缺氧条件下强化糖酵解支持胰腺癌的肿瘤共生和己糖胺生物合成

低氧强烈参与PDAC的糖酵解表型。

研究表明，肿瘤侵袭性的增加与癌的糖酵解表型相关(6). 在实体瘤中，缺氧促进了从OXPHOS向糖酵解模式的转变，导致肿瘤细胞增加葡萄糖捕获和乳酸生产（厌氧“糖酵解”），当在充氧良好的肿瘤细胞中检测到这一过程时，也称为Warburg效应（有氧“糖酵解”）。在这里，我们旨在进一步了解体内缺氧胰腺癌细胞的糖酵解活性，以此作为其潜在攻击性的指标，并将其与正常细胞的活性进行比较。我们首先研究了参与糖酵解代谢的基因的表达，如己糖激酶2(香港2号),磷酸甘油激酶1(第1页),丙酮酸脱氢酶激酶同工酶1(预测值k1)、和乳酸脱氢酶a(利达)以及葡萄糖和乳酸转运体，如葡萄糖转运蛋白1(葡萄糖转运蛋白1)和单羧酸转运体4(Mct4公司). 正如所怀疑的那样，与对照胰腺相比，肿瘤中所有这些基因都显著增加(图2A类和图S1B类)这意味着PDAC是一种高度糖酵解肿瘤，能够产生乳酸并将其挤出细胞外空间。此外，50.2%和58.2%的GLUT1和MCT4染色位于PDZ⁺区域，分别(图2B类)这表明PDAC的糖酵解活性主要发生在缺氧区域。为了更准确地描述缺氧条件下胰腺癌细胞的糖酵解活性，我们使用了一个体外上皮癌细胞模型（PK4A细胞），该模型由Pdx1-芯;LSL-Kras公司^G12D系列;墨水4a/Arf^{飞行/飞行}个人数字助理(图S1C类). 低于1%O₂，低氧水平足以稳定HIF1α(图S1D类)与正常毒性PK4A细胞相比，糖酵解酶、葡萄糖和乳酸转运体编码基因的转录上调（两到七倍(图2C类和图S1E类). 我们还发现，这些缺氧细胞具有高度的代谢活性，因为缺氧48小时和72小时后，它们消耗和释放的葡萄糖和乳酸分别是正常氧细胞的两倍(图2D类). 这些结果表明，含有高度糖酵解细胞的PDAC-缺氧区域代表了肿瘤中广泛存在的极为侵袭性细胞的小生境。

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图2。

缺氧条件下PDAC和PK4A细胞糖酵解、葡萄糖摄取和乳酸释放增加。(A类)香港2号,葡萄糖转运蛋白1、和Mct4公司mRNA水平LSL-Kras公司^G12D系列;墨水4a/Arf^{飞行/飞行}控制胰腺(n个=3只小鼠）和PDAC(n个=3只小鼠）36个B4mRNA水平。P（P）值与第一个对照胰腺的表达有关。(B类)PDZ中GLUT1和MCT4转运体的免疫荧光染色⁺PDAC的区域。GLUT1的百分比⁺或MCT4⁺低氧区的区域表示为图1B类（比例尺，50µm）。(C类)香港2号,葡萄糖转运蛋白1、和Mct4公司缺氧24、48和72小时培养的PK4A细胞的mRNA水平₂)或正常氧和正常化A类.P（P）该值与相应的正常值有关。(D类)葡萄糖(左上)和乳酸浓度(左下方)在常压（N）或缺氧（h）72小时内，每24小时在PK4A上清液中评估一次，并归一化为各自的活细胞数。P（P）该值与相应的正常值有关。(赖特)说明了低氧PK4A细胞中葡萄糖摄取（Glc）和乳酸产生（Lact）相对于相应的正常氧值增加的倍。P（P）这些值（均<0.05）与缺氧24h后测得的葡萄糖摄取（a）或乳酸生成（b）有关。对于所有图形，M，合并*P（P）<0.05和**P（P）< 0.001. 误差条显示SD（显示的结果代表至少三个独立实验）。

糖酵解缺氧细胞中的乳酸能促进正常氧细胞的生长。

以前的报告表明，含氧癌细胞可以通过氧化途径代谢乳酸，以满足其能量和生物量需求（代谢共生）(16,17). 因此，我们推测，小鼠PDAC中可能存在糖酵解缺氧细胞和邻近常氧氧化细胞之间的乳酸交换。我们观察到Mct1型（负责正常氧细胞摄取乳酸的单羧酸转运体1）在小鼠PDAC中比对照胰腺高4至17倍(图3A类). 此外，MCT1染色在正常氧区高度增强，65%的染色位于PDZ阴性区(图3B类). 为了利用体内环境在人体组织中重现这些观察结果，我们制作了患者来源的胰腺肿瘤异种移植物，再现了人类PDAC的解剖病理特征(图S2A类)缺氧区域可以用PDZ染色(图S2B类). 在该模型中，MCT1主要定位于靠近强缺氧区域的细胞中，在该区域中其表达显著减少(图3C类)MCT4染色与缺氧区域强匹配，如图所示图2B类在切除的人类胰腺肿瘤中检测到MCT，发现构成肿瘤腺体的上皮细胞的质膜中存在这两种转运体。然而，只有MCT4存在于基质中播散的上皮细胞中，这意味着这两种转运蛋白在临床上的定位也不同(图S2C类).

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图3。

乳酸被常氧PK4A细胞用作替代碳源。(A类)Mct1型对照胰腺和PDAC的mRNA水平。数据和P（P）值表示为图2A类. (B类)小鼠PDAC中MCT1与PDZ的免疫荧光共表达。MCT1的百分比⁺PDZ周围常氧区域内的区域⁺单元格表示为图1B类. (C类)MCT1和MCT4与PDZ在患者来源的胰腺肿瘤异种移植物中的免疫荧光共线性（比例尺，50µm）。(D类)Mct1型PK4A细胞中mRNA水平的培养和表达图2C类. (E类)在添加或不添加钠的还原血清培养基中培养的PK4A细胞上清液中的乳酸浓度L（左）-乳酸。值被归一化为相应的活细胞数。P（P）该值（均<0.05）与各培养基（分别为a和b）中测得的24h乳酸浓度有关。(F类)培养的PK4A细胞数量E类.P（P）该值与在相应的无乳酸培养基中测得的细胞数有关。

最后，我们在PK4A细胞上证实Mct1型在常氧条件下转录物上调，缺氧阻碍了这一时间过程的诱导(图3D类). 有趣的是，在常氧条件下，在添加乳酸的培养基中培养的PK4A细胞在3天内消耗了高达50%的添加乳酸(图3E类)而在培养基中培养的不含乳酸的PK4A细胞如前所示合成并释放乳酸(图2D类,左下方). 乳酸消耗量的增加促进了PK4A的增殖率，且具有相似的时间过程(图3F类). 我们观察到PK4A细胞在常压缺氧条件下与缺氧细胞中富含乳酸的条件培养基培养时具有类似的增殖优势(图S2D类). 因此，除了表明常氧细胞的糖酵解能力低于缺氧细胞外(图2)我们的数据进一步证明，胰腺正常毒性癌细胞具有代谢灵活性，能够利用缺氧细胞产生的乳酸作为替代底物进行增殖。

谷氨酰胺对缺氧性胰腺肿瘤细胞存活是必需的。

尽管低氧PDAC细胞具有高度的糖酵解能力，并消耗大量的葡萄糖，但似乎有必要评估其代谢谷氨酰胺的能力，谷氨酰胺是仅次于葡萄糖的第二大碳源，也是氮的第一供应源。为了测量胰腺癌细胞在缺氧应激下的体外和体内胰腺癌模型中的谷氨酰胺需求，我们首先测定了关键酶谷氨酰胺酶（GLS）和GLS2的表达，它们催化谷氨酰胺生成谷氨酸。在PK4A细胞中，Gls2公司显示的表达水平高于Gls公司（2.5-1.5倍增加）₂处理(图4A类)小鼠PDAC切片上GLS2和PDZ的共染色显示，50%的GLS2染色定位于PDZ⁺面积(图4B类). 接下来，我们通过测量在含有或不含谷氨酰胺的培养基中培养的PK4A细胞的细胞内谷氨酸生成来评估其谷氨酰胺利用率。正如预期的那样，我们观察到缺氧PK4A细胞能够产生谷氨酸，谷氨酰胺是谷氨酸产生的主要来源(图4C类). 此外，我们发现在谷氨酰胺缺乏的培养基中培养的缺氧细胞失去了维持生存能力的能力(图4D类)以及它们的克隆生长能力(图4E类). 因此，缺氧胰腺肿瘤细胞的生存能力维持、增殖和集落形成能力似乎强烈依赖谷氨酰胺的摄入。

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图4。

低氧条件下胰腺肿瘤细胞的增殖需要谷氨酰胺分解。(A类)Gls公司和Gls2公司缺氧条件下培养15、24和48小时的PK4A细胞mRNA水平₂). 数据标准化为图2A类，P值相对于各自Gls公司表达式。(B类)PDZ中GLS2的免疫荧光染色⁺PDAC区域。GLS2的百分比⁺低氧区的区域表示为图1B类. (C类)缺氧24小时培养的PK4A细胞内谷氨酸水平A类在完全无谷氨酰胺培养基中添加或不添加4mM谷氨酰胺（分别为+Gln和−Gln）。谷氨酸被归一化为相应的活细胞数，并且P（P）该值与在完整培养基中测得的各自谷氨酸水平有关。(D类)可行的PK4A细胞数(左侧)和这些细胞的亮场图像(赖特)缺氧培养48hC类.P（P）该值与在添加了Gln的介质（比例尺，200µm）中测量的相应细胞数有关。(E类)在报道的培养基中，用缺氧培养的PK4A细胞在A中培养5天，进行具有代表性的克隆形成分析。

小鼠菌株和组织收集。

Pdx1页-Cre公司;墨水4a/Arf^{飞行/飞行};LSL-Kras公司^G12D系列通过杂交以下菌株获得小鼠：Pdx1页-Cre公司;墨水4a/Arf^{飞行/飞行}和LSL-Kras公司^G12D系列这些小鼠分别由D.Melton博士（马萨诸塞州剑桥哈佛干细胞研究所）、R.Depinho博士（波士顿达纳-法伯癌症研究所）和T Jacks博士（马萨诸塞州坎布里奇David H.Koch综合癌症研究院）提供。将携带PDAC的8-12周龄雄性小鼠与其交配对照窝鼠一起处死。将肿瘤或对照胰腺切片固定在4%（wt/vol）甲醛中，或冷冻在冷异戊烷中进行进一步的免疫染色分析，或直接在4M异硫氰酸胍裂解缓冲液中匀浆，以根据Chirgwin的程序有效提取胰腺RNA(28). 细胞缺氧的免疫检测需要在处死前4小时腹腔注射盐酸PDZ（60 mg/kg；Hypoxyprobe）。所有动物护理和实验程序都是在马赛动物伦理委员会的同意下进行的。

异种移植物。

患者源性胰腺肿瘤块（1 mm^三)在异氟烷麻醉（诱导，4%（vol/vol）下，将其植入Matrigel中，然后皮下植入成年雄性瑞士裸鼠（Charles River Laboratories）的侧面；维护，1.5%（vol/vol））。每周用卡尺测量肿瘤，直到肿瘤体积达到1 mm^三在肿瘤内注射盐酸PDZ后4 h，将肿瘤块取出，固定在4%（wt/vol）甲醛中，或冷冻在冷异戊烷中进行进一步分析。

免疫组织化学、免疫荧光、Western Blots和初级抗体。

用于组织切片或细胞内蛋白裂解物中蛋白质免疫检测的方案和抗体在SI材料和方法.

图像采集和分析。

对PDZ染色的组织切片以及各种标记物进行定量测定，如SI材料和方法使用ImageJ软件（美国国立卫生研究院）。

实时PCR。

RT-PCR按SI材料和方法所用底漆如所示表S1.

代谢物分析。

由Yelen（法国马赛）或Biovision试剂盒测量葡萄糖、乳酸和谷氨酸，如SI材料和方法.

我们感谢细胞培养平台和小鼠集落设施（cell stress，Unité1068）提供的技术援助，以及Jean-Pierre Cavaille提供的葡萄糖和乳酸测量。人类来源的样本来自法国研究部授予的IPC/CRCM肿瘤银行（授权号AC-2007-33）。该项目由IPC机构审查委员会批准。这项工作得到了国家癌症研究所、普罗旺斯-阿尔卑斯-科特-德阿祖尔癌症研究所和法国癌症研究所的部分资助。F.G.得到了Santé基金会、Sport et Dédevelopment Durable和Fondation de France奖学金的支持。