水平的相对增加倍数方面，疾病特异性iPSCs之间没有显著差异（数据未显示）。

在单独的窗口中打开

图5。

DHT增强SBMA-iPSC衍生神经元AR的聚集。 A类分析KAS01成纤维细胞、iPSC和分化神经元中AR的表达。分化的神经元在有/没有50n的条件下培养米DHT公司(DHT（+）或(−))持续7天。来自特发性PD患者（PD01#24或#26）的iPSC系被用作对照。神经元分化和DHT治疗上调了所有iPSCs中AR的表达。B类和C类，过滤延迟分析结果。醋酸纤维素膜捕获不溶性聚集AR，而硝化纤维素膜捕获总AR。聚集AR（上膜）的水平通过密度测定法测定，并归一化为总AR（下膜）的级别。直方图显示了DHT处理的神经元中聚集AR水平与未处理神经元中聚集ER水平的比率（平均值±S.D.）。注意，接受DHT治疗的KAS01#2和#3神经元中聚集AR的水平显著高于PD01#24和PD01#26神经元中聚集的AR的水平。使用学生的t吨测试*，与KAS01#2；第页< 0.05. †,与KAS01#3，第页< 0.05.

使用完善的过滤延迟分析程序检测突变AR的聚集。聚集AR的水平（保留在醋酸纤维素膜上）通过密度测定法测定，并通过总AR的水平归一化（保留在硝化纤维素膜上的AR）。图5(B类和C类)结果表明，经DHT处理的神经元与未经处理的神经元中聚集AR的比率在SBMA-iPSCs衍生的神经元中显著高于对照PD iPSC-derived神经元，这表明雄激素激动剂增强了SBMA-iPS中polyQ扩增突变AR的异常聚集。

SBMA患者的病理变性在神经系统中占主导地位。因此，我们询问AR的聚集是否仅限于神经元，或是否也发生在其他类型的细胞中，如iPSCs和成纤维细胞。用DHT处理KAS01和PD01 iPSCs和健康对照成纤维细胞，然后进行Western blotting和滤过延迟分析(图6). DHT上调了所有成纤维细胞中AR的总表达，但在iPSCs中未检测到。值得注意的是，SBMA成纤维细胞聚集AR的水平比SBMA-iPSC神经元低很多(图6,B类和C类). 来自健康对照iPSCs的神经元在DHT治疗后表现出轻微但不显著的AR聚集。这些数据表明，异常AR聚集在来源于SBMA iPSC的神经元中是显著的。

在单独的窗口中打开

图6。

DHT不会增强SBMA成纤维细胞和iPSC中的AR聚集。 A类分析KAS01、PD01、健康对照成纤维细胞和iPSC中AR的表达。分化神经元在有/无50 n培养基中培养米DHT公司(DHT（+）或(−))持续7天。以来自特发性PD患者的iPSC系（PD01#17或#24）和来自健康志愿者的iPSC株作为对照。DHT治疗后，所有成纤维细胞中AR总表达上调，但并非所有iPSCs中都上调。B类和C类，过滤延迟分析结果。醋酸纤维素膜捕获不溶性聚集AR，而硝化纤维素膜捕获总AR。使用密度计测定聚集AR（上层膜）的水平，并将其标准化为总AR（下层膜）的水平。直方图显示了DHT处理的神经元中聚集AR水平与未处理神经元中聚集ER水平的比率（平均值±S.D.）。未观察到任何成纤维细胞通过添加DHT显著上调聚集AR。hc。，健康对照。*，与健康对照成纤维细胞(hc。小谎。),第页< 0.05.

接下来，为了研究SBMA的关键病理事件，我们试图确定SBMA-iPSC衍生的分化神经元是否在细胞核中显示AR包涵体。如所示图2(C类和D类)，即使没有AR激动剂，AR也主要定位于细胞核，但在所述培养条件下，在SBMA-iPSC衍生的分化神经元中未检测到异常AR积聚。

17-AAG下调AR水平并抑制DHT的作用

为了评估在药理药物筛选研究中使用SBMA-iPSCs的潜力，我们使用HSP90抑制剂17-AAG评估了SBMA-iPS衍生神经元中突变AR的表达水平，该抑制剂可增强聚谷氨酰胺扩增突变AR的降解(42,43). 165n治疗KAS01#2神经元米17-AAG持续24小时会导致HSP70表达的预期增加，已知17-AEG上调了HSP70的表达(图7A类)而总突变体AR和聚集突变体AR的水平均显著下降。KAS01#3神经元和健康对照神经元也有类似结果(图7,B类和C类). 虽然DHT治疗增强AR表达，但17-AAG治疗导致AR总表达下调，聚集AR显著降低(图7,B类和C类). 这些结果表明，SBMA iPSC-derived神经元对候选药物治疗的反应符合预期(43).

在单独的窗口中打开

图7。

17-AAG对SBMA-iPSCs突变AR的影响。 A类，KAS01#2神经元在有/无50 n时培养米DHT和/或165 n米17-AAG。注意，无论是否存在DHT，17-AAG治疗都会导致AR表达降低。B类和C类，过滤延迟测定结果表明，即使在DHT存在的情况下，17-AAG也能有效降低聚集AR的水平。中的直方图C类显示了DHT和/或17-AAG处理神经元和未处理神经元中通过密度分析测定的聚集AR水平（平均值±S.D.）。使用学生的t吨测试*，与无，第页<0.05。†，与DHT公司，第页< 0.05.

我们还用17-AAG治疗KAS01、PD01和健康对照成纤维细胞。与神经元的情况一样，17-AAG下调了每个成纤维细胞中AR的总表达；然而，聚集的AR表达太低，无法评估17-AAG的效果（数据未显示）。

讨论

据我们所知，本研究是首次使用iPSC技术演示SBMA模型。我们发现，在SBMA-IPSCs的突变AR基因和DRPLA-IPCs的DRPLA基因的重编程、长期传代和分化过程中，CAG重复数是稳定的(图3和​和4）。4). 最近的一项研究表明，在Friedreich共济失调中观察到的GAA·TTC重复序列和强直性肌营养不良的CTG重复序列特征在人类iPSC或人类胚胎干细胞的传代过程中是不稳定的(26,28). 两种重复扩增在非编码区都非常大（～100～～1000 bp），并且已经描述了扩增等位基因母体传递的不稳定性(44,45). 错配修复酶MSH2在重编程过程中上调，与GAA·TTC重复不稳定性有关。相反，在polyQ疾病中，CAG三核苷酸编码区的扩增重复序列（小于100 bp）在父系传播期间大小增加，即使在长期传代中也相当稳定。亨廷顿病和SCA3-iPSCs中也描述了CAG重复序列的类似稳定性(27——29)这表明不同的过程有助于非编码区的大三核苷酸重复序列和CAG编码重复序列之间重复序列的扩增和/或收缩。

本研究还表明，神经元分化和AR激动剂治疗可诱导多能干细胞AR表达的动态变化。如所示图5A类和​和66A类，AR在成纤维细胞被重新编程为iPSCs后无法检测到，但在这些细胞分化为神经元细胞后可以检测到。我们还发现，DHT治疗导致分化神经元AR蛋白水平显著增加，这与在体外和体内研究表明，激动剂通过稳定AR蛋白来增加其水平(46——48). 众所周知，雄激素激活AR是SBMA发病机制中的关键事件(10,39). 热休克蛋白复合物的释放使具有扩展polyQ区域的AR分子转移到细胞核，并与其他具有扩展poly Q区域的突变AR分子发生物理相互作用，产生异常构象变化，导致聚集(49,50). 我们的结果表明，与PD01神经元和健康对照神经元相比，SBMA神经元对DHT的反应产生的聚集突变AR蛋白的数量增加了倍(图5和​和6），6)表明经DHT处理的SBMA衍生神经元AR聚集增强，重现了SBMA的生化特征(10——12).

本研究的另一个重要发现是AR聚集增强是该病的突出神经元表型。尽管DHT处理后KAS01成纤维细胞和SBMA-iPSCs衍生的神经元细胞系#2和#3中AR的总表达均显著上调，但与成纤维细胞相比，由DHT介导的SBMA-iPSCs衍生神经元AR聚集显著升高，表明神经元特异性因子导致AR聚集。在Machado-Joseph病的一项研究中也报道了类似的观察结果，其中ATXN3的SDS不溶性聚集体仅限于患者特异性iPSC-衍生神经元(27). 这种神经元特异性表型依赖于兴奋介导的钙激活的钙蛋白酶蛋白水解²⁺大量涌入。我们的研究结果表明，激动剂激活突变体AR是导致异常聚集的关键步骤，但AR在成纤维细胞中的聚集性很低，其中总AR被DHT强烈上调(图6). 因此，除了AR总表达外，确定神经元特异性还必须涉及其他未知聚集因子。

最后，为了评估iPSC技术用于药物筛选的潜力，我们检查了治疗SBMA的候选药物HSP90抑制剂17-AAG的药理反应。药物17-AAG-特异性结合HSP90的ATP结合位点，将HSP90复合物转变为蛋白酶体靶向形式，从而导致HSP90客户端的协同降级，例如AR(53). 正如预期的那样，在SBMA-iPSCs培养物中加入17-AAG后，聚集AR水平急剧下降(图7)，证实了这些细胞用于筛选新药化合物的有用性。由于SBMA是第一个确定的polyQ疾病，并且AR的生化特性已经得到了很好的表征，因此我们提出，来自SBMA-iPSCs的活的人类神经元非常适合用于旨在阐明polyQ膨胀蛋白毒性的实验，以及用于开发新疗法。

使用SBMA-iPSCs进行大规模药物筛选研究的设计应考虑到本研究的几个局限性。首先，从人多能干细胞获得高分化运动神经元需要多步骤程序、延长培养时间和细胞分选技术。分化神经元细胞的高度异质性以及分化效率对克隆变异性和传代数的依赖性也是目前可用的分化方法的特点(33,54,55). 尽管最近报道的分化策略允许使用基因传递转录因子从人类多能干细胞中快速生成诱导运动神经元（基因传递后11天，效率>60-70%）(56)，有必要开发可靠的方案，以在最小克隆变异的情况下实现更有效的神经元分化，以及新的细胞分选技术。

本研究的第二个局限性是，我们无法通过免疫细胞化学证明SBMA的关键病理表型之一，即核内含物。然而，这一结果并不意外，因为最近一项使用SCA3-iPSCs的研究也未能检测到患者源性神经元中包涵体的形成，尽管ATXN3在我-谷氨酸兴奋，表明年龄依赖性过程在重述病理特征中起着关键作用(27). 最近，Sánchez-DanéS等。(57)研究表明，在延长培养期（75天）后，与星形胶质细胞共培养的神经元可以重演疾病特定的形态学表型，例如神经突起形成减少和基于iPSC的散发性PD模型多巴胺神经元中自噬空泡的积聚。由于我们获得成纤维细胞以生成SBMA-iPSCs的供体患有迟发性和缓慢进展的疾病，因此必须在未来的研究中确定培养iPSC-derived神经元以显示SBMA的病理表型的合适时间。

尽管这项研究仅限于具有亚克隆的单个患者系，但我们清楚地概括了疾病特异性的生化特征，并证明了使用我们的SBMA iPSC系鉴定和验证候选药物的潜力。尽管亮丙瑞林等药物最近已成为治疗SBMA的有希望的候选药物，但不幸的是，由于SBMA是一种进展缓慢的疾病，很难验证其临床疗效(58). 尽管在iPSC用于临床治疗神经退行性变之前，还需要在iPSC方法方面取得更多进展，但我们希望我们的研究结果将有助于鉴定和验证治疗多发性Q病的新型候选药物，包括SBMA。

致谢

参考文献