HPV16 E6癌蛋白引起延长的受体蛋白酪氨酸激酶信号传导并增强磷酸化受体物种的内化

在表达HPV16 E6的HFK中激活RPTK效应器信号

据报道，HPV16 E6可激活mTORC1[16],[17]E6介导的mTORC1激活导致带帽mRNA翻译增加[16]HPV16 E6也被报道激活FAK信号，这也与RPTK激活有关[26],[27]鉴于我们分别在Y1150/51和Y1135/36检测到与RAS/MAPK信号启动相关的EGFR Y1068和Y1173磷酸化延长，以及INSRβ/IGFRβ磷酸化，我们评估了在EGF戒断条件下MAPK的活性。我们观察到，在表达HPV16 E6的HFK中，MAPK效应器ERK1/2的磷酸化和活化时间延长，并且ERK底物RSK的磷酸化水平在表达HPV66 E6 HFK的HFK细胞中高于对照细胞(图2A). 除mTORC1外，RAS/MAPK信号还可以通过RSK介导的丝氨酸残基235和236上核糖体蛋白S6的磷酸化激活cap依赖性翻译（S6 S235/36）。为了确定HPV16 E6是否需要MAPK信号来激活cap依赖性翻译，我们使用双顺反子荧光素酶报告子分析[28]用报告构建物和表达HPV16 E6的载体或空载体瞬时转染U2OS人骨肉瘤细胞，并用MEK抑制剂U0126抑制MAPK活性。我们发现对照组和E6表达细胞中的cap依赖性翻译对MEK抑制敏感(图2B，灰色条）。我们之前报道过，HPV16 E6至少部分通过mTORC1激活cap依赖性翻译[16]为了确定MAPK和mTORC1激活的相对贡献，我们用雷帕霉素和U0126共同处理细胞，以同时抑制mTORC2和MAPK。与对照细胞类似，用雷帕霉素联合处理HPV16 E6表达细胞会导致cap依赖性翻译的额外减少(图2B，黑色条；P（P）<0.05). Western blot表明U0126治疗有效抑制MEK信号(图S1).

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图2

RPTK下游的信号通路在HPV16 E6表达的HFK中被激活。

(A类)通过分析HPV16 E6（E6）或LSXN对照载体（C）稳定表达的HFK中的ERK1/2和RSK磷酸化，并通过PBS饥饿30分钟经历营养物戒断，对MAPK信号传导进行蛋白质印迹分析。与肌动蛋白相关的定量显示在每个面板下方。显示了总共四个独立实验的代表性实验。(B类)HPV16 E6介导的cap依赖性翻译增加依赖于MEK和mTORC1信号。用pFR_CrPV_xb和指示质粒转染U2OS细胞，并在转染后48小时处理萤火虫和Renilla荧光素酶活性。在裂解前20小时，用DMSO、10µM U0126（MEK抑制剂）或10µM U0126和100 nM雷帕霉素（mTORC1抑制剂）的组合处理细胞。萤火虫和Renilla荧光素酶在二甲基亚砜处理的细胞中被归一化为水平，并表现为归一化萤火虫相对于归一化Renila活性的倍数变化。条形图表示三个独立实验的平均值和标准偏差，每个实验一式三份；星号表示统计显著性(P（P）<0.05).

EGFR或INSR/IGFR抑制HPV16 E6表达的HFK后mTORC1活性降低

为了确定RPTK活性对HPV16 E6介导的mTORC1激活是否必要，我们用EGFR抑制剂Gefitinib处理HPV16 E6表达的HFK并控制生长在正常培养基（KSFM）中的HFK，并分析mTORC1-底物S6激酶（S6K）的磷酸化状态。正如预测的那样，我们观察到对照组和表达HPV16 E6的HFK中EGFR Y1068自动磷酸化迅速减少(图3A). 用吉非替尼抑制EGFR也部分抑制S6K磷酸化。OSI-906是一种INSRβ和IGFRβ的双激酶抑制剂，它的治疗使对照组和表达HPV16 E6的HFK中的INSR？和IGFR？快速去磷酸化(图3B). 在OSI-906治疗后的短时间内，我们再次观察到对照细胞和HPV16 E6表达细胞中S6K磷酸化增加。这可能代表代偿性S6K磷酸化，可能通过EGFR/PI3K/AKT信号传导，与一项研究报告的MAPK抑制后AKT激活一致[29].

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图3

RPTK抑制减少HPV16 E6表达的HFK中mTORC1的激活。

(A类)Gefitinib抑制EGFR后，稳定表达HPV16 E6（E6）或pLentiN6.3控制载体（C）的HFK中EGFR和mTORC1激活（S6K）的Western blot分析。用DMSO或1µM吉非替尼处理细胞24小时。肌动蛋白印迹显示为加载控件。这里显示的实验是三个独立实验中的一个。(B类)用OSI-906对INSRβ/IGFRβ进行化学抑制后，稳定表达HPV16 E6（E6）或pLentiN6.3控制载体（C）的HFK中INSR？/IGFR？和mTORC1激活（S6K）的Western blot分析。这些数据代表两个独立实验之一。用DMSO或150 nM OSI-906处理细胞6小时。肌动蛋白印迹显示为加载控制；“肌动蛋白1”对应于带有磷酸特异性抗体的印迹，“肌动素2”对应于其他印迹。

这些结果表明，在正常生长条件下，EGFR和INSRβ/IGFRβRPTKs分别有助于HPV16 E6表达的HFKs中mTORC1的激活。

表达HPV16 E6的HFK中活化受体物种的内化增加

由于HPV16 E6表达细胞在退出生长因子后表现出延长的RPTK和AKT激活，我们评估了激活的EGFR、INSRβ和IGFRβ的内化。HFK在PBS中处于饥饿状态，细胞表面蛋白与生物素结合。然后将细胞在缺乏EGF和其他补充剂的KSFM中培养180分钟，以促进配体非依赖性内化。然后用谷胱甘肽处理细胞并裂解以测量内化受体。作为对照，在不刺激或随后谷胱甘肽减少的情况下，通过直接裂解细胞来测量总细胞表面受体。用链霉亲和素结合珠亲和纯化分离生物素结合蛋白，并用磷酸特异性抗体检测活性受体种类。这些实验表明，HPV16 E6表达细胞在缺乏生长因子的情况下，活性磷酸化EGFR以及INSRβ和/或IGFRβ的内化增加(图4A).

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图4

在表达HPV16 E6的HFK中，活化受体物种的内化和降解增加。

(A类)受体内化后EGFR和INSRβ/IGFRβ的Western blot分析。用PBS清洗细胞后，将其与生物素二硫化物N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯在4°C下孵育40分钟，然后用NH灭活生物素试剂₄4°C下Cl保持10分钟。然后用缺乏生长因子和补充剂的KSFM在37°C下刺激细胞3小时。在进行配体非依赖性刺激后，细胞在不还原的情况下进行裂解以测量表面结合受体（S），或还原并裂解以测量配体非独立内化（I），内化分析按照材料和方法。5µg样品中EGFR和INSRβ/IGFRβ的水平，占内化测定的2%，以及肌动蛋白，如左图所示（输入），所得的链亲和素亲和纯化（AP）如右图所示。定量表示磷酸化受体与对照载体（C）内化磷酸化受体归一化总受体的比率，如下所示。这个实验是两个独立实验之一。(B类)隔夜饥饿和Alexa 647标记的EGF（EGF）刺激15分钟后，稳定表达HPV16 E6（E6）或pLentiN6.3控制载体（C）的HFK中EGF与内体标记物EEA1共同染色的免疫荧光分析。细胞用Hoechst染色以观察细胞核。比例尺代表40µm。(C类)面板B中EGF阳性早期内体数量的量化。条形图表示四个独立实验中每个细胞中EGF阴性早期内体的平均数量。共评估115个细胞。误差条表示标准偏差；星号表示统计显著性(P（P） = 0.0017).

为了独立验证HPV16 E6在不同实验条件下通过不同方法增加EGFR内化，我们用Alexa-647 EGF刺激EGF缺乏的HFK，并在15分钟后通过荧光显微镜评估EGF与早期内体标记物自身抗原1（EEA1）的共定位。与匹配的载体转导的HFKs相比，表达HPV16 E6的HKFs具有增加的EGF阳性早期内体数量（对照=3.40±0.54；HPV16 E6=5.67±0.65 EGF/EEA1阳性囊泡，P（P） = 0.0017) (图4B和C).

这些结果表明，HPV16 E6介导的RPTK信号和下游效应级联的激活与激活受体的内化增加相关。

信号衔接蛋白GRB2对HPV16 E6介导的EGFR内化和mTORC1激活至关重要

信号适配器蛋白GRB2与在Y1068磷酸化的EGFR相关，并激活PI3K和MAPK信号。此外，GRB2也被认为是EGFR内部化的关键中介。GRB2可以与动态蛋白相互作用，动态蛋白是一种GTPase，在内吞过程中将受体纳入囊泡中非常重要[30].

为了确定GRB2对HPV16 E6介导的EGFR内化是否重要，我们通过RNA干扰耗尽GRB2，并在15分钟后通过荧光显微镜评估EGF与EEA1的共定位。类似图4B和C与对照HFK相比，转染siCtrl的HPV16 E6表达原代HFK的EGF阳性早期内体数量增加（对照siCtrl=5.29±0.23；HPV16 E6 siCtrl=8.37±1.61 EGF/EEA1阳性囊泡/细胞，P（P） = 0.03) (图5A和B). 然而，GRB2缺失使表达HFK的HPV16 E6中EGF/EEA1阳性小泡的数量增加到与对照细胞相似的水平（对照siGRB2=5.65±0.45；HPV16 E6 siGRB2=5.96±0.59 EGF/EEA1阳性囊泡/细胞）(图5A和B). 有趣的是，对照HFK中GRB2的缺失对每个细胞中EGF阳性EEA1小泡的数量没有影响。

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图5

信号衔接蛋白GRB2对HPV16 E6介导的EGFR内化和mTORC1激活至关重要。

(A类)在隔夜饥饿和随后用Alexa 647标记的EGF（EGF）刺激15分钟后，对GRB2缺失（siGRB2）或对照siRNA转染（siCtrl）HFK中稳定表达HPV16 E6（E6）或pLentiN6.3控制载体（C）的EGF与内体标记物EEA1共同染色的EGF免疫荧光分析。细胞用Hoechst染色以观察细胞核。比例尺表示20µm。(B类)从面板A中量化EGF阳性早期内体的数量。条形图表示EGF阳性的早期内体/细胞的平均数量，每种情况下总计至少95个分析细胞进行三次计数。误差条表示标准偏差；星号表示统计显著性(P（P） = 0.03). (C类)在稳定表达HPV16 E6（E6）或对照载体（C）的GRB2缺失（siGRB2）或对照siRNA转染（siCtrl）HFK人群中对S6K T389进行Western blot分析。细胞在裂解前48小时转染相应的siRNA。肌动蛋白印迹显示为负载控制，与肌动蛋白相关的定量显示在每个面板下方。面板C显示了从四个独立实验中选取的代表性实验。

接下来，我们利用GRB2缺失来确定GRB2功能对HPV16 E6介导的mTORC1激活是否重要。GRB2缺失显著降低了表达HFK的HPV16 E6中mTORC1替代标记S6K的磷酸化。然而，有趣的是，当对照HFK中GRB2耗尽时，S6K磷酸化没有检测到降低(图5C).

这些结果表明，GRB2需要增强EGFR内化，并可能使来自HPV16 E6表达细胞内化受体的信号转导永久化。此外，尽管HPV16 E6的表达导致多个酪氨酸残基的EGFR磷酸化增加，因此预计会激活多个下游信号通路，但通过GRB2的信号传导对HPV16 E6介导的mTORC1激活至关重要。

细胞系和培养

293T和U2OS细胞（ATCC）保存在Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）（Invitrogen）中，补充10%胎牛血清（FBS）、50 U/ml青霉素和50µg/ml链霉素。如前所述，从匿名新生儿包皮环切中分离出原代人包皮角质形成细胞[58]在补充有人重组表皮生长因子1–53、牛垂体提取物（Invitrogen）、50 U/ml青霉素和50µg/ml链霉素、20µg/ml庆大霉素和1µg/m两性霉素B的角质形成细胞无血清培养基（KSFM）中保存。Klingelhutz（美国爱荷华州）。表达原代和永生化HFK的HPV癌基因是通过逆转录病毒感染相应的pLXSN基载体或慢病毒感染相应pLenti6.3N基载体，然后分别用250µg/ml G418或3µg/ml杀鼠素进行选择而产生的。所有对HFK原代群体进行的实验都是在供体和传代匹配的HFK群体传代少于10次的情况下进行的。对于营养剥夺分析，HFK生长到90%的汇合处，在这一点上用磷酸盐缓冲盐（PBS）冲洗两次，然后在分析之前在PBS中培养15分钟或在缺乏EGF的KSFM中培养2小时。HFK生长在聚-D-赖氨酸涂层板（BD Biosciences）上，用于PBS饥饿实验。

蛋白质印迹和抗体

除非另有说明，否则通过在ML缓冲液（300 mM NaCl，0.5%Nonide P-40[NP-40]，20 mM Tris-HCl[pH8.0]，1 mM EDTA）中培养细胞来制备蛋白裂解物，每25 ML裂解缓冲液中添加一片完整的无EDTA蛋白酶抑制剂鸡尾酒片（Roche）和一片PhosSTOP磷酸酶抑制剂鸡尾杯片（Rosche）每7.5毫升裂解缓冲液加冰块20分钟。通过将细胞在RIPA缓冲液（150 mM NaCl，1%NP-40，0.5%脱氧胆酸[DOC]，0.1%SDS，50 mM Tris-HCl[pH7.5]）中培养20分钟，按照上述ML缓冲液补充50 mM过钒酸盐，制备用于全局磷酸酪氨酸蛋白印迹的细胞裂解物。然后刮去细胞，并通过在4°C下以16110×g离心10分钟来清除裂解物。使用Bradford方法（Bio-Rad）测定蛋白质浓度。蛋白质通过SDS-PAGE分离并电转移到聚偏二氟乙烯膜（Immobilon-P；Millipore）上。除非另有说明，否则在TBST（137 mM NaCl，2.7 mM KCl，25 mM Tris[pH 7.4]，0.1%吐温20）中的5%脱脂干乳中封闭膜，并用适当的抗体进行探测。除非另有规定，否则以下抗体以1∶1000稀释度使用：β-肌动蛋白（1501；Chemicon）、p53（Ab-6，Calbiochem）、GRB2（ab86713，Abcam）、Flag（4µg/ml，F3165，Sigma）、抗磷酸酪氨酸（05-1050X，Millipore）、EGFR（4267）、EGFRY992（2235）、EGFR Y1068（3777）、EGFT Y1173（4407）、S6K（9202）、S6K-T389（9206）、RSK（9333）、，RSK S380（9335）、ERK1/2（9102）、ERK1/2 T202/Y204（4370）、IGF-1Rβ（3027）、IGF1RβY1135/36/INSRβY1150/51（3024）、PI3K p110α（4249）、PI3G p110β（3011）、PI3Class III（3358）、PTEN（9188），均来自细胞信号技术。与辣根过氧化物酶结合的次级抗鼠抗体和抗兔抗体分别以1∶10000或1∶15000的稀释度使用。蛋白质通过增强化学发光（Perkin Elmer，Millipore）进行可视化，并暴露在柯达BioMax XAR胶片上，或通过配备柯达成像软件4.0版的柯达成像站4000R或配备柯达图像软件4.0版Carestream Gel Logic 4000 pro进行电子采集和定量。

受体内化分析

将初级HFK接种到15 cm培养皿中，当细胞达到90%融合时进行内化和降解试验。细胞在冰镇PBS-CM（PBS，0.1 mM CaCl）中清洗两次₂，1 mM氯化镁₂)然后在4°C下摇晃40分钟，在5 ml 0.5 mg/ml生物素二硫化物N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯（磺基NHS-SS-生物素，Pierce）中培养。然后将细胞在PBS-CM中再洗涤两次，并与含有50mM NH的PBS一起孵育₄氯化10分钟，在4°C下摇晃，然后在PBS-CM中洗涤两次。将不含任何生长因子和补充剂的KSFM添加到一个平板中，以研究37°C下180分钟内配体非依赖性受体的内化。在用缺乏生长因子和补充剂的KSFM刺激180分钟后，用PBS-CM洗涤细胞两次，并通过用谷胱甘肽缓冲液（50mM还原型谷胱甘肽、90mM NaCl、1mM MgCl₂，0.1 mM氯化钙₂，60 mM NaOH）在4°C下摇摆。然后用PBS-CM清洗细胞两次，然后用含有50 mM碘乙酰胺（PBS-IAA）的PBS在4°C下摇晃15分钟。通过直接裂解一个平板而不刺激或随后的谷胱甘肽还原来测量总细胞表面受体。然后，通过用ID裂解缓冲液（200 mM NaCl，75 mM Tris[pH7.5]，2.5 mM EDTA，2.5 mM-EGTA，1.5%Triton X-100，0.75%NP40，0.1%SDS）培养细胞来制备裂解物，补充一片完整的EDTA蛋白酶抑制剂鸡尾酒片（Roche）和一片PhosStop磷酸酶抑制剂鸡尾杯片（Rosche）。通过预先用40µl Pansorbin（Calbiochem）清除裂解液45分钟来进行受体内化分析，然后通过16110×g在4°C下离心10分钟来去除Pansorbine。然后将预先清除的裂解液与40µl洗涤过的链霉亲和素琼脂糖树脂（Thermo Scientific）孵育16小时，在4°C下摇晃，然后在ID缓冲液中洗涤珠子四次，添加2×样品缓冲液，用SDS-PAGE分离蛋白质并将其电转移到PVDF上进行Western blotting。

免疫荧光显微镜

为了进行免疫荧光分析，在固定前48小时将细胞接种在玻璃盖玻片上。用PBS洗涤细胞两次，并在37°C下用不含任何生长因子或补充剂的KSFM培养16小时。然后用含有150µg/ml Alexa Fluor 647 EGF（分子探针）的KSFM刺激细胞，用4%多聚甲醛固定在PBS中，用PBS洗涤，并在室温下用0.1%Triton-X100/1 mM甘氨酸渗透到PBS中10分钟。渗透后，用PBS清洗细胞，先用5%山羊血清在4℃下封闭细胞1小时，然后用2%牛血清在室温下封闭细胞10分钟。细胞与抗EEA1（610457，BD）在室温下孵育1小时。二级抗体为山羊抗小鼠Alexa Fluor 488（分子探针），并以1∶1000的稀释度使用。细胞核用Hoechst 33258染色。使用配备有滨松C8484-03相机的尼康80i立式显微镜采集图像，并使用MetaMorph 7软件进行处理。

伤口愈合试验

将原代或永生化HFK接种到6厘米的培养皿中，当细胞达到90%的融合时，用p200移液管尖端将伤口导入单层。在损伤单层细胞之前，用PBS冲洗细胞两次，在负EGF条件下用缺乏EGF的KSFM替换培养基，在正EGF条件中用完整的KSFM，在适用时加上抑制剂。如有指示，添加8µg/ml丝裂霉素C可抑制细胞增殖。然后在37°C下培养细胞，并使用配备Axiovision Release 4.4 SP2软件包的蔡司Axiover 200光学显微镜在一段时间内拍摄受伤单层的图像。使用image J软件（NIH）计算每个结果图像的伤口表面积。在t=0时，测定伤口相对于样品的表面积。总共进行了至少3个独立实验，并使用Student’s T检验计算统计学显著性。

Transwell迁移分析

对原代HFK进行胰蛋白酶化，并在KSFM减去EGF中重新悬浮。将30000个HFK重新悬浮在150µl KSFM减去EGF的溶液中，并放置在用50µl KSFM减去EGF预润湿的跨井渗透支撑膜插件（8.0µM，Costar产品3422）的上室中。用600µl KSFM减去EGF填充底部室，并在37°C下培养细胞30分钟或1小时。然后从跨孔膜的上腔刮取细胞，用100%甲醇固定膜30分钟，并用结晶紫染色。在每个实验中，在三个不同的视野中对留在膜下侧的细胞进行计数。共进行了三个独立实验，并使用Student’s T检验计算了统计显著性。

转染和荧光素酶分析

如前所述，转染U2OS细胞并进行荧光素酶分析[16]通过计算萤火虫荧光素酶活性与Renilla荧光素酶活性的比值，与对照载体转染细胞相比，确定活性的倍数变化。进行了三个独立实验，并使用Student的T检验计算统计显著性。

我们感谢Al Klingelhutz（爱荷华州大学）对hTERT永生人类包皮角质形成细胞的慷慨捐赠，感谢Sheila Thomas、Nick Dyson、Fred Wang、Tom Roberts、James DeCaprio和John Blenis的有益讨论和技术建议，毛大琴（Daqin Mao）帮助进行了transwell分析，玛格丽特·麦克劳克林·德鲁宾（Margaret McLaughlin-Drubin）对手稿进行了批判性审查。我们感谢哈佛医学院尼康成像中心在光学显微镜方面的帮助。