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J签证费用。2013; (72): 50072.
2013年2月7日在线发布。 数字对象标识：10.3791/50072
预防性维修识别码：PMC3600743型
NIHMSID公司：NIHMS514536
PMID：23426144

金黄色葡萄球菌利用人体血红蛋白作为铁源的生长

格勒布·皮什切尼, 凯瑟琳·P·黑莉,和埃里克·P·斯卡尔
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摘要

金黄色葡萄球菌是一种需要铁来执行重要代谢功能并导致疾病的致病细菌。人体内最丰富的铁储存库是血红素，血红素是血红蛋白的辅因子。要从血红蛋白中获取铁，金黄色葡萄球菌利用一种称为铁调节表面决定因子（Isd）系统的精细系统1Isd系统的成分首先结合宿主血红蛋白，然后提取并导入血红素，最后从细菌细胞质中的血红素中释放铁2,3.这条途径已被许多人剖析在体外研究4-9此外，在小鼠模型中反复证明了Isd系统对感染的贡献8,10-14事实证明，建立Isd系统对血红蛋白衍生铁的获取和增长的贡献更具挑战性。使用血红蛋白作为唯一铁源的生长分析因商业上可获得的血红蛋白的不稳定性、生长介质中游离铁的污染以及与铁螯合剂相关的毒性而变得复杂。这里我们提出了一种克服这些局限性的方法。高质量血红蛋白由新鲜血液制备，并储存在液氮中。将纯化的血红蛋白补充到铁缺失培养基中，模拟脊椎动物宿主体内病原体遇到的铁不良环境。通过挨饿金黄色葡萄球菌我们诱导生长的方式完全依赖于结合血红蛋白、提取血红素、使血红素通过细菌细胞膜并降解细胞质中的血红素的能力。该试验将有助于研究人员阐明血红蛋白/血红素衍生铁在金黄色葡萄球菌可能还有其他细菌病原体。

关键词：感染，第72期，免疫学，微生物学，传染病，细胞生物学，病理学，微量营养素，细菌感染，革兰氏阳性细菌感染，细菌学，金黄色葡萄球菌，铁获取，血红蛋白，细菌生长，细菌

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协议

1.新鲜血液中血红蛋白的纯化

  1. 获取补充抗凝血剂的新鲜人体血液。在整个净化过程中，将血液保存在冰上或4°C。
  2. 以1500 x g的速度离心血液20分钟。红细胞（RBC）将位于试管底部。小心地吸出上清液，并将沉淀轻轻地重新悬浮在冰冷的0.9%（w/v）NaCl溶液中。重复离心并洗涤3次。
  3. 将颗粒重新悬浮在1体积的冰镇10mM Tris-HCl（pH 8.0）中。这将导致红细胞因渗透压而溶解。添加甲苯至最终体积的约20%。
  4. 在4°C的烤箱中培养过夜。
  5. 将溶血液以20000 x g离心1小时。收集中间溶血液部分，使甲苯（浮在顶部）和颗粒保持不变。使用长颈吸管收集中间部分。
  6. 通过0.44μm注射器过滤器。如果溶液中含有颗粒物质且无法通过过滤器，则重复步骤1.5。
  7. 用高效液相色谱（HPLC）阴离子交换柱纯化血红蛋白（Hb）（Varian，PL-SAX 1000μm，150 mm×4.6 mm）。流动相A为10 mM Tris-HCl（pH 8.0），流动相B为10 mM-Tris-HCl+0.5 M NaCl。以2.0 ml/min的流速将溶剂B的0%-100%梯度运行2 min以上。根据吸收监测洗脱（λ：410 nm和280 nm）。仅收集具有鲜红色和显著吸收峰特征的部分(图1).
  8. 用磷酸盐缓冲盐水（PBS）透析洗脱液过夜，然后再透析几个小时。通过0.22μm注射器过滤器进行消毒。
  9. 为了测量Hb浓度，在PBS中制备已知浓度的Hb标准溶液。将标准溶液（见所用试剂表）或样品溶液与2x Drabkin试剂（粉末制备）以1:1的比例混合，以测定样品中的Hb浓度。例如，将100μl Hb溶液与100μl 2x Drabkin试剂混合在96个板中。培养15分钟，在540 nm处测量吸光度。绘制标准曲线并测定样品中的血红蛋白浓度。典型的产量为5-15 mg/ml。
  10. 在15%SDS-PAGE上运行15-20μg纯化血红蛋白，一式两份。将其中一个凝胶染色；将另一凝胶中的蛋白质转移到硝化纤维素膜上并进行血红蛋白免疫印迹(图2).
  11. 将1毫升等分血红蛋白冷冻并储存在液氮中。

2.缺铁培养基的制备

  1. 通过将RPMI粉末溶解在水中，添加制造商建议的碳酸氢钠和1%的酪氨酸钠（CA）（w/v），制备罗斯韦尔公园纪念研究所（RPMI）肉汤。通过0.2μm过滤器进行消毒，并冷藏保存。
  2. 通过添加7%（w/v）Chelex 100并在搅拌板上搅拌过夜，制备金属缺失RPMI（NRPMI）。通过0.2μm过滤器去除Chelex 100，并冷藏保存。用基本非铁金属补充介质：25μM ZnCl2，25μM氯化锰2，100 mM氯化钙2和1 mM氯化镁2预先配制成无菌1000x溶液。在这一步中使用一次性塑料容器，以避免可重复使用的供应品造成铁污染。

三。金黄色葡萄球菌血红蛋白作为唯一铁源的生长

  1. 条纹金黄色葡萄球菌用于在胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）上从冷冻原液中分离。在37°C下培养20-24小时。
  2. 将乙二胺-N，N'-双（2-羟基苯乙酸）（EDDHA）在无水乙醇中重新悬浮至100 mM。EDDHA不会进入溶液，而是用乙醇消毒。
  3. 将EDDHA添加到RPMI中，使其最终浓度达到0.5 mM。在进行下一步之前，让EDDHA溶解至少30分钟。由于批次间的差异，最终的EDDHA浓度可能需要降低至0.25 mM，以允许细菌生长。
  4. 接种单菌落金黄色葡萄球菌将含有EDDHA的5 ml RPMI放入15 ml螺旋锥管中。在37°C下培养，以每分钟180转（rpm）的速度振荡16-20小时。
  5. 将过夜培养物以7500 x g的速度离心5分钟，然后将颗粒重新悬浮在含有0.5 mM EDDHA的NRPMI中。规范化外径600到~3。
  6. 制备含2.5μg/ml Hb和0.1-1.0 mM EDDHA的NRPMI。由于批次之间的差异，螯合NRPMI中游离铁所需的EDDHA浓度可能会有所不同。
  7. 将步骤3.5中的10μl细菌悬浮液接种到15 ml螺旋锥管中的1 ml NRPMI+EDDHA+Hb中。
  8. 将培养物在37°C下培养48小时，并以180 rpm的速度摇晃或在滚筒上摇晃。
  9. 每6-12小时进行一次OD600通过去除50μl培养物并将其与150μl PBS混合在96 well板中读取。

具有代表性的结果

我们已经用HPLC从溶血液中纯化了人类血红蛋白（方案步骤1.7）。图1显示记录的洗脱液在280和410 nm波长下的吸光度。收集第5组分，丢弃其他组分。通常每毫升洗脱液可产生5至15毫克血红蛋白。用SDS-PAGE分析纯化的血红蛋白，一式两份，然后对凝胶进行蛋白质染色或转移到硝化纤维素上并进行免疫印迹（方案步骤1.10，图2).

我们已经评估了纯化的人类血红蛋白支持野生型生长的能力金黄色葡萄球菌和金黄色葡萄球菌缺少Isd系统的IsdB分量（Δ是分贝). IsdB是血红蛋白衍生铁获取所需的血红蛋白受体12.野生型和Δ是分贝在补充有人类血红蛋白（NRPMI+EDDHA+Hb）的铁缺失培养基中生长，如方案第3节所述。在NRPMI+EDDHA+Hb中生长时，野生型，但不是Δ是分贝随着时间的推移，培养物的光密度增加，表明其能够增殖(图3A). 相反，利用补充的游离铁（+FeCl）的能力三)野生型和Δ相同是分贝(图3B). 既不是野生型也不是Δ综合业务数据库在缺乏铁源的情况下增殖(图3B).

我们比较了金黄色葡萄球菌在NRPMI+EDDHA中添加从新鲜血液或冻干血红蛋白中纯化的血红蛋白。图4说明虽然从血液中纯化的血红蛋白需要IsdB才能生长，但冻干血红蛋白可以促进Δ的增殖是分贝。

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图1。血红蛋白纯化过程中洗脱部分的吸收。在整个洗脱过程中监测410 nm（血红素结合蛋白特有）和280 nm（所有蛋白的特征）的吸收。第五组分含有血红蛋白并被收集。

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图2。纯化人血红蛋白使用变性15%SDS-PAGE分离20微克纯化血红蛋白。A.用Bio-Read蛋白质分析染色试剂对蛋白质进行凝胶染色。B.硝酸纤维素膜免疫印迹血红蛋白。强烈的下带是血红蛋白单体，而较微弱的上带是血红蛋白二聚体和三元体，它们没有完全变性。

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图3。利用人类血红蛋白作为铁源金黄色葡萄球菌A.野生型（wt）或等基因血红蛋白受体的生长是分贝突变型（Δ是分贝)在NRPMI中，补充了铁螯合物EDDHA和人类血红蛋白，根据Student的双尾吨测试，第页< 0.05. B.添加10μM氯化铁（+FeCl）的NRPMI的增长三)或EDDHA（-FeCl三)wt和Δ之间没有差异是分贝。图表描述了一个代表性实验的数据，该实验包括三个生物复制。误差条表示重复之间指定时间点的光密度读数的标准偏差。

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图4。野生型（wt）或等基因血红蛋白受体突变体（Δ是分贝)在补充有从新鲜血液或冻干血红蛋白中纯化的血红蛋白的培养基中。该图描述了一个代表性实验的数据，其中包括三个生物复制。误差条表示重复之间指定时间点的光密度读数的标准偏差。星号表示由Student的双尾确定的统计上不同的值吨测试，第页< 0.05.

讨论

铁是所有生命王国的生物体所需的基本营养素15在脊椎动物中，铁被隔离以避免这种元素引起的毒性。这种隔离作用还可以在一种称为营养免疫的过程中保护铁免受微生物入侵16作为回应，病原体已经进化出规避营养免疫的策略。其中一种机制依赖于血红蛋白，血红蛋白是宿主体内最丰富的铁来源17血红蛋白包含在红细胞内。从受损红细胞释放的血红蛋白与宿主结合珠蛋白结合，表明巨噬细胞快速清除结合珠蛋白-血红蛋白复合物18为了获得血红蛋白，金黄色葡萄球菌表达溶解红细胞的溶血素19结合珠蛋白诱导的血红蛋白清除通过表达于金黄色葡萄球菌。金黄色葡萄球菌从血红蛋白的肽组分中提取血红素，通过将其从细胞壁蛋白传递到膜蛋白，将血红素导入细胞质。在细胞质中，血红素被加氧酶降解以释放游离铁，或完整地用于电子传递链20.

许多研究证明了Isd系统对感染的作用8,10-14此外，生化研究已确定其单个成分在血红蛋白衍生铁获取中的功能4-9这里我们描述了一种检测金黄色葡萄球菌血红蛋白是可用铁的唯一来源。在这方面，我们需要指出对实验成功至关重要的某些条件。

血红蛋白衍生铁获得生长分析中使用的试剂的质量和类型会显著影响这些分析中获得的结果。与从新鲜血液中获得的血红蛋白相比，以冻干形式储存的血红蛋白允许细菌独立于Isd系统的成分生长(图4)21这可能是由于溶化作用引起的血红蛋白结构变化所致。具体来说，冻干血红蛋白包含血红蛋白的四聚体、二聚体和单体，以及游离形式的血红素22.从新鲜血液中纯化血红蛋白并将其保存在液氮中，以确保蛋白质的完整性22对血红蛋白的广泛研究促进了从新鲜血液或重组形式中纯化高质量血红蛋白的方案的开发，这些方案可用于我们的分析23-25.

铁螯合剂的选择可能会影响生长测定。例如，经常用作铁螯合剂的2,2-二吡啶对细菌细胞有毒26这两种效应使得很难区分2,2-二吡啶对细菌生长的抑制是由于铁螯合还是毒性。此外，2,2-二吡啶可能具有膜渗透性，因此可以穿透细菌细胞并在细胞内螯合铁27我们发现，通过补充铁源可以逆转EDDHA对生长的抑制作用，使EDDHA成为细菌生长测试中更合适的铁螯合物。然而，需要添加到生长培养基中的EDDHA浓度可能会有所不同。这是由于不同批次的EDDHA效价和生长培养基铁含量不同所致。通过化学去除残留铁，EDDHA批次之间的铁螯合活性可以标准化28然而，由于RPMI批次之间的差异，我们发现最终的EDDHA浓度可能仍需要调整，以允许在存在铁源的情况下生长。我们发现野生型生长所需的最高EDDHA浓度金黄色葡萄球菌血红蛋白的存在是本实验的最佳条件。

可以对现有方案进行修改，使其更接近细菌在感染期间遇到的环境。例如，在宿主体内，从血红蛋白中释放的血红素很快被血红素结合蛋白结合。血红素不能被用作铁源金黄色葡萄球菌因此，添加它将阻止在与金黄色葡萄球菌12.

我们认为，该试验可用于研究各种细菌病原体对金属的获取。此外，该方法可用于测量来自宿主内存在的非血红蛋白铁源的铁获取。

披露

我们没有什么要透露的。

致谢

这项研究得到了美国公共卫生服务局（U.S.Public Health Service）的资助，AI69233和AI073843是由国家过敏和传染病研究所（National Institute of Allergy and Infectious Diseases）提供的。E.P.S.是Burroughs Wellcome传染病发病机制研究员。K.P.H.由细胞和分子微生物学培训资助计划5 T32 A107611-10资助。

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