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公共科学图书馆-遗传学。2013年3月；9（3）：e1003312。
2013年3月14日在线发布。 数字对象标识：10.1371/journal.pgen.1003312
预防性维修识别码：项目经理3597502
PMID：23516369

CRISPR介导免疫的噬菌体和细菌种群及其进化动力学

布鲁斯·莱文,1,* 西尔万·莫尼奥,2 玛丽·布什曼,三和鲁道夫·巴兰古4
迪亚迈德·休斯，编辑器
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

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补充资料

摘要

簇状规则间隔短回文重复序列（CRISPR）及其相关基因(中国科学院)，形成CRISPR–中国科学院适应性免疫系统，能够抵抗细菌和古菌中的病毒和质粒。在这里，我们使用数学模型、种群动力学实验和DNA序列分析来研究模型CRISPR中宿主与噬菌体的相互作用中国科学院系统，嗜热链球菌DGCC7710及其毒力噬菌体2972。在分子水平上，噬菌体免疫突变细菌（BIMs）和CRISPR–逃逸突变噬菌体（CEMs）本研究获得的结果与该适应性免疫系统迭代模型的预期结果一致：通过添加新间隔物产生耐药性，通过匹配序列或侧翼基序的突变避免噬菌体产生耐药性。虽然CRISPR BIM很容易隔离，CEM生成率很高（频率超过10−6)，我们的种群研究表明，噬菌体-宿主相互作用的动力学以及BIM-CEM军备竞赛的建立，比现有的噬菌体感染和CRISPR假设预测的要复杂得多–cas免疫。未预料到的观察结果包括：（i）通过获得一个（但不是两个）间隔物，噬菌体侵入耐药的BIM种群；（ii）尽管存在高密度噬菌体，但敏感细菌的存活率；以及（iii）由于在含有野生型细菌和噬菌体的人群中即使两个间隔区BIM也无法建立，导致噬菌体群落的维持。我们将（i）归因于单间隔BIM的不完全电阻。基于其他建模和实验的结果，我们假设（ii）和（iii）可归因于噬菌体感染相关酶或其他化合物的产生，这些酶或化合物可诱导敏感细菌的表型噬菌体耐药性并杀死耐药BIM。我们提供证据支持这些假设，并讨论这些结果对细菌和噬菌体生态学和（共同）进化的影响。

作者摘要

古生菌和细菌基因组的CRISPR区域在这些微生物及其病毒的生态学和（共同）进化中起着重要作用的证据是压倒性的：（i）这些原核生物的间隔区（该区域重复序列之间的可变DNA序列为26–72 bp）与它们群落中的病毒DNA同源；（ii）在实验上，病毒DNA间隔区的获得和整合可以保护这些生物体免受这些病毒的后续感染；（iii）实验上，病毒通过同源原间隔区或原间隔区相邻基序（PAM）的突变来逃避这种免疫。CRISPR在这一生态和进化中所起作用的性质和程度尚不清楚。在这里，我们使用数学模型，用嗜热链球菌以及噬菌体2972和DNA序列分析，以探讨CRISPR的作用–cas对细菌及其病毒的生态和（共同）进化的免疫力。这项研究的结果表明，CRISPR对细菌和噬菌体生态学的贡献更为温和和有限，并且与基于噬菌体感染规范观点和CRISRP的模型相比，这些生物体之间的CRISPR-介导的共同进化军备竞赛的条件更为严格–cas免疫。

介绍

2007年和2008年的实验证明，大量存在于绝大多数古生菌和近一半细菌基因组中的簇状规则间隔短回文重复序列可以作为适应性免疫系统的一部分（CRISPR–中国科学院)保护这些原核生物免受裂解噬菌体的侵害[1]和结合质粒[2]提出了许多有趣的问题，并激发了大量研究。据PubMed统计，2007年至2012年间，标题和/或正文中带有缩写词CRISPR的文章数量每20个月翻一番。可以理解，这些文章中的大多数都是关于基因、生物化学和分子机制的报告或评论，通过这些机制（i）CRISPR–中国科学院系统从感染噬菌体的DNA中获取26–72个碱基对序列（间隔），生成噬菌体不敏感突变体（BIM），或从入侵质粒中获取DNA，形成质粒干扰突变体（PIM）；（ii）这些间隔物编码的小RNA可以阻止噬菌体和质粒随后的感染，而噬菌体的DNA序列与这些间隔物（原间隔物）中的DNA序列相对应[3],[4],[5],[6]; （iii）噬菌体可以通过修改原间隔区或原间隔区邻接基序（PAM）的DNA序列来逃避这种抗性并生成CRISPR逃逸突变体（CEM）[3],[7],[8],[9]; （iv）Cas蛋白参与这些过程[1],[8],[9]; 以及（v）CRISPR的存在、分布和遗传多样性——中国科学院古菌和细菌的系统产生了[10],[11],[12]

其中一些研究致力于CRISPR和CRISPR-的实际应用中国科学院系统。早在认识到CRISPR在这些微生物中的免疫学作用之前，这些回文重复序列的数量差异就已经被用作病原菌遗传（分子）流行病学和法医学研究的标记[13],[14],[15],[16]根据标准分型程序（如血清分型、多位点序列分型和脉冲场凝胶电泳）分类为相同的分离物，其CRISPR区域可能不同，尤其是间隔序列不同[17],[18]。基因和基因簇，由质粒、噬菌体或染色体基因携带，通过水平转移获得，编码许多病原菌的毒力和抗生素耐药性。正如人们可能预期的那样，至少某些种类的病原菌菌株缺乏功能性CRISPR——中国科学院与携带这些系统的系统相比，这些系统更有可能产生毒力并对抗生素产生耐药性[19]许多生物技术和工业过程都依赖于使用易受噬菌体感染的细菌，因此存在生产中断、低质量产品和经济损失的风险。CRISPR可以-中国科学院利用这些系统对抗病原菌的抗生素耐药性和毒力和/或防止工业重要细菌的噬菌体污染（8）？

理解CRISPR的这些实际意义和潜在应用至关重要——中国科学院系统是携带这些适应性免疫系统的细菌以及感染它们的噬菌体和质粒的细菌的种群和进化动力学。在实验证明CRISPR是适应性免疫系统的一部分并激发了这些实验之前，观察到来自自然群落的细菌和古菌的CRISRP区域的间隔序列与它们群落中病毒基因组的序列相同[15],[20],[21]这些以及最近对细菌、古菌及其病毒的研究[10],[11],[12],[22]和微生物的宏基因组研究[23]，有力地支持了CRISPR——中国科学院系统在这些生物在自然群落中的种群动态和共同进化中发挥着积极的作用。然而，从这些调查中可以得出的推断是有限的。它们几乎没有提供有关CRISPR性质和贡献的必要定量信息——中国科学院这些动态和共同进化及其在决定其社区结构中的重要作用。

使用数学模型和计算机模拟的研究表明，带有CRISPR的细菌-中国科学院系统可以入侵噬菌体和没有这种免疫系统的细菌群落，也可以阻止噬菌体入侵它们的群落[24]建模研究还表明，理论上，CRISPR–中国科学院-介导的BIM-CEM共同进化军备竞赛可以在细菌和噬菌体相互作用的种群中保持相当大的多样性[25]并解释古生菌和细菌及其噬菌体自然群落的宏基因组结构中CRISPR元件的间隔区变化[26]但是，尽管这些数学模型和计算机模拟研究可能令人信服，但它们的局限性也很明显。所使用的模型基于对噬菌体感染过程和CRISPR的简化假设——中国科学院尚未在研究系统中进行正式测试的自适应免疫性。这些模型特性的计算机模拟和其他数值分析使用的参数值很少有独立的估计。

在这项研究中，我们使用了数学模型、计算机模拟、参数估计、种群动态和其他革兰氏阳性菌的微生物学实验嗜热链球菌及其毒性噬菌体2972(长尾病毒科家族）探索CRISPR的性质和贡献——中国科学院对细菌和噬菌体的种群和进化动力学的适应性免疫。这些实验的结果以及所用细菌和噬菌体的分子特征表明，定性的Lamarckian（间隔物的迭代获取）[27]这种噬菌体宿主系统满足了CRISPR介导的军备竞赛的达尔文遗传条件。BIM很容易形成，能够在这些BIM上快速生长的CEM也会快速生成。另一方面，我们的实验结果和理论分析表明，即使在定性水平上，基于噬菌体感染和CRISPR介导的耐药性的现有假设的模型也无法解释噬菌体间相互作用的种群和进化动力学嗜热链球菌和噬菌体2972。与这些模型的特性分析预期相反的发现包括：（i）由于获得了一个（但不是两个）间隔物，噬菌体侵入了抗BIM的种群；（ii）尽管存在高密度噬菌体，但大量敏感细菌的存活；以及（iii）由于在含有野生型细菌和噬菌体的种群中，即使是两个间隔区BIM也未能建立，因此维持了噬菌体群落。我们假设后两种结果可归因于噬菌体感染相关酶或其他化合物的产生，这些酶或化合物可杀死耐药的BIM，并产生表型上的噬菌体抗性“持久性”敏感细菌群。通过修改模型来解释这些化学过程，我们可以解释观察到的动力学。该扩展模型的预测得到了长期种群动态实验的支持。

结果

理论框架

概述

我们以一个基于噬菌体裂解细菌感染过程的经典观点的数学模型作为本报告的开篇[28]以及当前对CRISPR的看法——中国科学院-噬菌体感染的介导免疫[3]该模型和用于分析其特性的计算机模拟的作用是（i）评估控制CRISPR细菌噬菌体感染动力学的主要参数的贡献-中国科学院免疫系统；（ii）生成关于这些动态的可测试假设；（iii）指导测试这些假设的实验的设计；以及（iv）解释这些实验的结果。这个开放模型本质上是一个定量的稻草人。其目的不是提供这些动力学的定量精确描述，而是确定我们的实验结果与基于噬菌体感染和CRISPR规范观点的理论之间的主要定性偏差中国科学院免疫。为了分析此模型的特性，我们使用半随机模拟，使用在培养基中实验估计的参数值嗜热链球菌菌株DGCC7710和噬菌体2972。

模型

细菌和噬菌体有三个可能的目，分别有密度和名称，B类0,B类1、和B类2，以及P（P）0,P（P）1、和P（P）2(图1). 噬菌体能够吸附所有等级的细菌，但只能在指数相同或更低的状态（早期状态）的细菌上复制。例如，噬菌体P1可以吸附在B上并在B上复制0和B1并吸附到B上，但不能在B上复制2吸附在细菌上的噬菌体无法在其上复制，因此会从其种群中消失。噬菌体耐药性（BIM的产生）是通过向CRISPR基因座中添加与感染噬菌体所携带序列相对应的DNA序列（间隔物）而获得的。尽管我们意识到至少有两种活性CRISPR——中国科学院此中的系统嗜热链球菌为了简单起见，我们假设有一个独特的功能CRISPR–中国科学院系统。间隔棒累积而不损失早期的间隔棒。通过在与宿主间隔区相对应的噬菌体原间隔区中突变，噬菌体能够利用该间隔区在细菌上复制。这些CEM积累原间隔区（或PAM）突变，而不会丢失早期获得的突变，因此可以通过间隔区在细菌上复制，从而对该噬菌体的所有早期化身提供抗性。例如噬菌体P1原间隔区突变使其能够在细菌B上复制1也可以在B上复制0为了简单易行，我们假设每个序列中都有一个单一的细菌和噬菌体基因型，该基因型由间隔物的数量定义。实际上，BIM可能是通过采集许多不同的垫片生成的。我们在讨论.

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为pgen.1003312.g001.jpg
CRISPR介导的军备竞赛。

椭圆-细菌；五角体噬菌体；红色和蓝色矩形-获得的间隔；红色和蓝色圆圈，噬菌体基因组中与获得的间隔物（原间隔物）相对应的区域；恒星，变异的原间隔层产生CEM。野生型细菌和噬菌体；BIMX和CEMX分别是具有获得WT噬菌体抗性间隔物的细菌和一级CRISPR逃逸突变体（CEMX）；BIMX公司2和CEMX2、分别具有获得的CEMX抗性间隔物和二级CRISPR逃避突变体的细菌。A组：感染和噬菌体复制关系。实心黑线，噬菌体吸附和复制；破碎的红线-噬菌体吸附和损失。B组：状态变化。BIMX由WT噬菌体感染WT细胞和BIMX产生2由感染BIMX的CEMX产生。CEMX由P生产0在B上感染和复制0和CEMX2由CEMX在BIMX上感染和复制产生。

细菌的生长速率是有限资源浓度的单调递增函数第页（微克/毫升），保存图片、插图等的外部文件。对象名称为pgen.1003312.e001.jpg，其中v（v）（每小时）是最大增长率k个（µg）是增长率为其最大值一半的资源浓度(v（v）/2)[29].资源的利用率与细菌密度、细菌生长率和转化效率参数成正比e（电子）（µg）这是生产新电池所需的资源量[30].

噬菌体以速率参数δ（ml/细胞/噬菌体/小时）吸附所有状态的细菌，并在每次感染时产生β噬菌体（爆发大小）。如中所示[24],[25],[31]我们假设噬菌体感染是一个大规模作用过程，其发生速率与细菌和噬菌体的密度与速率常数δ的乘积成正比。间隔物只能从能够在特定状态的细菌上复制的噬菌体中并入。参数米是指被噬菌体感染并能在其上复制的细菌将为该噬菌体添加免疫间隔物的概率。CEM状态噬菌体P（P） 1由生产P（P）o个在复制过程中B类0每感染一个噬菌体的概率为μ。为了解释长度为λ小时的潜伏期，我们假设受感染的细菌进入致命状态，M（M）ij公司，用于状态细菌我感染国家噬菌体j个.时间t吨，分数（1-米)λ小时前感染细胞的数量t吨-λ） 破裂并产生β-1颗粒。(1米)就是感染B的比例0和B1构成BIM的单元(B类1和B类2）；β-1新噬菌体颗粒解释了感染噬菌体的损失。给定顺序的CEM是由前一顺序的噬菌体感染敏感细菌时发生的突变形成的。例如，国家噬菌体P（P）1是B爆发时产生的噬菌体颗粒的一小部分0感染P的细胞0根据这些定义和假设，噬菌体资源浓度和密度的变化率如下：

方程式图像

计算机模拟

在我们对这些方程的数值解（计算机模拟）中，间隔子和CEM突变的获取是随机过程。我们使用欧拉方法来求解微分方程，并使用蒙特卡罗协议来生成BIM和CEMs。在任何时间间隔内Δt，BIM形成的概率与在该时间间隔内被噬菌体感染的敏感细胞的数量成比例。例如，在给定的时间间隔内Δt，a的概率P（P）1感染B类1将生成单个B类2大约为百万分之一1（t-λ）Δt哪里t吨是以小时为单位的时间。如果是随机数x个(0<x个<1）从均匀分布来看，小于此概率，单个B类2将输入B类2人口。在任何时间间隔内，被噬菌体感染的敏感细胞产生CEM的概率与噬菌体的数量成比例。例如P（P）1CEM将由P（P）0感染B类0间隔一段时间Δt大约为微米0（t-λ）（β-1）Δt如果是随机数x个小于该产物，单个噬菌体颗粒将进入P（P）1填充并从中删除P（P）0人口。间隔大小Δt这些模拟程序是在伯克利麦当娜（Berkeley Madonna）编写的。用于分析此模型特性的程序可以在www.eclf.net/programs网站.

参数值和短期人口动态

细菌生长

野生型的最大生长速度嗜热链球菌LM17介质中的应变DGCC7710（参数v（v）)估计为生长培养物的光密度（OD600nm）的自然对数变化的回归系数：1.37±0.27（95%置信区间）。由于细菌是在肉汤中生长的，而不是在一种资源有限的培养基中生长，因此我们无法直接估计Monod常数(k个)或转换效率(e（电子）). 对于前者，我们任意假设值为1µg/ml。尽管我们无法直接估计参数e（电子），对于我们的模拟，我们使用的值为e（电子）以及最大的资源集中度对以及估计的v（v）并假设k个，为野生型种群增长和饱和（固定相密度）提供合理的拟合嗜热链球菌.

噬菌体感染

通过一步生长实验估计了潜伏期λ和爆发大小β[28].野生型的晚期培养嗜热链球菌与等体积的LM17Ca混合，总体积为0.9 ml，并在42°C下培养10分钟，此时添加0.1 ml经LM17Ca-稀释的2972野生型裂解液。细胞浓度约为2×108噬菌体滴度为10时每毫升6每毫升噬菌体。培养物在42°C下培养15分钟，然后在LM17Ca肉汤中连续稀释，细胞密度和噬菌体滴度约为（a）2×105和10三，（b）2×104和102和（c）2×10三和101。每隔一段时间，将来自（a）、（b）和（c）的100µl样品分别与1 ml野生型延迟培养物孵育嗜热链球菌从软LM17Ca琼脂草坪上估计噬菌体颗粒的数量。根据该协议，潜伏期在25至30分钟之间结束，因此λ约为0.4小时。以前的研究[7],[32]估计噬菌体2972的潜伏期为34～40分钟。对于爆发大小，我们使用15-25分钟（爆发前）和40-60分钟（爆发后）时间间隔内的平均估计噬菌体密度之间的差异。β估计约为每个感染细胞80个颗粒。此前的一项研究估计，噬菌体2972的爆发大小为每感染细胞190±33个新病毒[7]。这些差异可能归因于包括培养基在内的生长条件的差异。

有多种方法可以获得吸附速率常数δ的独立估计值，但通常是通过细菌培养物中游离噬菌体的滴度下降来实现的[28]这些方法需要从游离噬菌体中分离成斑单位（包括感染细胞）。虽然我们尝试了各种方案，但结果各不相同，可能是因为菌株DGCC7710产生了胞外多糖[33],[34]此外，由于这些估算需要相对较高的细胞密度（理论上可以使用BIM和敏感细胞进行估算），这些细菌的生理状态可能与快速生长的培养物不同。因此，我们没有独立估计该参数，而是使用δ值，该值在视觉上很好地拟合了该模型，用于对野生型噬菌体和细菌进行短期细菌生长和噬菌体复制实验。对于这种拟合，我们使用了上述最大生长速率的估计值(v（v）)、潜伏期和爆发大小。这样，δ是唯一拟合的噬菌体感染参数(图2).

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缺乏免疫的短期细菌和噬菌体生长动力学：WT细菌和WT噬菌体密度的变化。

虚线是上述模型预测的密度，参数如下：v=1.4小时−1每小时，e=5×10−7µg/细胞，R（初始资源浓度）=350µg/ml，δ=8×10−8ml/细胞/噬菌体/小时，β=80噬菌体颗粒/感染细胞，λ=0.4小时。在24小时时，这些培养物中细菌和噬菌体的估计密度分别为5×108对照组每毫升细胞数和3.2×105CFU和6.2×107混合培养物中细菌和噬菌体的PFU。

虽然从长期种群动态的角度来看，前两小时细菌密度下降和噬菌体滴度增加的观察和预测动态相似，观察到的动态和预测的动态之间最显著的差异是细菌种群的重新出现和持续存在。根据这个模型，所有的细菌都应该在接触噬菌体两个小时后被杀死。用WT噬菌体和从上述7–9和24–26小时回收的单个菌落培养物进行的斑点试验结果表明，这些细菌仍然对WT噬菌体敏感（单独试验中有20多个独立菌落）。换句话说，没有证据表明BIM在这些文化中进化并上升到主导地位。这种与CRISPR裂解噬菌体感染和细菌动力学经典观点下预期的定性偏差-中国科学院免疫力为下文所述的实验奠定了基础。

BIM形成速率（间隔棒采集）

在中描述的实验中，BIM未能提升图2这可能是因为BIM的形成率太低，以至于这些耐药细胞无法出现在WT人群中。我们的研究结果表明情况并非如此。BIM可以很容易地从混合了10种添加剂的草坪中分离出来8噬菌体和107单元格，如下所示。即使存在抗噬菌体的BIM，它们也不会在对噬菌体敏感的细菌所控制的种群中上升。我们的结果尚不清楚BIM生成的准确速率。

首先考虑一下，似乎很容易估计用毒性噬菌体感染敏感细菌会导致免疫（获得间隔物）而不是溶解感染的概率（该概率是参数米在上述模型中）。因此，通过培养WT细胞和WT噬菌体的混合物一段规定的时间，电镀混合物并计算菌落数，从估计的P0，B0和δ，应该可以估计米当我们做这个实验时，存活的菌落数量随着细胞和噬菌体的数量而变化，但如果所有的BIM都是在液体中形成的，则不会以这个模型预期的方式变化。例如，当接种密度较低的WT噬菌体和细菌时，存活（抗性）菌落较多。我们解释了这些实验的结果以及随后的一些结果，以支持除上述模型中考虑的过程以外的其他过程会影响BIM形成速率的假设。特别是，BIM的产生和上升取决于我们在下面考虑的实验条件。

CEM生产频率

在我们的模型中，我们假设能够在BIM上生长的CEM噬菌体是在感染细菌爆发时产生的。虽然在我们的实验中，我们没有估计这些CEM的生成速率，但我们估计了它们在裂解物中的频率。估计噬菌体中的突变率，而不是频率，需要更多的信息来了解这些病毒在感染细胞中的复制方式，而不是我们目前对噬菌体2972及其子噬菌体的复制方式嗜热链球菌主机。为了估计能够在一级BIM上复制的CEM的频率，我们制备了WT噬菌体的独立单斑块裂解物，并估计了每毫升在10种不同BIM（BIM1到BIM10）上形成斑块的粒子数。这10个BIM基于它们新获得的间隔物而彼此不同（见下文）。除了一个WT裂解物和BIM7和BIM8的草坪外，WT噬菌体裂解物中一级CEM噬菌体的相对频率在5×10之间−7和5×10−5(图S1). 我们还分别从二阶BIM和WT草坪上的一阶CEMs形成的斑块数量的比率获得了二阶CEMs频率的单一估计。在一个类似的实验中，我们使用了五个二级BIM及其对应的一级CEM噬菌体，二级CEM的频率也在5×10之间−7至4×10−6(图S1).

BIM和CEM的分子特性

对10个一级BIM的两个活性CRISPR基因座的遗传分析表明，它们各自在CRISPR1或CRISPR3基因座中获得了一个新的间隔区。五个BIM在CRISPR1基因座中获得了一个独特的新间隔区，五个BIMs在CRISRP3基因座中获取了一个独一无二的新间隔(图3). 对五个二阶BIM的类似分析表明，它们各自也在CRISPR1或CRISPR3基因座中获得了一个额外的新间隔区。其中两个二阶BIM在CRISPR1基因座中获得了一个额外的独特的新间隔子，这表明在CRISRP1基因座（BIM32和BIM52在里面图3). 同样，三个二阶BIM在CRISPR3位点获得了新的间隔物，包括两个具有CRISPR2位点（BIM2）迭代构建的变体2和BIM82在里面图3). 有趣的是，BIM72获得了一个CRISPR1间隔子成为一级CEM，获得了CRISPR3间隔子成为二级CEM嗜热链球菌.

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跨两个CRISPR基因座的间隔区的图形表示嗜热链球菌BIM。

不包括重复；只表示分隔符。如前所述，每个间隔符由特定颜色、特定背景色上的一个选择字符组合表示[36]。颜色组合允许特定间隔的唯一表示。相似的颜色方案（字符颜色和背景色的组合）表示相同的分隔符，而不同的颜色组合表示可区分的分隔符。

第一轮和第二轮噬菌体挑战中获得的所有CRISPR1和CRISPR3间隔区的序列分析表明，与挑战中使用的噬菌体2972的WT基因组完全匹配(表S1). 此外，所有新的CRISPR1和CRISPR3间隔区分别与原间隔区相邻基序（PAM）相关：NNAGAAW和NGGNG(表S1). 这些发现与先前的结果一致，表明间隔序列直接来源于噬菌体DNA并与PAM相关[7],[8],[35],[36].

我们对CEM原间隔区和PAM区域的序列分析结果与之前的发现完全一致，即匹配的原间隔区或PAM中的单一突变足以规避CRISPR介导的免疫(图4). 在10个逃避一级BIM免疫的CEM中，一个在原间隔区发生突变，其余9个CEM在PAM序列中发生突变（CRISPR1 PAM中有4个，CRISPR3 PAM中5个）。正如预期的那样，五个逃避二阶BIM免疫的二阶CEM中的每一个都获得了第二个突变。其中一个在原间隔区中获得了第二个突变，两个在PAM中有突变，一个包含原间隔区的一个突变和PAM中的另一个突变，最后一个插入PAM。综上所述，这些测序数据与之前的结果一致，表明CEM是原间隔区和/或PAM突变的产物，使这些病毒能够绕过CRISPR–中国科学院后天免疫[7],[8].

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野生型和突变噬菌体中与新获得的间隔区相对应的核苷酸序列嗜热链球菌BIM菌株。

每个突变体以红色和黄色、粗体和下划线突出显示。

人口动态

光密度数据和资源和噬菌体培养标准

尽管我们通过连续稀释和平板法估计了特定样品的细胞和噬菌体密度，但我们对这些细菌和噬菌体种群动力学的大部分推断来自光密度（OD 600 nm）数据。在这些实验中，我们通过8小时左右的频繁采样来跟踪细菌和噬菌体培养物的OD变化。为了说明光密度的变化如何与细胞密度的变化相关，以及我们对资源培养物和噬菌体培养物中这些变化的预期，我们用40µl的WT细胞过夜培养物接种4 ml肉汤（最终浓度约为2×106细胞/ml），具有不同初始浓度的噬菌体，并且不具有用于对照的噬菌体。

正如预期的那样（直观地以及从模型中），细菌密度因噬菌体而下降之前的时间与这些病毒的初始密度成反比(图S2). 正如模型预测的那样，含有噬菌体的培养物的光密度收敛到远低于无噬菌体对照的水平。然而，在我们的实验中，这些收敛所需的时间比预测的要长。

噬菌体和敏感细菌

为了确定当敏感细菌与噬菌体接触时，BIM是否会出现失败，我们混合了2×106WT单元、一阶BIM和二阶BIM约为2×106WT噬菌体、一级CEM和二级CEM，并跟踪两次转移的OD变化。这些实验的结果显示在图5.

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培养物光密度的变化嗜热链球菌以及这些WT细胞或BIM敏感的相应噬菌体。

第一次转移开始于40µl过夜培养基（约2×106细胞/ml）和噬菌体（约2×106每毫升）。第二次转移是通过向4 ml新鲜LM17Ca中添加40µl的24小时一次通过培养物开始的。带有方形勾号的粗黑线表示无噬菌体WT对照。带有菱形刻度的粗红线是细菌和噬菌体培养物的算术平均OD。面板A:WT嗜热链球菌和WT噬菌体（浅蓝色）和九个一级BIM及其对应的CEM。面板B：五个二阶BIM及其对应的CEM。

在第一次转移过程中，含噬菌体培养物的OD先上升后下降。在第二次转移中，这些OD至少比无噬菌体对照组少一个数量级。第一批转移培养物中噬菌体的初始密度为1.2×106pfu/ml（BIM4）至3.4×107pfu/ml（BIM10）。除BIM1外，这些噬菌体培养物中的细胞密度估计在6.0×10之间4cfu/ml（BIM7）和1×107cfu/ml（BIM6）。在没有噬菌体的情况下，野生型细胞和BIM的平均24小时密度超过2×108cfu/ml。该实验重复至少三次，定性上获得了相同的结果；噬菌体培养物的光密度保持在我们认为的噬菌体范围内，而不是资源有限。

为了确定在这些培养物中是否出现了对噬菌体耐药的BIM，在没有频繁取样的情况下进行了类似的实验。在第一次转移结束时，从一级和二级BIM-CEM培养物中提取单菌落。将这些菌落重新划线并在液体培养物中生长，并与野生型细菌一样，对相应的CEMs进行抗性斑点测试。虽然我们不能排除少数BIM群体对这些噬菌体具有耐药性，但所有测试的菌落都对噬菌体敏感。

资源或噬菌体密度

在前面的文章中，我们使用“噬菌体有限”一词来描述这样的情况，即具有噬菌体的细菌培养物的ODs仍然大大低于如果噬菌体不存在并且细菌受到资源可用性的限制时它们将达到的ODs。“噬菌体限制”一词隐含的假设是，如果细菌的密度不受噬菌体或噬菌体复制产物的限制，细菌可以利用大量资源进行生长。为了验证这一噬菌体假说，我们用野生型、一级或二级BIM和能够在这些细菌上生长的噬菌体接种分批培养物。24小时后，我们将培养物转移到新鲜培养基（1/100稀释液）中，并保持原始培养物和稀释培养物，估计每天的光密度。所有这些都在“噬菌体限制”范围内（约0.2或更低）。72小时后，我们将这些4毫升培养液分成两半。我们将另一种工业品的过夜培养液添加到一半嗜热链球菌菌株（SMQ-301），与DGCC7710无关，对噬菌体2972不敏感。培养24小时后，我们估计了加入和不加入SMQ-301的培养物的OD。当时，原始培养物已经72小时了，稀释培养物已经48小时了。

含有SMQ-301的培养物的OD明显大于没有这些不同细胞的培养物。这种残余生长的程度与加入这些SMQ-301细胞的培养物密度成反比。31对添加和不添加SMQ-301的培养物的线性回归系数为−2.53，（F（1,29）=24.6，p<2.7×10−5). 我们将这些结果解释为直接证据，表明噬菌体而不是资源限制了维持在较低光密度的培养物中的细菌密度（参见表S2).

单间隔区抗性噬菌体和BIM的种群动态

如前所述，BIM不能上升并接管具有敏感细菌和噬菌体的培养物的一个原因(图2和图5)可能是它们不是在敏感人群中产生的（即BIM形成率太低）。如果BIM最初存在于对噬菌体优势种群敏感的细菌培养物中，那么似乎除非它们被能够在其上复制的噬菌体突变体（CEM）所对抗，否则这些耐药BIM将提升到主导培养物。此外，由于噬菌体会吸附到这些抗药性BIM上，预计噬菌体密度会下降，最终应该清除培养物中的噬菌体。然而，如果CEM噬菌体最初存在或在复制过程中生成，则这些噬菌体有望上升，BIM种群将减少并可能被消除。为了说明这些预测结果，我们使用我们的模型并考虑了两种情况：一种是BIM是唯一的细菌种群，除了单个噬菌体颗粒外，它对所有噬菌体都具有耐药性；另一种是没有CEM噬菌体，噬菌体可以在其上生长并产生CEM的BIM和WT细胞的初始密度相等(图S3).

第一种情况：如果没有细菌可以复制，P的密度0噬菌体由于对免疫B的吸附而持续下降1.罕见的P1人口，可以在B上增长0和B1上升并杀死B1人口(图S3A). 第二种情况：虽然它们最初不存在，但在B上复制的过程中0，CEM噬菌体P1起来并提升。两种细菌种群均被消除，野生型和CEM噬菌体均持续存在(图S3B).

为了测试细菌对噬菌体优势种群具有耐药性的情况下的这些假设，我们将一级BIM和WT噬菌体以及二级BIM与其对应的一级CEM（例如CEM2和BIM2）接种到培养物中2（约2×106噬菌体和细胞/ml）。如中所述的实验图5，我们跟踪光密度的变化，并在24小时时将培养物在LM17Ca中稀释100倍，并跟踪第二次转移的OD的变化。该实验的结果显示在图6.

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培养物光密度的变化嗜热链球菌噬菌体初始密度高（约5×106/ml），BIM具有抗药性。

第一次转移（左）是在4 ml LM17Ca培养基中用40µl过夜细菌和噬菌体开始的。第二次转移（右）是通过向4 ml新鲜LM17Ca中添加40µl的24小时一次通过培养物开始的。A组：含WT细胞的WT噬菌体（中量级蓝线）和10个一级BIM。B组：五个二级BIM及其对应的一级CEM噬菌体。带有方形刻度的粗黑线是无噬菌体WT对照，带有菱形刻度的粗红线是所有噬菌体培养物的算术平均密度。

有两种证据支持这样的假设，即这些BIM未能上升到无噬菌体培养物的OD水平，并且其密度下降，至少部分归因于出现了能够在这些耐药细胞上复制的CEM噬菌体。首先，根据我们对WT裂解物中CEM频率的估计(图S1)，我们预计原始接种物中会有一个或多个CEM。第二，更直接的是，在48小时回收的噬菌体在WT细胞的草坪和它们各自的BIM的草坪上产生了清晰的区域。例如，在BIM1草坪上发现由WT噬菌体和BIM1启动的培养物的裂解物时，以及当用CEM2和BIM2启动培养物时，发现了明显的区域2在BIM2上被发现2草坪。

为了进一步验证这样的假设，即只有当单间隔区耐药的BIM暴露于足够大的噬菌体群体中时，才会出现并提升CEM，而这些噬菌体种群的大小足以使CEM在BIM靶向的原间隔区（或PAM）中发生突变，我们在噬菌体初始密度较低的情况下进行了上述实验。根据CEM的估计频率，这些培养物中的噬菌体初始数量较低（约2×10−4)我们不会预期先前存在的CEM具有所需的突变。作为阳性对照，我们使用二级BIM和低密度WT噬菌体进行了这些实验(图7). 由于二级BIM由两个间隔物保护，因此二级CEM的生成是不可预期的，这需要两个不同的原间隔物发生突变才能感染二级BIMs。本试验结果见图7B.

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培养物光密度的变化嗜热链球菌WT噬菌体的初始密度较低。

第一次转移开始于40µl过夜细菌培养物（约2×106细胞/ml）和WT噬菌体（约2×104ml）在4 ml LM17Ca培养基中。第二次转移是通过向4 ml新鲜LM17Ca中添加40µl的24小时一次通过培养物开始的。A组：含WT细胞的WT噬菌体（中量级蓝线）和10个一级BIM。B组：含五个二级BIM的WT噬菌体。带有方形勾号的粗黑线是无噬菌体WT对照。带有菱形勾号的粗红线是所有具有噬菌体的BIM培养物的算术平均密度。

低密度WT噬菌体的二阶BIM(图7A)行为如预期。此外，在我们的富集实验中，将100µl的敏感细菌过夜培养物添加到二阶BIM的生长培养物中，我们无法找到能够在二阶BIM上生长的CEMs。由于二级BIM的吸附（以及CRISPR–Cas系统对其基因组的细胞内裂解），到第二次转移结束时，几乎没有（少于102)这些培养物中的WT噬菌体。事实上，对于五个二级BIM中的三个，当向含有WT细胞的培养物中添加100µl滤液时，我们无法在富集实验的第二次转移结束时回收任何噬菌体。本质上，尽管CEM的生成率很高，但当噬菌体面对已获得两个或更多与噬菌体基因组部分匹配的间隔区的BIM时，噬菌体无法发起军备竞赛。

低密度WT噬菌体和一级BIM获得的结果与我们的模型预测不一致。虽然没有证据表明CEM在大多数具有一级BIM和低密度WT噬菌体的培养物中进化，但它们确实出现在10个一级BIM培养物中的两个（BIM2和BIM8）。此外，在该实验的一个重复中，在10个具有一级BIM（BIM2、BIM3和BIM7）的培养物中有3个出现了CEM。在所有这些CEM出现的情况下，培养物都是噬菌体，而不是资源有限的。此时，我们不知道为什么在第二次转移中，细菌在我们没有分离出CEM突变体的培养物中生长(图7A)相对于无噬菌体对照组延迟。一种可能性是，这些培养物中的CEM突变体延迟了细菌的复制，但在8小时后检测不到。

低密度WT噬菌体和WT细胞的一级和二级BIM的种群动力学

似乎可以合理假设，如果带有CRISPR的细菌-中国科学院当免疫力入侵有噬菌体存在的栖息地时，这些噬菌体也会在敏感细菌上复制。为了模拟这种情况，我们对低初始密度的噬菌体进行了实验，但也对密度与BIM相似的WT细胞进行了实验。其中一个实验的结果显示在图8.

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培养物光密度的变化嗜热链球菌具有低WT噬菌体初始密度的一级和二级BIM和WT细胞。

第一次转移是用40µl每种BIM的过夜培养物开始的（约2×106每毫升）和WT电池（约2×106每毫升）和低密度（约2×1044 ml LM17Ca培养基中的WT噬菌体。第二次转移是通过向4 ml新鲜LM17Ca中添加40µl的24小时一次通过培养物开始的。A组：含WT细胞和10个一级BIM的WT噬菌体。B组：低密度WT噬菌体（约2×104每毫升），使用WT电池和五个二阶BIM。带有方框标记的粗黑线是无噬菌体对照（（A）和BIM2中的WT细胞2（B）中）。带有菱形刻度标记的粗红线是所有含噬菌体的BIM培养物的算术平均密度。

在一级和二级BIM的第一次转移中，细菌的密度下降到噬菌体水平。根据我们的模型，由于噬菌体在野生型宿主上复制过程中产生CEM，因此我们预计一级BIM会出现这种结果。即使它们在实验开始时不存在，当噬菌体在WT细胞上复制时，一级CEM可能会出现。另一方面，他们不会出现在具有二阶BIM的文化中。事实上，我们一直无法检测到在2第上述实验的转移。正如我们在下文中所讨论的，除了二级CEM的出现之外，其他过程是导致二级BIM无法在这些含有WT噬菌体和WT细胞的培养物中提升的原因。然而，应该注意的是，至少对于二阶BIM，在第二次转移的前8小时观察到的噬菌体限制状态没有保持。在26小时时，第二次转移中的五种培养物中有两种已经和无噬菌体对照组一样浑浊，剩下的三种正朝着浑浊的方向发展。

解释与模型预测的偏差

至多，这里使用的数学模型和计算机模拟是对这些实验中发生的人口动态和其他过程的简单讽刺。它们并不打算或预期提供我们实验中观察到的细菌和噬菌体密度变化的定量精确预测。预计实验和理论之间会出现一些定量偏差。然而，预计不会出现重大的质量偏差。其中有两个。一个是噬菌体无法消除敏感细菌，另一个是BIM无法提升和支配具有丰富资源的培养物。我们假设这些失败可归因于噬菌体或噬菌体复制产物，在敏感细胞中产生表型免疫（持久性）[37]并扼杀新兴的BIM。

支持噬菌体裂解液中的某些物质阻止BIM上升并生成持久性的假说的一系列证据来自24小时WT噬菌体无细胞（过滤，而非氯仿）裂解液的结果。嗜热链球菌抗噬菌体细胞（BIM22和SMQ-301）添加到这些裂解液中，并通过频繁采样跟踪光学和活细胞密度。在本实验中，40µl BIM22或将过夜培养物中的SMQ-301添加到4ml噬菌体裂解液中。作为无噬菌体对照，将这些细菌添加到4 ml LM17Ca中(图9). SMQ-301细胞能够在这些WT噬菌体裂解液中生长，因此表明有丰富的资源。然而，BIM2的活细胞密度2细胞数量下降。在24小时和31小时，BIM2的光密度2噬菌体裂解液中的培养物小于0.02，活细胞密度分别为4.7×105cfu/ml和1.2×106cfu/ml。在48小时和54小时时，这些活细胞密度分别为5.6×105cfu/ml和2.1×105cfu/ml。BIM2的灵敏度2SMQ-301未显示WT裂解物中的噬菌体和/或分子。

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光学和活细胞密度的变化嗜热链球菌在野生型噬菌体的无细胞裂解液中。

银行识别码22和SMQ-301在全浓度噬菌体裂解液（1.5×108pfu/ml）和LM17Ca对照（1/100稀释）。Con–LM17Ca控制；Lys–无细胞噬菌体裂解物。面板A：光密度。B组：估计细胞密度。

我们在含有一级和二级BIM的培养物中对WT噬菌体进行了实验，得出了支持噬菌体或其复制或裂解的产物阻止BIM上升的假说的第二条证据。用低密度WT噬菌体和通过一个或两个间隔物对这些噬菌体具有抗性的细菌接种的分批培养物变得资源有限。然而，如果我们允许通过添加WT细胞进行大量噬菌体复制，则带有一级和二级BIM的培养物会变成噬菌体样(图S4).

我们尚未确定负责杀死和/或抑制受感染BIM生长的药剂的特征。然而，用法国新闻社提取物制备的裂解物进行实验的初步结果表明，这种试剂可能存在于细胞内，不一定是噬菌体感染的产物。当在野生型细胞无噬菌体培养物的培养基和法国压榨提取物的混合物中培养时，耐药BIM的生长速度显著降低(文本S1). 在这种解释中，该试剂是作为噬菌体裂解细胞的产物释放的。

扩展模型

永远不要相信实验，除非它被理论证实（归于阿瑟·爱丁顿爵士）

为了以更定量的方式探索上述假设的机制（其中噬菌体复制产物产生表型抗性持续物并杀死BIM）是否能够解释所观察到的动力学，我们使用了理论框架中描述的基本模型的扩展。在此扩展中，我们考虑了三种具有密度的细菌种群B类0,B类1、和B类2和两种噬菌体，P（P）0和P（P）1，分别对应于WT，一级和二级BIM细菌，以及WT和一级CEM噬菌体。为了方便起见，我们假设存在集体集中的因素年µg/ml，可杀死耐药细胞并对敏感细菌提供短暂免疫（持久效应[38],[39]). 由于年在杀伤耐药细胞和产生持久性时，它们由不同的参数控制，它们可以是至少两种不同的化合物。这些试剂的产生速率与复制噬菌体和相应敏感细菌的密度乘积成正比：

方程式图像

其中vL（左）是生产的速率参数年。我们假设细菌的生长速度现在取决于年以及资源，对例如，B的人均增长0现在是保存图片、插图等的外部文件。对象名称为pgen.1003312.e004.jpg哪里ν是该菌株的最大生长速率，k个Monod常数，η-最大杀伤力年、和KL（左）浓度年杀戮速度最快的地方。在模拟中年/月L（左）当年超过KL（左）.解释表型抗性B0和B1细菌，我们假设存在密度为BP的非分裂持久性细胞群0和BP1每毫升细菌数是由其各自的分裂种群按比例产生的年/月L（左）和一个常数(克)并以恒定速率返回到除法状态(小时). 例如，野生型（B）的密度变化率0)现在的人口

方程式图像

用于此扩展模型的伯克利麦当娜模拟可从www.eclf.net/programs网站.

在图10，我们展示了用野生型噬菌体（P0)、野生型细菌（B0)和二阶BIM（B2). 此模拟中使用的种群增长、初始资源浓度和噬菌体感染参数与早期模拟中使用过的参数相同，因此在这些实验中估计的范围内。生产的参数年它的行为是任意的，选择它是为了说明原理，而不是以定性的方式拟合特定的数据。

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扩展模型的仿真结果。

接种WT噬菌体（P0）、二级BIM（B2）和噬菌体可复制的WT细胞（B0）的培养物中细菌和噬菌物密度的变化。一级BIM（B1）和一级噬菌体（P1）分别由添加到CRISPR区域的间隔子产生和突变产生，概率为10−6每细胞或噬菌体每小时。变量R是限制资源的浓度。这些模拟中的细菌生长和噬菌体感染参数与图2.除（A）外，LY和持久性的产生和作用参数如下：vL（左） = 10−6,KL（左） = 106，η=1.4，g=h=0.01。转移开始时资源的初始浓度为350µg/ml。用2×106B0和B2电池和2×106P0噬菌体。小组A：未生产LY（vL（左） = 0). 小组B：文化的第一次转移。小组C：第二次转移。面板D：顺序传输（约2×104).

在没有杀伤作用的情况下，图10A，B2种群上升，噬菌体被消灭。B类0人口继续保持，B1细菌和P1噬菌体被产生，在短时间内，种群变得资源有限。

在具有杀伤效应的模拟第一次传输期间(图10B)、P0噬菌体上升和B的密度0和B2种群数量减少，群落变得噬菌体有限。而第二次转移(图10C)也以噬菌体限制状态结束，即B的相对密度2现在更大了。在后续转账中(图10D)，B2上升到优势地位，噬菌体被消灭，群落变得资源有限。作为连续传代的结果，杀死分子的BIM被稀释，BIM上升。为了让军备竞赛继续下去，噬菌体必须产生能够在BIM优势种群上复制的CEM。

初步支持实验结果

虽然数据可能是不安全、真正自信的科学家的拐杖，但他们的假设要经过测试才能被拒绝. (网址：www.eclf.net)

如果上述假定的连续传代稀释效应有效，那么在连续转移WT细胞和WT噬菌体的实验中，应该会出现BIM。并且，除非CEM噬菌体对抗它们，否则它们将上升到优势地位，噬菌体将消失。为了验证这个假设，我们将WT细胞与噬菌体混合，每天将培养物转移到新鲜培养基（40µl到4 ml中）。我们从大约2×10的相同混合物中培养了六种不同的培养物6细胞和噬菌体。作为对照，我们连续转移无噬菌体WT培养物。在每次转移结束时，我们估算了这些培养物的光密度，并通过连续稀释和平板法，估算了细菌和游离噬菌体的活密度。该实验的结果显示在图11.

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用WT噬菌体和WT细胞进行连续转移实验。

面板A：连续通道末端的光密度。B组：连续移植结束时活细胞密度的估计值。图C：在连续转移结束时估计的游离噬菌体密度。

我们解释该实验的结果与假设一致，即由于连续稀释杀死BIM的化合物，抗性突变体上升。此外，在出现BIM的6种培养物中，有5种噬菌体丢失，即使用WT细胞富集也无法恢复（即军备竞赛终止）。应在不同的起始条件和可能的不同介质（可能是牛奶）下进行额外的系列转移实验，以探索这一观察结果对BIM-CEM军备竞赛限制的普遍性。

讨论

我们用嗜热链球菌DGCC7710及其毒力噬菌体2972，以及相关的计算机模拟，支持CRISPR–中国科学院系统可以（i）防止噬菌体侵入已建立的细菌群落；（ii）使细菌种群能够与噬菌体一起建立和维持；以及（iii）促进噬菌体介导的CRISPR选择之间的军备竞赛——中国科学院获得性免疫（BIM）和免疫介导选择，用于能够在这些BIM上复制的CEM。然而，这些实验和计算机模拟结果表明，这些生态和（协同）进化结果发生的条件具有限制性，这是噬菌体感染的经典观点和当前对CRISPR的理解所无法预测的中国科学院免疫。

尽管对我们当中的分子生物学家（RB）和微生物学家（SM）来说并不奇怪，但这一团队中的人口进化生物学家（BRL和MB）意识到CRISPR的观点——中国科学院从简化的评论图表中收集到的适应性免疫对于嗜热链球菌DGCC7710–噬菌体2972系统。很容易分离出对WT噬菌体（BIM）耐药的细菌突变体。通过获取与噬菌体基因组区域相对应的独特30个碱基对序列（间隔），可以解释所有10个BIM的耐药性。能够在这些一级BIM上复制的噬菌体（CRISPR逃逸突变体，或CEMs）也很容易分离出来。正如CRISPR介导免疫的经典观点所预期的那样，这些耐药病毒的宿主范围仅限于其进化的BIM及其野生型祖先，并可归因于原间隔区（PAM）的突变对应于由其各自的一阶BIM获得的间隔物中的DNA序列。CRISPR的这个迭代过程–中国科学院从这些一级BIM及其各自的二级CEM噬菌体中分离出的五个二级BIM也观察到细菌获得性免疫和噬菌体CRISPR逃逸突变。细菌获取间隔区和噬菌体中原间隔区突变的迭代过程可以产生多少个数量级的BIM和CEM，目前尚不清楚，有待进一步研究。

除了说一级和二级BIM“很容易分离”外，出于以下讨论的原因，我们无法提供获得这种噬菌体耐药性的实际速率的估计值。很明显，CEM的频率为10−6或在裂解物中含量更高。CRISPR逃逸突变的这种看似高比率尤其令人惊讶，因为只有原间隔区PAM区域总序列空间的一小部分负责生成这些CEM。很容易推测，作为它们适应CRISPR的一部分，这些噬菌体进化出了一种提高突变率的机制。

另一方面，我们的噬菌体-宿主相互作用实验和计算机模拟的结果表明，从目前的观点来看，通过CRISPR介导的获得性免疫，噬菌体和细菌的种群和（共同）进化动力学远比这一适应性免疫系统所能推断的要复杂。此外，从定性和定量上讲，这些动力学远远超出了根据噬菌体感染的传统观点从细菌与裂解噬菌体相互作用的种群动力学模型中推断出的动力学[24],[25],[40].

首先，尽管嗜热链球菌BIM可以很容易地在实验中获得，即使存在，这些耐药细菌在带有噬菌体的液体培养物中也无法达到可测量的密度。对于通过单个间隔物抵抗的BIM来说，这种提升失败的一个原因是能够复制并杀死它们的CEM的高突变率。最有趣的是，当噬菌体数量太低而无法预测其在原始裂解液中的存在或在敏感细胞上复制期间的生成时，CEM就会出现。我们假设，这是因为单个间隔物产生的阻力不是绝对的，一小部分噬菌体吸附到耐药细胞上复制并产生CEM。这一解释与之前的观察一致，即并非所有噬菌体DNA分子都被CRISPR裂解–中国科学院感染BIM时[8].

我们的简单模型没有预测到的另一个结果是，敏感细菌的大量密度（超过104每毫升细胞）与噬菌体相遇后存活下来。我们假设这些基因噬菌体敏感细胞的存活可归因于表型抗性[37]由噬菌体感染的产物诱导。这种类型的现象已经在痢疾志贺氏菌感染噬菌体T7[38],[39]巴克斯代尔审查中对该过程的解释[39]，噬菌体酶作为噬菌体感染的产物被释放出来，并将存活细菌的噬菌体受体剥离，从而使其对噬菌体的感染具有表型免疫性。噬菌体2972的表型免疫是否与类似机制有关嗜热链球菌有待观察，这本身就是一项值得研究的课题。

我们的实验结果表明，由于获得两个间隔物而产生的抗噬菌体BIM可以在噬菌体存在的地方建立群落，并防止噬菌体突变体入侵已建立的细菌种群。然而，这些结果的条件是有限制的。如果群落中包含噬菌体正在其上复制的敏感细菌，则不会建立一级或二级BIM。我们假设这可以归因于噬菌体感染的产物，它杀死和/或抑制BIM的复制。由于噬菌体在WT细菌上复制，噬菌体的密度会很高，相应地，这种产物的浓度也会很高。虽然我们还没有确定该产品的特征，但有证据表明噬菌体2972携带编码内切酶的基因[34]另一方面，我们进行的额外实验结果表明，负责抑制BIM生长的药剂不是噬菌体编码产物，而是由裂解细菌释放的（参见文本S1).

细菌和噬菌体的种群动力学模型结合了敏感细胞的持久性和噬菌体感染过程中产生的化学物质对BIM的杀伤，可以解释简单模型预测的结果与实验观察到的结果之间的定性不一致。该扩展模型预测，在连续转移的过程中，这种化学物质的浓度会降低，而对噬菌体具有抗性的BIM会上升，从而主导培养物。我们对WT细菌进行的长期系列转移实验的结果支持了这一预测。最近对实验种群的宏基因组分析结果也与这一解释相一致嗜热链球菌和噬菌体2972[41].

假设、警告和限制

这项联合理论和实验研究的结果对CRISPR的贡献做出了至少五个预测——中国科学院对细菌和噬菌体的种群和群落生态的免疫力以及这些生物的（协同）进化。

  1. CRISPR–中国科学院免疫系统可以保护已建立的细菌群体免受噬菌体的入侵，但前提是所有细菌都携带至少两个间隔物来抵抗入侵病毒。
  2. 尽管CRISPR介导的免疫可以使细菌入侵已建立的细菌和噬菌体群落，但这种结果的条件是有限制的：（i）入侵的细菌种群必须通过至少两个间隔物对已建立的噬菌体种群产生抗药性；（ii）在已建立的群落中，抑制化合物的浓度必须足够低，以便入侵的细菌种群能够复制。
  3. 由于表型抗性（持久性），细菌和噬菌体群落将包含对噬菌体敏感的细菌种群。
  4. 尽管BIM和CEM很容易以相对较高的速度生成，但CRISPR介导的BIM-CEM（共同）进化军备竞赛可能不会随之发生；未生成或无法生成CEM的BIM可能会提升并支配细菌种群。
  5. 获得多个间隔物可用于有效开发工业、生物技术或食品加工中的抗噬菌体菌株，以防止特定噬菌体污染。

总体而言，该研究预测CRISPR的作用——中国科学院原核生物及其病毒自然群落日常生态学和进化中的系统，充其量只是适度的，比现有理论所预期的更具限制性。

尽管我们认为这些预测很有说服力，但在这个关头，我们只把它们视为尚未经过充分测试的假设。我们将这项研究局限于单个噬菌体种群与具有非常活跃的CRISPR的细菌之间相互作用的早期动力学中国科学院免疫系统。虽然我们的模型和实验适用于这些生物之间关联的这一阶段，但它们不足以预测这些相互作用的长期种群和（共同）进化动力学。最重要的是，我们的模型和实验没有正式考虑在每个级别上可以生成的BIM和CEM的潜在多样性以及它们之间的相互作用（例如，[25]). 这种多样性将如何在这些相互作用的长期种群和（共同）进化动力学中发挥作用，以及细菌种群是否会受到噬菌体而不是资源的限制，仍有待观察。在这方面特别重要的是，是否会出现对噬菌体具有其他抗性机制的细菌，以及噬菌体是否能够产生能够在这些抗性细胞上复制的突变体（参见[42]而且[43]). 很可能是因为在这些实验中，CRISPR介导的免疫产生率相对较高，所以未能观察到具有其他耐药机制的细菌嗜热链球菌.

最后，为了支持CRISPR介导的免疫在原核生物及其病毒的日常（而非历史）生态和进化中发挥有限作用的预测，我们选择了实验系统。嗜热链球菌而噬菌体2972很可能是一个特殊的系统体外利用CRISPR介导的免疫研究噬菌体和细菌的种群动态和进化。它不仅可以说是（当然，对于使用它的人来说）最具特征的自然发生的CRISPR——噬菌体系统；就间隔棒的获取速度和可能的CEM生成速度而言，它是最活跃的。它是观察CRISPR在原核生物及其病毒的生态学和进化中发挥重要作用的理想系统。据我们所知，没有证据表明自然发生的CRISPR-中国科学院其他生物系统在生成BIM和CEM方面与嗜热链球菌和它的噬菌体。基于这些原因，我们推测CRISPR——中国科学院其他细菌、古细菌及其噬菌体的系统在日常生态和进化中的作用将比本研究预期的更不积极。

材料和方法

细菌和噬菌体

对于我们的实验模型，我们选择了嗜热链球菌DGCC7710，因为它包含了最具特色的CRISPR——中国科学院功能系统。嗜热链球菌DGCC7710型[1]具有四种不同的CRISPR–中国科学院其中两个活性系统（CRISPR1和CRISPR3）被用作毒力噬菌体2972的宿主[34]。我们还使用嗜热链球菌SMQ-301型[44]作为非寄主菌株，它对2972具有抗性。

介质和取样方法

所有实验均使用一种称为LM17Ca的单一培养基。M17（Oxoid）补充0.5%乳糖（L）和0.05 M硼葡萄糖酸钙（Ca）。对于软/顶琼脂和硬/底琼脂，LM17Ca分别添加0.6%和1.5%琼脂。通过在0.85%盐水中稀释并在LM17Ca上电镀来估计细胞密度。为了评估噬菌体滴度，将连续稀释的样品添加到1 ml的嗜热链球菌放入3ml软琼脂中，倒入LM17Ca平板上。

BIM和CEM噬菌体的分离

约5×108 嗜热链球菌DGCC7710细胞与约2.5×10混合7野生型（WT）噬菌体2972，保持约10分钟。然后将这些混合物添加到3 ml LM17Ca软琼脂中，然后将其倒在LM17Ca-平板上。平行进行了10个与上述相同的实验。所有平板在42°C下培养30小时。从每个培养皿中取出单个菌落并划线两次，以纯化BIM克隆并去除污染的噬菌体。通过斑点10µl（至少5×105pfu）在BIM的软琼脂草坪上稀释的裂解液。透明区得分为敏感，而混浊区或少数单独斑块得分为耐药。从这些实验中，我们选择了10个BIM（每个实验一个），指定为BIM1、BIM2、…BIM9和BIM10。使用类似的程序，通过检测能够在这些一级细菌上复制的CEM，从五个一级BIM中随机分离出五个二级BIM。这些被称为BIM22、BIM32，BIM52，BIM72和BIM82将100µl噬菌体2972裂解液与1 ml一级或二级BIM过夜培养物混合，分离出CEM噬菌体。10分钟后，将这些混合物添加到3ml软琼脂中，倒入LM17Ca平板上，并在42°C下培养过夜。第二天从平板中取出单个噬菌体斑块，并添加到3或10 ml LM17Ca中。在每根试管中加入几滴氯仿以杀死剩余的细菌。然后将这些裂解液旋涡并离心。然后过滤这些单个斑块裂解物（0.45µm）并将其储存在4°C下。将该单个噬菌斑分离过程重复两次以获得纯化的噬菌体。一级BIM（BIM1至BIM10）的CEM噬菌体被指定为CEM1至CEM10。二级BIM的CEM噬菌体被指定为CEM22、CEM32，CEM52，CEM72和CEM82.

WT噬菌体和CEM的检测

使用两种程序检测液体培养物中是否存在WT噬菌体和特定CEM。一种是现场测试：直接或在连续稀释到WT细胞或一级或二级BIM的软琼脂草坪上后，将10µl过滤或氯仿处理的培养物斑点。带有特定斑块的透明区或混浊区被认为表明存在能够在该细菌细胞系上复制的噬菌体。如果此点测试结果为阴性，我们使用浓缩程序，将100µl裂解液添加到4 ml培养基中，培养基中含有100µl过夜培养细菌。在42°C下跟踪这些富集培养物的光密度，清除的培养物被认为是能够在宿主细菌上复制的噬菌体阳性。

BIM存在的分析

还使用了两种程序来测试是否存在对野生型或CEM噬菌体耐药的细菌。一种是现场测试：将单个菌落划痕到新鲜培养基上，从其来源的培养基中的噬菌体中纯化它们。单菌落在42°C的液体培养基（1 ml）中培养过夜，然后放入软琼脂中作为草坪，用于噬菌体的现场测试。为此，我们使用了上一段中描述的灵敏度/电阻的程序和标准。在某些情况下，通过向软琼脂中添加100µl噬菌体和100µl细胞培养物并寻找菌落来直接测试样品中是否存在耐药细胞。

BIM和CEM的分子特性

活动的嗜热链球菌对CRISPR基因座，即CRISPR1和CRISPR3进行PCR，以测试暴露于噬菌体后BIM中是否获得了新的间隔物。针对CRISPR1末端的先导序列和一个独特的WT间隔物的引物，以及针对CRISRP3末端和先导的引物对，用于PCR扩增。这些引物的名称和序列分别为：yc705′-tgctgagaacaacctagtctctc-3′和89R65′-TCAGCAGATTGTCAAATCGG-3′用于CRISPR1和F15′CTGAGATTAATAGTGCGATTAG-3′和R25′-GCTGATATTCGTATACATGTC-3′用于CRISPR3。如前所述进行PCR扩增[36]使用Ambion Mastermix和以下PCR循环：在95℃下变性7分钟；然后在95℃下进行35次30秒的变性循环；53℃下杂交30秒，72℃下延长1分钟；然后在72℃下进行最后一轮5分钟的延伸。PCR扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳进行大小分析，使用Qiagen试剂盒进行纯化，然后使用用于扩增的相同引物集进行Sanger测序。如前所述，测序结果在EXCEL中可视化[36]以便评估CRISPR重复发生并可视化间隔物含量。为了评估CEM中的原间隔序列，如前所述，对第一代和第二代CEM进行了靶向PCR扩增，然后对PCR扩增产物进行Sanger测序[7],[8].

支持信息

图S1

CEM噬菌体突变体的相对频率：BIM草坪斑块与野生型草坪斑块中估计噬菌体数量的比率。A组，一阶BIM的CEM（三个独立实验）。面板B，二阶BIM的CEM。

（畅通节能法）

图S2

野生型培养物光密度的观察和预测变化嗜热链球菌DGCC7710和噬菌体2972的不同初始密度。面板A，根据模型预测光学密度的变化，其中使用了图2B组，观察到模型中预期的光密度变化。为了将该模型中考虑的种群密度转换为光密度，我们连续稀释了一种野生型文化嗜热链球菌LM17Ca中已知CFU密度，并估计不同稀释度的OD（600 nm）。使用多项式拟合这些细胞密度×OD数据，我们计算了模拟生成的细菌细胞密度预测的OD（600 nm）。需要注意的是，外径在0.005左右的校平是拟合过程的产物，外径数据无法估计小于约5×10的细菌密度5.

（畅通节能法）

图S3

模拟结果显示了细菌和噬菌体密度以及限制资源浓度的变化第页图A，最初是细菌种群（B1)对噬菌体优势种群免疫（P0)和单个CEM突变体（P1)能够在B上复制1B组，最初对P敏感和免疫的细菌密度相等0噬菌体（B0和B1)无CEM噬菌体（P1 = 0），但CEM突变率μ=10−6每粒子每爆发。用于这些模拟的种群增长和噬菌体感染参数是传说中的图2.

（畅通节能法）

图S4

培养22小时后的光密度。面板A，低密度（2×10）的一阶BIM（BIM1和BIM2）4pfu/ml）的WT噬菌体或二阶BIM（BIM32和BIM72)使用一阶CEM（CEM3和CEM7）。面板B，低密度二阶BIM（2×104pfu/ml）含和不含WT细胞的WT噬菌体。

（畅通节能法）

表S1

CRISPR1或CRISPR3中获得的新垫片列表嗜热链球菌DGCC7710和噬菌体2972中相应的原间隔区。

（PDF格式）

表S2

有无光密度（600 nm）的平均和标准偏差嗜热链球菌SMQ-301。

（DOCX）

文本S1

噬菌体依赖性抑制BIM复制的证据。

（文件）

致谢

BRL特别感谢他的实验室经理尼娜·沃克，没有她的行政、后勤和准备性帮助，他永远无法进行这些实验。我们感谢杜邦营养与健康公司的Wes Morovic为BIM的分子表征提供的帮助，以及拉瓦尔大学的Denise Tremblay为CEM的分子特性提供的帮助。我们非常感谢非匿名评论员马格努斯·隆德格伦（Magnus Lundgren）建议现在在文本S1最后，作者想对开发和支持Skype的人们和组织表示感谢，Skype极大地促进了两国合作。

资金报表

本研究的资金由美国国立卫生研究院GM 091875（BRL）和加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）（发现计划）（SM）提供。资助者在研究设计、数据收集和分析、出版决定或手稿准备方面没有任何作用。

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文章来自PLOS遗传学由以下人员提供多环芳烃