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大脑行为免疫。作者手稿；可在2013年3月20日的PMC中获得。
以最终编辑形式发布为：
大脑行为免疫。2011年1月；25（1）:147–150。
2010年9月18日在线发布。 数字对象标识：2016年10月10日/j.bbi.2010.09.010
预防性维修识别码：PMC3603145型
NIHMSID公司：NIHMS448851
PMID：20854893

疲劳和人类白细胞中的基因表达：持续疲劳的乳腺癌幸存者中NF-κB增加和糖皮质激素信号减少

Julienne E.Bower女士,a、，b、，c、，d中，* 帕特里夏·A·甘兹,d中，e（电子） 迈克尔·R·欧文,b、，c（c） Jesusa M.G.Arevalo先生,如果和史蒂夫·科尔b、，如果
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关联数据

补充资料

摘要

疲劳在普通人群中非常普遍，是癌症治疗最常见的副作用之一。尽管慢性炎症和疲劳的分子机制尚未确定，但越来越多的证据表明促炎细胞因子在癌症相关疲劳中发挥作用。目前的研究利用全基因组表达微阵列来确定患有持续疲劳的乳腺癌幸存者白细胞中基因表达的差异和相关转录活性的改变(n个=11）和非疲劳对照(n个= 10). 我们专注于炎症相关基因的转录，尤其是那些对炎症前NF-κB转录控制途径有反应的基因。此外，考虑到糖皮质激素作为炎症过程的关键调节器的作用，我们检测了表明潜在糖皮质激素受体（GR）脱敏的糖皮质激素反应基因的转录。还评估了血浆皮质醇水平。与假设一致，结果显示NF-κB反应元件的转录物表达增加，糖皮质激素反应元件的表达减少(第页<.05）疲劳的乳腺癌幸存者。血浆皮质醇水平无差异。这些数据表明，促炎性转录因子活性的增加可能导致持续的癌症相关疲劳，并为NF-κB活性的增强，特别是GR抗炎性转录因子表达的降低提供了潜在机制。

关键词：基因表达、炎症、疲劳、癌症、皮质醇、NF-κB、糖皮质激素受体

1.简介

疲劳在普通人群中非常普遍，也是癌症治疗的常见副作用(Bower等人，2000年;Cella等人，2001年). 越来越多的证据表明健康人疲劳的炎症基础(Cho等人，2009年)和癌症人群(Alexander等人，2009年;Bower等人，2002年,2009;Collado-Hidalgo等人，2006年;Orre等人，2009年;舒伯特等人，2007年). 核因子（NF）-κB转录控制途径在控制促炎症基因的表达中起着关键作用，但尚未有研究证实NF-κB的异常激活是否与疲劳有关，以及哪些分子过程可能允许这种激活。一种可能的机制涉及糖皮质激素受体（GR）功能活性的降低，GR抑制NF-κB和其他促炎信号通路，并被认为在慢性应激和其他条件下导致持续炎症(Cole等人，2007年;Miller等人，2008b). 在这项研究中，我们检验了以下假设：（1）炎症相关基因的转录增加，特别是那些对促炎症NF-κB转录控制途径有反应的基因；（2）糖皮质激素反应基因转录降低，表明潜在的GR脱敏。

2.方法

2.1. 学科

受试者来自一个更大的项目，该项目旨在检测乳腺癌幸存者疲劳的免疫和行为相关性(Collado-Hidalgo等人，2006年). 这项研究的参与者是通过肿瘤登记列表、报纸广告、传单和其他媒体报道从洛杉矶地区招募的。合格标准包括：（1）最初诊断为1至5年前的早期乳腺癌（0、I或II期）；（2） 完成除三苯氧胺/芳香化酶抑制剂外的所有癌症治疗；（3） 没有癌症复发的证据；（4）无涉及免疫系统的慢性疾病或定期使用免疫抑制药物。在接受筛查的314名女性中，我们确定了50名符合条件的幸存者(Collado-Hidalgo等人，2006年).

疲劳是用SF-36的活力子量表进行评估的，这是一个可靠有效的4项量表，用于评估受访者在过去4周内感到“疲惫”、“疲倦”、“精力充沛”和“精神饱满”的时间(Ware and Sherbourne，1992年). 此量表的分数范围为0到100，分数低于50表示与疲劳有关的限制或残疾。在目前的研究中，我们使用了11名女性的生物样本，这些女性在SF-36活力量表上的得分在40分或以下，经过两到三次评估，表明严重和持续的疲劳。比较组由10名非疲劳女性组成，她们在SF-36活力量表的两次或两次以上评估中得分达到或超过70分。在之前的研究中，我们已经表明，在SF-36中得分低于50的乳腺癌幸存者表现出心理社会、免疫和神经内分泌功能的改变，这支持了这个临界点的有效性(Bower等人，2000年,2002,2003,2005年a,b条).

参与者在早上预约时提供血样并完成问卷调查，并进行称重和测量以确定体重指数（BMI）。对DSM-IV（SCID）进行结构化临床访谈，以评估当前和终身抑郁症。加州大学洛杉矶分校机构审查委员会批准了研究程序，并获得了所有参与者的书面同意。

2.2. 白细胞基因表达

总RNA提取自107外周血单个核细胞（Qiagen RNeasy；Qiagen-Valencia CA），并使用加州大学洛杉矶分校DNA微阵列核心中的Affymetrix人类基因1.0 ST高密度寡核苷酸阵列（Affymetix，Santa Clara CA）进行全基因组转录谱分析，如前所述(Cole等人，2005年). 转录物丰度通过稳健多数组平均法进行量化(Bolstad等人，2003年)根据组间平均表达差异≥30%来确定差异表达基因（错误发现率保持在5%）(本杰米尼和霍奇伯格，1995年). 我们使用GOstat生物信息学软件测试了疲劳幸存者炎症相关基因上调的先验假设(贝斯巴思与速度，2004).

RT-PCR分析独立测试的六个转录物的差异表达，显示了组间的差异表达以及与功能基因本体注释的一致性，该注释用于描述差异表达基因列表的整体特征（例如促炎细胞因子）。在iCycler仪器（Biorad，Hercules CA）上，使用TaqMan基因表达分析（Applied Biosystems，Foster City CA）和标准阈值循环分析（标准化为平行分析）对转录物进行三份分析ACTB公司mRNA。

2.3. 转录控制生物信息学

基于TELiS启动子的生物信息学分析(Cole等人，2005年)测试了本研究的主要假设，即疲劳乳腺癌幸存者的白细胞将显示出全球基因表达谱的改变，这与（1）NF-κB活性增加（通过差异表达启动子中的TRANSFAC V$CREL_01核苷酸基序评估），以及（2）GR活性降低（V$GRE_C）一致。上调与下调基因启动子中响应元件频率的比值被用作转录控制通路差异活性的度量，以及（log）在启动子长度（RefSeq指定的转录起始位点上游−300、−600和−1000到+200 bp）和基序检测严格性（TRANSFAC mat_sim值为.80、.90和.95）的九个不同参数组合上平均比率，以确保稳健的结果(Cole等人，2005年). 基于先前对同样大小样本中糖皮质激素抵抗的基因组分析（例如。，Miller等人，2008b)，我们预计在组间鉴定超过100个由1个以上SD差异表达的基因，产生.87倍的能力来检测上调与下调基因启动子内GRE流行率的15%差异。

2.4. 血清皮质醇

皮质醇浓度通过酶联免疫吸附试验（德克萨斯州韦伯斯特市诊断系统实验室公司）进行测定，检测下限为0.1µg/dL，组内变异系数为6.4%。

3.结果

大多数参与者都是已婚、白种人和绝经后的人，这与父母的研究一致(Collado-Hidalgo等人，2006年). 疲劳女性年龄较小（51.2岁对62.2岁；第页=0.003），接受放射治疗的可能性较小（64%对100%；第页=0.043），诊断后较非疲劳女性长（诊断后3.03年vs.2.14年；第页= .08). 疲劳女性目前被诊断为抑郁症的可能性也显著增加（50%对0%；第页=0.01），并且有过抑郁症诊断的可能性稍高（55%对20%；第页= .10). 在人口统计学、医学或治疗相关特征方面没有其他组间差异。

3.1. 差异基因表达

总共有437个转录物显示，疲劳幸存者和非疲劳幸存者的白细胞表达差异>30%（119个在疲劳幸存者中相对上调，318个在非疲劳幸存者中上调；见图1和补充表1). 疲劳幸存者中表达上调的基因中最显著的是编码促炎细胞因子的基因(IL1A、IL1B、IL6、锇)，参与趋化因子信号传导的基因(CXCL2、CXCR5、CCL20)和转录激活(IER3、ZNF331、NR4A2、NR4A3)和血管生长因子VEGFA（血管内皮生长因子）非疲劳幸存者中表达上调的转录物包括参与细胞毒性T淋巴细胞反应的基因(TRGC2、TIGIT、CX3CR1、CMKLR1、GZMH)，凋亡启动子NLRC4型，血红蛋白调节器惠普，RNA剪接调节器作物和糖化酶MGAM公司我们发现一致性白细胞亚群标记基因（即。，CD3Z、CD4、CD8A、CD19、CD14、CD16/FCGR3A型，或CD56型/NCAM1号机组). 疲劳幸存者中四个转录上调和非疲劳幸存者中两个转录上调的证实性RT-PCR分析证实了微阵列研究结果(补充表2).

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疲劳与非疲劳乳腺癌幸存者的差异基因表达。Affymetrix Human Gene 1.0 ST高密度寡核苷酸阵列检测出119个基因在疲劳幸存者中相对上调，318个基因在非疲劳幸存者中上调（红色表示过度表达，绿色表示表达不足）（要解释此图例中的颜色参考，请参阅文章的web版本。）。

与疲劳与免疫和炎症相关基因活性增加相关的假设一致，基因本体论分析确定了炎症（GO注释GO:0006954和GO:0002526）、免疫反应（GO:000695；GO:0002376）和细胞因子（GO:0005125）疲劳幸存者（全部）选择性上调基因中过度表达的功能注释第页< .001).

3.2. NF-κB和GR信号的作用

为了验证关于NK-κB和GR转录因子活性的假设，我们对差异表达基因启动子中的转录因子反应元件进行了TELiS生物信息学分析。结果显示，相对于非疲劳幸存者，疲劳状态下上调基因启动子中NF-κB反应元件的密度显著增加(图2A; 启动子长度和扫描严格性的九种组合的平均差异为2.28倍±.09，第页<.0001），以及在疲劳与非疲劳幸存者中上调基因启动子中糖皮质激素反应元件的显著低表达(图2B; 启动子长度和扫描严格性的九种组合的平均值为.45倍±.07，第页= .007). 这导致疲劳幸存者上调基因启动子中亲抗炎转录因子结合基序的净偏差为5.10倍（与中性的差异为1.0倍，第页= .0004).

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms448851f2.jpg

NF-κB和GR信号通路的转录活性。TELiS生物信息学分析结果显示，在疲劳和非疲劳的乳腺癌幸存者中，上调基因的启动子中，NF-κB反应元件的密度显著更高（2A），糖皮质激素反应元件的密度显著更低（2B）。

在基于启动子的生物信息学分析之前，协方差分析用于消除因年龄、诊断后时间和放射治疗引起的基因表达谱的所有变异。结果继续显示，在疲劳幸存者中上调的基因启动子中，NF-κ，第页=.041）。在控制当前抑郁症和抑郁症病史的分析中，NF-κB增加的生物信息学指标仍然显著（根据SCID测量；两者的差异均大于1.5倍，第页< .02). GR脱敏的迹象通过对当前抑郁症的控制（调整后ns）减弱，但在控制抑郁症病史后继续表明GR活性降低（0.77倍，第页= .082).

为了确定GR转录活性的降低是否由皮质醇输出量的降低介导，在与转录轮廓白细胞同时采集的血样中检测血清皮质醇水平。结果表明，各组之间没有显著差异（疲劳组的平均值为29.9µg/dl±4.3，非疲劳组为33.9±3.6，第页= .50). 为了确定GR转录活性降低是否可能是GR基因表达降低的继发因素，我们分析了NR3C1号机组微阵列基因表达谱中的mRNA水平。各组GR转录物的平均水平差异<1%(第页= .80).

4.讨论

在本研究中，持续疲劳的乳腺癌幸存者的白细胞显示，编码促炎细胞因子和其他免疫激活介质的基因表达增加。虽然这些发现是在小样本中产生的，应该谨慎解释，但目前的结果支持这样的假设，即外周炎症信号可能通过激活CNS介导的“疾病行为”而导致癌症相关疲劳(Miller等人，2008a)并且与之前癌症患者和幸存者中疲劳与炎症蛋白生物标记物升高相关的数据一致(Bower等人，2002年;Bower等人，2009年;Collado-Hidalgo等人，2006年).

本研究还扩展了疲劳和外周炎症信号之间的基本联系，以确定上游转录控制通路活性的变化，这些通路可能会构建炎症相关基因表达的观察差异。基于启动子的生物信息学分析表明，疲劳乳腺癌幸存者白细胞中促炎症NF-κB/Rel转录因子的活性增加。补品上调NF-κB活性的基础尚不清楚，但可能源于抗炎GR转录因子对NF-κ的补品抑制减弱。与以往将GR脱敏与NF-κB活性增加联系起来的研究一致(Cole等人，2007年;Miller等人，2008a,Miller等人，2009年)我们发现疲劳的乳腺癌幸存者白细胞中GR介导的转录活性显著降低。这种效应发生在缺乏差异性HPA轴皮质醇输出的情况下，这表明配体活化减少不能解释观察到的GR介导的基因转录减少，尽管对皮质醇生成进行了更全面的评估（例如，昼夜皮质醇节律、总皮质醇产量）将需要完全解决这种可能性。GR无下降(NR3C1号机组)观察到mRNA表达，表明GR数量的减少也不太可能解释观察到的影响。这一发现模式与之前的几项研究一致，这些研究发现，在没有GR表达或皮质醇水平降低的情况下，GR介导的基因表达降低。这种效应最可能的机制涉及GR的可诱导翻译后修饰（例如磷酸化），这可以使GR对配体诱导的转录激活不太敏感，从而诱导功能性糖皮质激素抵抗状态。

协方差分析的结果表明，观察到的基因表达谱中的一般炎症倾向与当前抑郁或抑郁史无关。这些结果与我们之前的研究一致，即血浆炎症标记物中与疲劳相关的升高不能由抑郁症的共同症状来解释(Bower等人，2002年,2009). 然而，目前的研究结果也表明，当前的抑郁可能对观察到的GR脱敏有更为具体的贡献。未来需要在更大样本中进行研究，以更清楚地区分作为焦点症状的癌症相关疲劳和表征重度抑郁障碍的更广泛的症状特征。

之前的一项研究检测了癌症相关疲劳患者的基因表达，表明异常的B淋巴细胞活性可能会导致这种症状(Landmark-Hoyvik等人，2009年). 本研究表明，已知主要由活化的髓系细胞表达的关键促炎细胞因子的上调存在明显不同的细胞机制。这些差异可以通过所研究的人群、微阵列分析平台和相关统计方法的差异，以及先前研究的假设生成探索格式与本研究的目标假设测试方法的差异来解释。然而，目前的研究结果需要在更大的样本中进行复制，并对HPA活性进行更全面的评估。

临床试验已证明细胞因子拮抗剂对免疫相关疾病患者疲劳的有益影响(Tyring等人，2006年)有初步证据表明，这些疗法也可以减少癌症患者的疲劳(Monk等人，2006年). NF-κB和GR转录因子活性改变的发现扩大了改善持续性癌症相关疲劳的治疗靶点范围，包括NF-κ）B转录因子的特异性拮抗剂和/或抑制或逆转获得性功能性GR脱敏的药物。此外，与减少炎症过程相关的行为疗法，如运动(Fairey等人，2005年)和瑜伽(Kiecolt-Glaser等人，2010年;普伦等人，2008年)也可能有希望治疗癌症患者的炎症相关疲劳。

补充材料

补充表1

单击此处查看。（14K，xls）

补充表2

单击此处查看。（44K，xls）

补充表3

单击此处查看。（30K，文档）

致谢

这项工作得到了塞梅尔神经科学与人类行为研究所加州大学洛杉矶分校表亲心理神经免疫学中心、加州大学洛杉矶校区乔森综合癌症中心、乔森癌症中心基金会、乳腺癌研究基金会、加州大学LA老年美国人独立中心炎症生物学核心、T32-MH19925、HL 079955、，AG 026364、CA116778、RR00827、P30-AG028748和普通临床研究中心计划。

脚注

利益冲突

作者报告没有利益冲突。

附录A补充数据

与本文相关的补充数据可以在在线版本中找到，网址为doi:10.1016/j.bbi.2010.09.010。

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