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单元格。作者手稿；PMC 2013年7月20日提供。
以最终编辑形式发布为：
单元格。2012年7月20日；150(2): 251–263.
数字对象标识：2016年10月10日/j.cell.2012.06.024
预防性维修识别码：PMC3600117型
NIHMSID公司：美国国家卫生研究院393895
PMID：22817889

黑色素瘤司机突变的景观

埃兰·霍迪斯，1,2,19 伊恩·R·沃森，三，10,19 格雷戈里·克柳科夫，1,2,12 斯特凡·阿罗德，4 马金·伊米林斯基，1 Jean-Philippe Theurillat女士，1 伊丽莎白·尼克森，1 丹尼尔·奥克莱，1 李立仁，三，10 切尔西广场，10 丹尼尔·迪卡拉，1 亚历克斯·H·拉莫斯，1,2 迈克尔·劳伦斯，1 克里斯蒂安·西布尔斯基斯，1 安德烈·西瓦琴科，1 道格拉斯·沃特，1 戈登·萨克塞纳，1 尼古拉斯·斯特兰斯基，1 罗伯特·奥诺弗里奥，1 温迪·温克勒，1 克里斯汀·阿德利，1 尼基尔·瓦格尔，1,2 詹妮弗·瓦戈，13 Kelly Chong女士，14 唐纳德·莫顿，15 凯瑟琳·斯特姆凯·黑尔，5 郭晨，6 迈克尔·诺布尔，1 马修·梅尔森，1,2,10,11 约翰·拉德伯里，4 迈克尔·A·戴维斯，5,6 杰弗里·格申瓦尔德，7,8 斯蒂芬·瓦格纳，16 戴夫·S.B.胡恩，14 德克·沙登多夫，17 埃里克·S·兰德，1,18 斯泰西·B·加布里埃尔，1 加德·盖兹，1 列维·A·加拉韦，1,2,10,11,20,*和琳达·琴1,2,三，9,10,20,*
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关联数据

补充资料

总结

尽管最近对黑色素瘤遗传学有了深入了解，但由于暴露于致癌紫外线（UV）光而导致大量乘客突变，对驾驶员突变的系统性调查受到了挑战。我们开发了一个基于排列的框架来应对这一挑战，利用内含子序列的突变数据来控制每个基因的乘客突变负荷。用这种方法分析大规模黑色素瘤外显子组数据发现六个新的黑色素瘤基因(PPP6C型，RAC1型，SNX31系列，节气门执行器控制1，STK19型和ARID2公司)其中三个-RAC1系统，PPP6C型和STK19型-具有复发性和潜在的靶向性突变。与染色体拷贝数数据的整合使驾驶员突变的情况变得更加复杂，从而为BRAF和NRAS驱动的黑色素瘤以及未知黑色素瘤的致癌性提供了见解美国国家科学院/BRAF公司突变。景观也阐明了RB和p53通路在这种恶性肿瘤中放松调控的突变基础。最后，驱动突变谱为紫外线在黑色素瘤发病机制中的直接诱变作用提供了明确的基因组证据。

简介

近年来，人们对黑色素瘤发生、发展和治疗反应的分子基础有了很多了解。BRAF公司V600突变（存在于50%的黑色素瘤中）预测RAF抑制剂（如vemurafenib）的临床疗效；激活KIT畸变可预测对酪氨酸激酶抑制剂如伊马替尼、尼罗替尼或达沙替尼的反应；一些NRAS突变肿瘤可能对MEK抑制敏感（在(Flaherty等人，2012年)). 其他提供治疗见解的黑色素瘤基因突变包括川东北2A删除，MITF公司放大/改变导致“可用药”抗凋亡蛋白的失调，以及PTEN公司导致PI3激酶/AKT活化的破坏（在(Chin等人，2006年)). 复发性突变黑色素瘤基因的持续发现(Berger等人，2012年;Nikolaev等人，2012年;Stark等人，2012年;Wei等人，2011年)以及缺乏在没有美国国家科学院或BRAF公司突变，表明对这种恶性肿瘤的基因理解仍然不完整。

虽然人们认识到了综合基因组测序在发现黑色素瘤基因方面的潜力，但人们也越来越认识到紫外线诱变导致的高突变负荷的混杂影响。特别是，与几乎所有其他实体瘤相比，皮肤黑色素瘤的碱基突变率显著升高(Berger等人，2012年;Pleasance等人，2010年)这几乎完全归因于胞苷到胸苷（C>T）跃迁丰度的增加，这是紫外线诱导突变特征。不同基因座的体细胞突变率高企可能会限制统计方法的能力，这些方法假设基础突变率的一致性，以区分含有“驱动”突变的基因（即，赋予或在某些点赋予肿瘤细胞适合性优势的突变）来自那些有“乘客”突变（即，从未赋予健康优势的突变）的人。尽管解释这种突变率异质性的方法是一个活跃的研究领域(Chapman等人，2011年;Greenman等人，2006年;Lohr等人，2012年)，一直缺乏应对黑色素瘤这一挑战的严格方法。

一个相关的问题与紫外线诱导的DNA损伤在核苷酸水平上的致瘤效应有关。流行病学和实验数据已经确定了在发育过程中强烈紫外线暴露（例如，生命早期的起泡晒伤）在黑色素瘤发生中的因果关系（在(Garibyan和Fisher，2010年)). 一些模型系统还将紫外线依赖的致瘤效应与信号通路的调节联系起来（例如，增强γ-干扰素分泌(Zaidi等人，2011年); JNK信号通路的激活(Derijard等人，1994年))从而支持黑色素瘤中的非诱变作用。相反，直接紫外线诱变作用在黑色素瘤发病机制中的证据则更加模棱两可。例如，产生致癌NRAS和BRAF突变的反复碱基突变并不是表明紫外线诱变的C>T转换。这个问题的最终解决需要证明直接归因于紫外线诱导的黑色素瘤损伤的驱动基因突变。

为了分析121对黑色素瘤/正常人的全基因组测序数据，我们采用了一种统计方法，根据外显子/内含子突变分布推断每个基因位点的阳性选择，以及每个突变的预测功能影响。这种方法既能发现几个新的癌症基因，这些基因具有功能上重要的（并且可能起作用的）突变，又能鉴定出许多可直接归因于紫外线诱变的驱动突变。总的来说，这些结果为人类黑色素瘤中司机编码突变的前景提供了一个全面的观点。

结果

全外显子组测序鉴定黑色素瘤编码突变

对135例黑色素瘤患者的配对肿瘤和正常基因组DNA进行了溶液相杂交捕获和全基因组测序(表S1、S2)。平均靶点覆盖率达到103倍，87%的碱基在肿瘤中覆盖至少14倍，在正常情况下覆盖至少8倍，这一阈值提供了80%的能力来检测等位基因分数为0.3的突变(Carter等人，2012年)。一组121个肿瘤/正常对（15个原发性肿瘤，30个转移性样本和76个来自转移性肿瘤组织的短期培养物(表S1))有资格进行分析。总的来说，这个样本集包括95个皮肤黑色素瘤，5个肢端黑色素瘤、2个粘膜黑色素瘤和1个葡萄膜黑色素瘤以及18个未知的原发性黑色素瘤。体细胞拷贝数畸变谱确定了预期的黑色素瘤改变(Curtin等人，2005年;Lin等人，2008年)，包括收益MITF公司，TERT（地形）和CCND1号机组和删除CDKN2A型和PTEN公司，除其他外(图S1A，表S3).

在所有样本中，共检测到86813个编码突变，非同义与同义事件的比率为2:1，这与高乘客突变负荷相一致(表S4)。样本突变率中位数为每兆碱基14.4个编码突变（上下四分位数范围：8.0-24.9）。不出所料，这一比率高于其他任何类型的肿瘤，包括肺癌(Lee等人，2010年;Pasqualucci等人，2011年;癌症基因组图谱研究网络，2011年)，并且UV诱变的特征占主导地位（YC>YT突变的中位数：82.2%；上下四分位数范围：73.4%-86.5%）。因此，13905个基因在至少一个肿瘤中存在非沉默突变，9782个基因在两个或多个肿瘤中发生突变，515个基因在>10%的肿瘤中发生变异，78个基因在>20%的肿瘤中突变(图S1B)。在>10%和>20%的样本中突变的基因中，85.5%和85.2%的非沉默编码突变分别由YC>YT转换引起，这表明许多高频黑色素瘤基因突变可能源于紫外线相关的乘客事件。

下一步，我们试图找出显示非沉默突变阳性选择的统计证据的基因，这在黑色素瘤基础突变率高且异质的背景下是一项具有挑战性的任务。为了说明基础突变率的区域异质性带来的问题，我们使用标准分析方法定义了显著突变的基因，该方法假设外显子组的基础突变率一致（控制三核苷酸上下文），如之前发表的那样(丁等人，2008;Getz等人，2007年;Kan等人，2010年;Stransky等人，2011年;癌症基因组图谱研究网络，2011年)。这项分析产生了一长串基因(n个=544），非沉默突变频率超过外显平均值，因此被认为是“显著”突变(图S1C)。其中许多基因表现出较高的沉默突变率（显著性等级与沉默突变率的相关性：R（右）= 0.29,第页< 2.2 × 10−16皮尔逊；图S1D)表明基础突变率局部升高。此外，根据已发表的RNA测序（RNA-seq）数据的跨队列分析（显著性等级与表达水平的相关性：R（右）=−0.08和第页= 4.4 × 10−16) (Berger等人，2010年)，这与已发表的研究一致，该研究表明，表达水平较低的基因往往携带更高的体细胞突变率(Chapman等人，2011年;Pleasance等人，2010年)。在我们的数据中，我们还观察到基因表达和突变率之间的反相关(R（右）=−0.10和第页= 4.4 × 10−16)。总之，这些结果突出了在可变的基础突变率设置中检测阳性选择的挑战。这些基因座可能积累与阳性选择无关的频繁体细胞突变，但通过假设基础突变率一致的统计方法，这些基因座被认为是显著的。相反，基础突变率低的基因座中的基因可能积累很少的突变。在这里，只有在解释了这种降低的突变率之后，阳性选择的证据才会变得明显。与紫外线暴露相关的高突变负担使局部特异性突变率的异质性更加明显，从而进一步加剧了黑色素瘤的这一问题。

黑素瘤基因位点阳性选择的系统推断

为了更准确地确定黑色素瘤基因组中的阳性选择，我们利用了来自侧翼内含子区域和其他未翻译（UTR）DNA片段的序列数据，这些片段在杂交选择期间与外显子目标一起捕获，以确定局部碱基突变率。我们推断，任何紧邻外显子的DNA序列都可能受到与外显子序列类似的突变和修复过程。事实上，在我们的数据集中，基因特异性的内含子和外显子突变率在几个数量级上相关(R（右）=0.35，第页< 2.2 × 10−16;图S1E)。然而，与外显子对应物的非沉默突变不同，内含子和UTR序列的突变更可能存在于中性选择压力下。因此，从这些侧翼区域获得的突变数据应该提供一种方法，可以据此推断特定于当地的突变率。

包含高频率非沉默外显子突变和低频率同义或内含子/UTR突变的基因显示了肿瘤进化过程中正向选择的推定证据。这种突变模式可能意味着真诚地黑色素瘤的驱动基因突变。另一方面，非沉默外显子突变和同义、内含子和/或UTR突变频率高的基因不太可能包含在肿瘤发生过程中经历阳性选择的突变(图1A)。基于这些原理，通过随机排列所有观察到的突变的位置，可以生成基因（外显子、内含子和UTR）上所有突变分布的零模型(图1B)。这个零模型是按样本计算的，因为基因座基础突变率可能因样本而异。然后，可以进行置换测试，以评估与所有单个样本零模型生成的零模型相比，基因中任何集合宽观察的统计显著性。

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非沉默突变的阳性选择检测

（A）与沉默和内含子突变率相比，基因A位点显示出更高的非沉默突变率（左），表明非沉默突变的正向选择，基因B位点显示出近似相等的非沉默变异率和沉默/内含子突变（右）指示与基础基因座突变率匹配的非沉默突变率。（B）基于排列的框架模式，用于识别含有阳性选择非沉默突变的基因。（C）121个测序样本中至少有一个突变的所有基因的功能突变负荷测试（λ=1.02）和同义突变负荷测试的Q-Q图。虚线表示问功能突变负荷试验≤0.2。灰色阴影区域表示预期的95%置信区间第页-值。（请参见图S1).

利用这个框架，我们评估了集合范围内“功能突变负担”的统计意义：具有预测功能结果的非沉默突变的样本数量(Adzhubei等人，2010年)。11个基因被发现携带具有统计学意义的功能突变负担(问≤0.2，本杰明·霍伯格(本杰米尼，1995年)) (图1C;表S5;图S1F)。其中包括六种众所周知的癌症基因(BRAF，NRAS，PTEN，TP53，p16INK4a[CDKN2A型基因位点]，以及MAP2K1（地图2K1）)和五名新候选人(PPP6C、RAC1、SNX31、TACC1、和STK19型)。对这些位点上观察到的突变进行手动审查和质谱基因分型，证实非同义：同义突变率高，沉默突变率低(图1C;表S5、S6)。与初始显著性分析（如上所述）的结果相反，对低表达基因的总体偏见不再明显(R（右）=−0.04,第页=6.2 x 10−6)。作为对照，我们对“同义突变负担”进行了类似的评估，该分析没有发现具有统计学意义的基因(图1C;表S7)。因此，结合外显子和非外显子突变数据确定了多个位点，这些位点显示出正选择的证据，因此可能包含包含驱动突变的基因。

新的黑色素瘤基因与已知的癌症相关途径相关

五个新的候选基因包含假定的体细胞驱动基因突变(PPP6C、RAC1、SNX31、TACC1和STK19）此前未发现黑色素瘤有明显突变。PPP6C型异源三聚体PP6蛋白磷酸酶复合物催化亚单位的编码(Stefansson等人，2008年)。由于PPP6C在调节细胞周期和有丝分裂中的作用，有报道称其是一种肿瘤抑制因子。PP6负调节黑色素瘤癌基因水平CCND1号机组在细胞周期的G1期(Stefansson和Brautigan，2007年)是有丝分裂激酶Aurora A（AurA）的主要T环磷酸酶，在许多人类癌症中扩增(Lens等人，2010年;Zeng等人，2010年)。在121个肿瘤/正常对的发现集中，11个黑色素瘤（9%）具有非同义性PPP6C型根据高突变等位基因频率，其中10个突变被预测为纯合子事件。其中60%PPP6C型突变集中在第264密码子精氨酸两侧的12个氨基酸区域内（四个R264C突变、两个S270L突变和一个P259S突变；图2A)。当被定位到PP2A催化亚基的结构上时（与PPP6C约60%的序列同源性；图2A，图S2A)，PPP6C突变定位于高度保守区域。特别是，R264在催化亚基和调节亚基之间的界面上参与多种盐桥相互作用(Cho和Xu，2007年)。这个PPP6C型在63个黑色素瘤扩展样本集中，发现R264C突变的频率为3%(表S8)。R264及其附近残基的纯合热点（定义为121个发现集中>3%的样品中存在相同的氨基酸变化）突变可能导致PPP6C催化亚基与其调控伙伴之间的相互作用发生改变。聚集突变模式和无义突变或移码指数相对较少是获得功能突变的特征，表明这种蛋白磷酸酶功能的失调可能与黑色素瘤生物学有关。

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显著突变基因PPP6C型，STK19型，SNX31系列，节气门执行器控制1

（A–D）结构域和突变示意图第6页，STK19型，SNX31系列和节气门执行器控制1. (A、 底部面板)PPP6C同源蛋白PP2A（PDB:2IAE）的结构，带有映射的PPP6C体细胞突变（除了映射到PP2AC A274的PPP6 C S270之外，所有突变残基在这两个蛋白之间都是保守的）。盐桥相互作用由缩放图像中的虚线表示。PPP基序：蛋白磷酸酶；类泛素：泛素相关折叠；类PTB：PTB：磷酸酪氨酸结合；PX：Phox同源性；FERM样结构域：带4.1（F）、Ezrin（E）、Radixin（R）和Moesin（M）；SPAZ：Ser-Pro Azu-1图案；TACC：转化酸性线圈。（请参见图S2).

中的突变STK19型（一种功能未知的预测激酶）在黑色素瘤中表现出热点模式。六个非同义词STK19型在发现集中发现了5个肿瘤（4%）的突变(图2B)其中四个位于D89（D89N），紧邻一个额外突变（P90L）。D89N突变在59个肿瘤的黑色素瘤扩展集中表现出一致的频率（5%）(表S8)。其体细胞热点突变的模式和意义是强有力的基因组证据，支持STK19型作为一种新的癌症基因。

相反，节气门执行器控制1和SNX31系列显示出突变事件的分布模式。SNX31型编码特征不佳的蛋白质排序连接蛋白31。突变往往发生在SNX31的蛋白质和脂质相互作用带4.1/ezrin/radidin/moesin（FERM）样结构域内(图2C)在两个单独的黑色素瘤病例中，域中发生了一个突变，并且超过60%的非沉默突变发生在这个440-残留蛋白的48个残留窗口中。据报道，SNX31可能通过其FERM样结构域结合活性三磷酸鸟苷（GTP）负载的H-Ras，但不结合活性二磷酸鸟苷(Ghai等人，2011年)表明SNX31作为Ras效应蛋白具有潜在作用。

节气门执行器控制1编码转化酸性螺旋蛋白1，据报道可刺激Ras和PI3K通路，并在小鼠过度表达时促进转化(Cully等人，2005年).节气门执行器控制1在发现集中的八个黑色素瘤（7%）中发生突变，突变主要发生在蛋白的C末端附近，在保守的TACC结构域中或附近(图2D)。已知TACC1与AurA相互作用(Conte等人，2003年;Delaval等人，2004年)，在PPP6C作为AurA磷酸酶的功能方面值得注意(Zeng等人，2010年).

最后，5%的发现集黑色素瘤在RAC1系统是GTPases Rho亚家族的RAS相关成员。RAC1起到分子开关的作用，通过核苷酸结合位点附近的大构象变化，在活性GTP结合态和非活性GDP结合态之间循环，定位于开关I和II区域。其最显著的功能是调节细胞骨架重排，因此在细胞粘附、迁移和侵袭中发挥重要作用(杰菲和霍尔，2005年)。据报道，在许多恶性肿瘤中过度表达(Karlsson等人，2009年).RAC1型我们的黑色素瘤中的突变显示出热点模式，所有六个突变都影响相同的核苷酸变化(图3A)。这种c.85C>T转变导致P29S氨基酸改变，是继BRAF公司和美国国家科学院(表S9)。包括来自两个独立扩展集的验证数据(n个=59和n个=175）RAC1系统黑素瘤P29S热点突变率为3.9%（14/355例；表S8和S10)。此外RAC2系统（第29L页）和RHOT1（P30L）也被发现(图3B)，强调P29残基作为Rho家族GTPase热点突变可能靶向的密码子的重要性。我们还观察到一个已知的RAS家族激活突变（G12D）（在Malumbres and Barbacid，2003年)在另一个Rho家族GTPase成员的基因编码中，CDC42型(图3B)。总之，这些突变数据表明Rho家族成员是黑色素瘤致癌基因。

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开关I中RAC1热点突变与黑色素瘤中GTPases Rho家族的关系

（A）图示为RAC1晶体模型（PDB:1MH1）的原理图（左）和图像，P29。（B）P29同源或已知激活突变在Rho家族成员中的分布，RAC1系统，RAC2系统，RHOT1型、和CDC42型.

RAC1（P29S）突变是一种获得功能的致癌事件

探讨RAC1系统P29S突变，我们基于GDP-结合构象和GTP/PAK1-结合构象中97%氨基酸序列同源RAC3的晶体结构进行同源性建模(图S4A、B)。在GDP-结合状态下，P29位于开关I的疏水囊中，而S29由于缺乏形状互补性、疏水性降低以及丝氨酸羟基氧与相邻疏水残基的不利接近性，预计在能量上不太有利(图4A，底部左侧和右侧面板）。在GTP绑定状态下，开关1回路的封装不太紧凑(图4B，顶部左侧和右侧面板）。因此，失去了野生型P29而非突变型S29的能量优势。相反，S29预计与E31的极性侧和主链形成氢键，这将稳定GTP结合形式(图4B，左下和右下面板）。此外，与野生型相比，P29S突变体在从GDP过渡到GTP结合形式时会获得更多的熵，因为在GDP结合状态下，开关1与蛋白核心相连，而在GTP结合状态中，开关1的灵活性受到P29的限制(图S4C)。这些观察结果表明，p.P29S可能会破坏RAC1的非活性GDP结合态，并有利于其活性GTP结合态。

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RAC1系统P29S正在激活

（A）同调模型（基于PDB条目2G0N）以GDP绑定形式将图像缩放到P29（顶部面板）和P29S（底部面板）。（B）同调模型（基于PDB条目2QME）以GTP绑定形式将图像缩放到P29（顶部面板）和P29S（底部面板）。相关氨基酸在球体（左侧面板）和卡通表示（右侧面板）中突出显示。（C）通过HEK293FT细胞中p21-活化蛋白激酶1（PAK1）下拉物的p21-结合域（PBD）检测GFP标记的RAC1 GTP结合状态（T17N：显性阴性；Q61L：组成活性）；（D）存在外源性GDP或GTPγS（NT：无处理；GTPγS:非水解GTP类似物）；（E）转染稳定表达NRAS突变形式的永生化黑素细胞（pMEL）或(F类)BRAF（请参阅图S4).

由于已知活性的GTP负载的RAC1与p21活化蛋白激酶1（PAK1）的p21结合结构域（PBD）相互作用以调节与肿瘤发生相关的下游事件，因此PAK1 PBD下拉测定可用于测量GTP结合的RAC1。在HEK 293FT细胞中，PAK1 PBD下拉显示与野生型相比，GTP负载活性状态下RAC1（P29S）的比例明显更高(图4C，比较车道2和3）。正如预期的那样，在富含GTP的组分中发现了组成活性RAC1（Q61L）突变体(图4C，将车道2与车道4和车道5进行比较）。在存在外生GDP的情况下，RAC1（P29S）表现出向非活动GDP约束形式的衰减转变，这与结构预测一致(图4D，将车道1和2与车道4和5进行比较）。重要的是，GTP-loaded RAC1（P29S）在稳定表达致癌NRAS或BRAF的永生化人类黑素细胞中也明显增加(图4E和F)。总之，生化和结构结果支持以下结论：RAC1系统P29S突变正在激活，使RAC1优先处于激活的GTP结合状态。

预测功能丧失的黑色素瘤基因突变

与相同基因中错义突变的影响相比，导致蛋白质截短的假定抑癌基因突变可能更可能赋予肿瘤细胞适应优势。由于上述基于排列的框架在不考虑突变的功能后果的情况下模拟了基础突变率，我们接下来使用它来检测比偶然预期的“功能丧失（LoF）突变负担”更高的基因。LoF突变被定义为无义、剪接位点和移帧事件。两者都有第16页INK4a公司和ARID2公司显示出具有统计学意义的LoF负担(问≤0.2;表S11)，使用第16页INK4a公司14个发现样本中的LoF突变（12%）和ARID2公司9个样本的LoF突变（7%）。

所有无意义突变ARID2公司编码SWI/SNF染色质重塑复合物的一个成分，预计会产生缺失DNA结合所需C2H2 Zn-finger基序的截断变体（5%的样本）(图5A)，这让人联想到失活ARID2公司丙型肝炎病毒相关肝细胞癌中发现的突变(Li等人，2011年)。尽管ARID2公司此前还没有发现黑色素瘤中有显著突变，三项研究报告了单核突变-所有无意义事件(Nikolaev等人，2012年;Stark等人，2012年;Wei等人，2011年)。对SWI/SNF复合物其他成分LoF突变的靶向搜索发现ARID1B公司（一个基因也有显著的LoF负担，尽管在我们的发现集中它没有通过多重假设测试的修正）ARID1A公司，其中一个SMARCA4系统(图5B)。因此，13%（16/121）的发现样本在SWI/SNF复合物的一个成分中含有LoF突变，表明染色质重塑失调在黑色素瘤发生中起作用。

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功能缺失突变ARID2公司

（A）中的域和突变示意图ARID2公司.（B）功能缺失（无义、移框indel、剪接位点）突变ARID2公司，ARID1B公司，ARID1A公司，SMARCA4系统跨序列样本。

黑色素瘤司机突变的景观

本研究中已知和新的驱动因素的识别提供了黑色素瘤基因突变的全局视图。通过将所有观察到的突变交叉引用到反复突变的碱基对(n个≥20）在COSMIC数据库中报告(福布斯等，2011年)我们用罕见的驾驶员事件来补充这一观点，这些事件的低频率排除了统计识别。这确定了CTNNB1公司，PIK3CA公司，第14页农业研究基金（替代成绩单CDKN2A型基因位点），EZH2型，印尼盾1，GNA11号机组，配套元件，赫拉斯和工作任务1(图6A;表S12)。为景观提供更全面的背景，特征性黑色素瘤基因的局部扩增或缺失，例如CCND1号机组，配套元件，川东北4和TERT（地形）和中的删除CDKN2A型和PTEN公司，在同一组样品中描绘。

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黑色素瘤司机突变的景观

（A） （顶部面板）每样本突变率。（中间面板）个体突变和拷贝数改变的彩色编码矩阵。在样本中发现每个基因有多个突变的情况下，只显示一个突变，优先考虑LoF（无义/拼接/移码）突变，然后是热点/COSMIC再流突变。最后一行表明黑色素瘤的原发性。（底部面板）所有样品的突变光谱。（B）选择突变和拷贝数扩增的分布BRAF公司，美国国家科学院，NF1型，人力资源管理系统，英国皇家空军1号，MAP2K1（地图2K1），配套元件，GNA11号机组，CCND1号机组和CDK4型显示在所有样本中。（请参见图S6).

综合这些突变和拷贝数数据，我们绘制了图6A如预期，83%（100/121）的黑色素瘤样本在美国国家科学院(n个=27）或BRAF公司(n个=73）以相互排斥的方式(第页= 3 × 10−14，Fisher精确地说）。这两个案例同时发生BRAF公司和美国国家科学院这些突变要么包含非V600 BRAF突变和致癌NRAS突变，要么包含未知致癌的NRAS突变和激活的BRAF变异。近44%（32/73）的黑色素瘤在BRAF公司窝藏着PTEN公司相反，突变或局灶性缺失PTEN公司只有4%（1/27）的黑色素瘤发生改变美国国家科学院(第页= 4.9 × 10−5) (图S6A)。这些突变模式的重要性通过对所有基因的配对搜索得到证实图6A(问≤0.2;表S13).

黑色素瘤发现集包括21个无高度复发突变的肿瘤BRAF公司或美国国家科学院(“BRAF公司/美国国家科学院野生型“样本）(图6B)。对这些样本中至少25%发生突变的基因进行搜索，并根据确定的功能性突变负担将其排在前50位NF1型.显著丰富了NF1型在该亚群中观察到突变；假定功能丧失NF1型21个肿瘤中有5个（25%）发生突变，而其余100个样本中有2个（2%）发生突变(第页= 5.8 × 10−3) (图6B)。考虑到NF1作为RAS信号负调控因子的作用(Vigil等人，2010年)，这些结果表明NF1型失活可能导致这些细胞中异常的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径激活BRAF公司/国家可再生能源管理局野生型样本。此外，激活人力资源管理系统G13I突变，激活加拿大皇家空军E478K突变(Emuss等人，2005年)、和两个MAP2K1（地图2K1）在BRAF公司/美国国家科学院野生型样本NF1型野生型(图6B)。在剩下的13个人中BRAF公司/美国国家科学院野生型样本，1个含有激活物配套元件V559A突变，6个（其中1个为肢端突变，1个为粘膜突变）显示配套元件，CCND1号机组和/或CDK4和1（葡萄膜黑色素瘤）具有激活作用GNA11号机组Q209L突变。总的来说，已知的黑色素瘤司机事件跨越81%（17/21）缺乏高度复发的病例美国国家科学院或BRAF公司突变(图6B)，提供了该亚型黑色素瘤中司机突变的统一视图。

CDKN2A型是一种众所周知的黑色素瘤肿瘤抑制基因，通过选择性剪接编码两种肿瘤抑制蛋白：p16INK4a公司，一种细胞周期素依赖性激酶抑制剂，通过CDK4和p14的负调控激活RB农业研究基金通过抑制其主要负调控因子MDM2激活p53(Chin等人，2006年)。这个第16页INK4a公司在我们的发现集中，20%以上的转录物发生了突变，25个突变中有14个是假定的LoF事件。结合一个剪接位点和两个无义突变RB1型以及三个R24激活突变川东北4我们估计，至少24%（29/121）的样本通过其核心成分的体细胞突变直接解除了对细胞周期检查点的调控。大多数含有p53突变的黑色素瘤病例（发现集中的19%）在p14中没有同时突变自动射频或p16INK4a公司(图S6B)。综上所述，这些数据支持了一种共识，即黑色素瘤中直接突变p53的遗传压力由于频繁缺失CDKN2A型基因座，并表明p53突变在无p14的黑色素瘤亚群中普遍存在农业研究基金突变。

最后，SWI/SNF复合物成员中的LoF突变，以及EZH2型和印尼盾1在17%（20/121）的黑色素瘤中发现，为染色质修饰蛋白和表观遗传调控因子参与黑色素瘤的发生或发展提供了基因组证据。

紫外线诱变在黑色素瘤驱动基因突变中的作用

接下来，我们系统地讨论了紫外线诱导的DNA损伤的错误修复作为黑色素瘤驱动因子突变的直接影响，即C>T（UVB）或G>T（UV a）。具体而言，我们评估了紫外线诱导DNA损伤引起的突变在驱动突变中的分布。在我们的分析确定的21个基因中的262个驱动因子突变中，46%是由UVB/UVA诱导突变特征的C>T（37%）或G>T（9%）突变引起的。当排除BRAF或NRAS中的驾驶员突变时，该百分比增至67%（103/150）。

TP53型在本研究确定的突变黑色素瘤基因中，紫外线诱导的突变总数最多(图7A)，挑战了经常将其野生型地位作为人类黑色素瘤特征的教条(Chin等人，2006年;Flaherty等人，2012年)。已知黑色素瘤抑癌基因中推测的紫外线诱导LoF突变(PTEN，p14ARF，p16INK4a)也很明显。新发现的显著突变基因ARID2、PPP6C、SNX31和TACC1每一种都有高比例的突变归因于C>T转换，这表明可能在UVB诱导的黑色素瘤发生中起作用。

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驱动突变中紫外线诱变的特征

（A）总数和（B）%说明了UVB单核苷酸变异（SNV）（C>T）、UVA SNV（G>T），二核苷酸变异（DNV）一半中的UVB（NC>NT；CN>TN）和DNV一半中的UV（NG>NT；GN>TN。虚线表示外显子范围样本中位数%UVB SNV（C>T）。

MAPK途径中的大多数已知激活突变，包括BRAF公司（c.1799T>A编码V600E）(n个= 63),美国国家科学院（c.182A>T，Q61L和c.182A>G，Q61R）(n个=16），套件（c.1676T>c，V559A）(n个=1），以及GNA11号机组（c.626A>T，Q209L）(n个=1），看起来不可归因于紫外线直接诱导的损伤(图7A)。在BRAF公司，其中所有二核苷酸突变包括C>T转换，包括V600E（C.1799–1800TG>AA）(n个=1），V600K（约1798–1799GT>AA）(n个=7），V600R（约1798–1799GT>AG）(n个=1）和L597S（约1789–1790CT>TC）(n个=1），这可能归因于UVB诱导的突变。也有基因突变RAS系统，包括美国国家科学院Q61K（c.181C>A和c.180–181AC>CA）(n个=9），Q61R（约181–182CA>AG）(n个=1），G12D（c.35G>A）(n个=1）和HRAS G13I（c.37–38GG>AT）(n个=1），可能由UVA和UVB引起的损伤引起。

四个基因，RAC1、STK19、FBXW7和印尼盾1所有的C>T突变的相对百分比都高于外显子全样本中值（~83%）。值得注意的是，热点突变PPP6C型R264C，STK19型D89N和RAC1系统P29S均仅由假定的UVB损伤介导(图7B)。有证据表明P29S优先以GTP结合形式呈现RAC1，导致PAK信号的下游激活(图4)，我们的数据揭示了可归因于直接UVB介导损伤的黑色素瘤基因中热点激活突变的第一个例子，为紫外线诱变在黑色素瘤发病机制中的作用提供了确凿证据。

讨论

我们在这里描述了一个基于排列的框架（可在http://www.broadinstitute.org/cancer/cga/InVEx)它利用基因座中的内含子和UTR序列来控制基因特定的基础突变率，这是一个概念上的进步，代表了先前工作的一个自然但重要的进化。开拓性的研究使人们越来越认识到可变区域基础突变率的混杂效应，促使人们进行细化，例如基于同义突变的基因特异性基础突变率计算，基于表达水平的基因组合，以校正表达和突变率之间的相关性，和基因内置换测试评估突变残基的位置聚类和进化保守性(Chapman等人，2011年;丁等人，2008;Greenman等人，2006年;Kan等人，2010年;Lohr等人，2012年)。我们预计，未来的研究将解释基础突变率中的基因内变异，并且有足够的数据，最终可以推断出基础突变率。还需要考虑局部速率改变事件，例如最近报道的体细胞重排提高了局部突变率(Nik-Zainal等人，2012年)。我们的结果应该促使完善标准外显子捕获诱饵集，明确靶向一部分内含子/UTR片段，用于基础突变率建模。由于全基因组序列数据完全涵盖内含子和UTR，我们的方法可以更加稳健，提供更大的统计能力。

虽然我们已经使用PolyPhen-2评估了基因功能突变负担的重要性(Adzhubei等人，2010年)在本研究中（以及LoF突变负担），其他突变评分算法(库珀和申杜尔，2011年)可能也被证明是有用的。队列规模的增加（将通过癌症基因组图谱[TCGA]和其他大规模的研究逐步显现）将为评估更天真的“非沉默突变负担”的重要性提供足够的力量，而这并不取决于功能预测得分。更广泛地说，这种建模特定于地方的基础突变率的方法结合可选的功能权重，可以改进对预测将经历正选择的非外源性基因组区域（如保守调控域）中驱动突变的识别。

虽然本文确定的新黑色素瘤基因的突变发生率相对较低，但其重要性超出了黑色素瘤，跨肿瘤相关性和蛋白家族复发强调了这一点。例如，RAC1系统据报道，一头颈部肿瘤中存在P29S突变(Stransky等人，2011年)还有一个乳腺肿瘤(福布斯等，2011年); 此外，在黑色素瘤中观察到其他Rho家族成员的P29同源突变(图3)。在我们的队列中出现已知的单一激活突变，如HRAS，GNA11型和配套元件，预测更大规模的测序研究将发现更多的黑色素瘤基因，从而重申在统计数据支持的人类癌症组中系统重测序的重要性。

最后，虽然阳光照射已被证明是黑色素瘤的主要危险因素(Garibyan和Fisher，2010年)，令人困惑的是，最普遍的UVB辐射诱导的遗传变化——胞嘧啶向胸腺嘧啶的转变，占核苷酸替代的70%以上——尚未被证明是已知黑色素瘤致癌突变的分子基础，包括BRAF公司V600E和美国国家科学院Q61L/R。在RAC1型，STK19型和PPP6C型由C>T转变产生的结果提供了缺失的基因组证据，将UVB突变机制与这种恶性肿瘤联系起来。

实验程序

临床样本

本研究中分析的所有黑色素瘤样本均根据机构审查委员会批准的方案（MIT/COUHES#110700457）进行收集和测序。使用DNeasy Tissue Kit或QIAmp DNA Mini Kit（加利福尼亚州巴伦西亚市齐亚根）从组织中提取基因组DNA。使用Puregene DNA纯化试剂盒（明尼苏达州明尼阿波利斯市Gentra Systems）从短期培养物中提取基因组DNA。所有DNA样本均接受质量评估。

DNA文库的制备、全基因组测序和组装

外显子捕获和文库构建如(Gnirke等人，2009年)，适用于生产规模外显子组捕获。在Illumina HiSeq 2000机器上对文库进行测序，产生2×76 bp的配对读码。从Illumina管道获得的测序数据由Picard管道处理(http://picard.sourceforge.net网站/).

高密度SNP阵列

将DNA样本与Affymetrix SNP Array 6.0全基因组人类SNP微阵列（Affymmetrix，Santa Clara，CA）杂交，并如前所述测定染色体拷贝数片段(癌症基因组图谱研究网络，2008年)。如果长度大于0.6的绝对值≤5Mb的片段与该基因相交，则确定该基因为局部扩增/缺失。使用GISTIC识别出显著的重复扩增和缺失(Beroukhim等人，2007年).

外显子质量评估

从分析中删除具有非正常拷贝数特征的样本和具有异常拷贝数特征（copy number profiles）的正常样本。交叉检查肿瘤/正常对中的每条车道，使其具有与该对中的其他车道相同的SNP指纹；分析中删除了非匹配车道。使用ContEst估计交叉污染(Cibulskis等人，2011年) (表S1B)。污染超过10%的样品被排除在进一步考虑之外。

体细胞替代物和指数的识别

使用MuTect识别体细胞碱基对替换(http://www.broadinstitute.org/cancer/cga/MuTect)使用Indelocator鉴定体细胞小indels(http://www.broadinstitute.org/cancer/cga/Indelocator网站)，如以前的报告中所述(Stransky等人，2011年)。使用Oncotator（一种用于突变注释的综合分析脚本）对已识别的体细胞突变进行注释，以了解突变对蛋白质产品的影响(http://www.broadinstitute.org/cancer/cga/Oncotator网站/)。上述每个算法或脚本都是在Broad Firehose基础设施中执行的(http://www.broadinstitute.org/cancer/cga/Firehose).

假设均匀背景突变率的突变显著性

在假设背景突变率一致的情况下，使用补充资料中描述的每样本版本的MutSig进行突变显著性分析的初步尝试(Getz等人，2007年).

非沉默突变阳性选择的统计测定

对于每个至少有一个观察到的体细胞突变的基因，计算观察到的“突变负担”得分（见下文中的三个此类得分定义）。根据三核苷酸上下文，在基因的覆盖碱基对上随机排列突变，并计算随机实例的突变负荷得分。最多10个8生成随机实例并进行评分。随机实例的突变负荷分数等于或大于观察到的负荷定义为第页-值。

（1） 功能性突变负担：用PolyPhen-2 p值对突变进行加权(Adzhubei等人，2010年)。COSMIC中的帧移位指数、无义和剪接位点突变以及核苷酸突变≥5倍的突变(福布斯等，2011年)被赋予1的权重。在每个样本中识别出重量最大的突变，这些“最大重量”的总和被定义为功能性突变负担。（2） 同义突变负担：同义突变≥1的样本数。（3） 功能丧失（LoF）突变负担：无义突变、移码指数或剪接位点突变≥1的样本数。（为了提高统计能力，我们评估了超过2的过量LoF突变负担）。

该方法的源代码称为InVEx（“内含子与外显子”），可在http://www.broadinstitute.org/cancer/cga/InVEx.

突变验证和扩展

如前所述，对黑色素瘤样本和伴随的正常组织进行质谱基因分型（Sequenom）(Stransky等人，2011年;Thomas等人，2007年)。MassEXTEND®引物是使用Sequenom，Inc.的MassARRAY®分析设计软件设计的，以产生等位基因特异性产品。

同调建模与结构分析

结构分析比较了GDP-结合apo-RAC1和GTP-结合RAC1的野生型和P29S突变体与PAK1-Cdc42/Rac交互结合（CRIB）结构域的复合物。RAC1的结晶模型适用于GTP-结合态（1MH1）和GDP-RAC1的特定锌结合三聚体版本（2P2L）。然而，RAC3存在GTP和PAK1 CRIB结合的晶体结构（2QME，晶体结构中包含的所有残基与RAC1的97%相同；图S4)。GDP-RAC3也已结晶（2G0N）。RAC1和RAC3结构高度相似，GDP和GTP绑定形式的均方根距离（rmsd）分别为1.1º和0.9º。尽管如此，为了避免GDP-RAC1结构的Zn结合三聚构象导致的局部结构畸变的影响，基于GDP-RAC3建立了RAC1的同源模型，并将该模型与GTP-RAC1与PAK1 CRIB结合的同源模型进行了比较(Arnold等人，2006年).

细胞培养

人类原代黑素细胞（pMEL/hTERT/CDK4（R24C）/p53DD）表达BRAF（V600E）（pMEL-BRAF）或NRAS（G12D）(Garraway等人，2005年;Scott等人，2011年)。HEK 293FT细胞来自纽约州格兰德岛的生命科技公司。所有细胞均保存在Dulbecco改良的Eagle's培养基（Cellgro，Manassas，VA）中，置于37°C的10%热灭活胎牛血清（FBS）中，加湿5%CO2大气。

质粒

pcDNA3-EGFP-RAC1（野生型、T17N和Q61L）由Klaus Hahn从Addgene（质粒13719、13720和13721）获得(Kraynov等人，2000年)。pcDNA3-EGFP-RAC1 P29S是根据制造商的指示，使用QuickChange Lightning Site-Directed Mutagenesis（加利福尼亚州圣克拉拉市斯特拉赫尼）生成的。

RAC1活化分析

用Lipofectamine 2000试剂（Invitrogen）瞬时转染等量的pcDNA3-EGFP-RAC1质粒，并根据制造商的方案（Cell Biolabs，Inc.）进行转染后48小时的RAC1活化分析。简言之，在10 cm组织培养板中溶解单层细胞，通过离心清除细胞裂解液，并通过DC蛋白测定（BioRad）测定蛋白质浓度。将裂解液稀释至等浓度，并使用含有p21-活化蛋白激酶1（PAK1）的p21-结合域（PBD）的GST融合蛋白与谷胱甘肽琼脂糖珠偶联1h，用等量的蛋白质进行RAC1下拉分析。根据制造商的说明以及西方的分析，在存在外源性GDP/GTPγS的情况下进行拉减。

​

亮点

  • 121对黑色素瘤/正常人外显子测序的驱动基因突变情况
  • 在高突变率环境中检测驾驶员突变基因的方法
  • 第6页，RAC1系统，SNX31系列，节气门执行器控制1，STK19型和ARID2公司是显著突变的黑色素瘤基因
  • 紫外线诱变的特征光谱占发现的驾驶员突变的46%

补充材料

01

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02

单击此处查看。（440万，xlsx）

03

单击此处查看。（54M，文本）

图S1

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图S2

单击此处查看。（3.1M，pdf格式）

图S4

单击此处查看。（260万tif）

图S6

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致谢

我们感谢L.Ambrogio和E.Bevilacuqa对测序数据生产的管理。我们感谢A.McKenna、L.Zou、S.L.Carter、P.Stojanov、P.Lin、L.Lichtenstein和Broad Cancer Genome Analysis小组的其他成员。我们感谢C.Z.Zhang和C.Johannessen的有益讨论，以及Garraway和Chin实验室的成员。这项工作得到了NHGRI大规模测序项目的支持；向Broad Institute（PI，E.S.L.）授予U54 HG003067；黑色素瘤研究联盟；德克萨斯大学MD安德森癌症中心黑色素瘤卓越研究和黑色素瘤信息学、组织资源和病理学专业项目（核心资助P50 CA93459）（PI，J.E.G.，M.A.D.）；以及NCI支持拨款（CA-16672）。I.R.W.是加拿大卫生研究院奖学金的获得者。J.-P.T.由瑞士国家科学基金会（PASMP3_134379/1）资助。J.E.L.由G.Harold和Leila Y.Mathers慈善基金会支持。S.N.W.得到了FWF-奥地利科学基金（L590-B12）的支持。L.A.G.得到了美国国立卫生研究院新创新者奖（DP2OD002750）、NCI（R33CA126674）、黑色素瘤研究联盟和斯塔尔癌症联合会的支持。L.C.得到了NCI RO1（R01 CA093947）、TCGA GDAC（U24 CA143845）和黑色素瘤研究联盟的支持。L.C.是黑色素瘤研究迈尔斯坦创新奖的获得者，也是CPRIT学者。N.W.是基金会医学的顾问和股东。L.A.G.是基金会医学的股东和顾问，是诺华和千禧/武田的顾问，也是诺华赠款的接受者。

脚注

加入人数

本文报道的外显子序列数据的dbGaP登录号为phs000452.v1.p1。

补充信息

补充信息包括扩展实验程序、四张图和十三张表。

出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。

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