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神经科学杂志。2009年3月18日；29（11）：3518–3528。
数字对象标识：10.1523/JNEUROSCI.5714-08.2009
预防性维修识别码：项目经理3589565
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PMID：19295157

P2X4受体介导的小胶质细胞脑源性神经营养因子的合成和释放依赖于钙和p38丝裂原活化蛋白激酶的激活

团庄,1,2,三 西蒙·贝格斯,1,2,三 香湾,1,2,三和迈克尔·索尔特通讯作者1,2,三
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摘要

脊髓背角的小胶质细胞在周围神经损伤后疼痛超敏反应的发病机制中起着至关重要的作用。众所周知，P2X4嘌呤受体（P2X4Rs）导致小胶质细胞释放脑源性神经营养因子（BDNF），这是神经损伤后维持痛觉超敏反应所必需的。然而，在理解小胶质细胞P2X4R的激活如何导致BDNF的释放方面存在一个关键的差距。这里，我们表明，用ATP刺激P2X4R可引起小胶质细胞双相释放BDNF：早期在5分钟内发生，而晚期在ATP刺激60分钟后达到峰值。伴随着释放的晚期，小胶质细胞内BDNF水平增加。BDNF释放和小胶质细胞内积累的两个阶段都依赖于细胞外钙2+BDNF释放和积累的晚期，而不是释放的早期，通过抑制转录和翻译而受到抑制，表明P2X4R的激活导致先前存在的BDNF池的初始释放，随后增加从头开始的BDNF的合成。通过抑制SNARE（可溶性N个-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体）介导的胞吐。此外，我们发现P2X4R诱发的BDNF的释放和合成依赖于p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的激活。总之，我们的研究结果通过P2X4R引起的Ca增加，为周围神经损伤后的疼痛超敏反应提供了一个统一的机制2+p38-MAPK的激活导致小胶质细胞合成和释放BDNF。

介绍

越来越多的证据表明，疼痛超敏反应是神经性疼痛的标志性症状，通常是由于外周神经损伤引起的，它严重依赖于脊髓背角的小胶质细胞信号(Tsuda等人，2005年;Scholz和Woolf，2007年). 周围神经损伤后，神经损伤同侧脊髓背角小胶质细胞中P2X4受体（P2X4R）亚型离子型嘌呤受体的表达增加，而神经元或星形胶质细胞中无此表达；这种增加与疼痛超敏反应的增加平行(Tsuda等人，2003年,2008;Ulmann等人，2008年). 药物阻断P2X4R可急性逆转神经损伤后已建立的痛觉超敏反应，通过反义RNA抑制P2X4R表达可减轻痛觉超敏感的发展(Tsuda等人，2003年)在P2X4R无突变小鼠中被阻止(Ulmann等人，2008年). 因此，小胶质细胞P2X4Rs对于周围神经损伤后疼痛超敏反应的持续表达是必要的。

小胶质细胞通过向背角伤害性加工网络中的神经元发出信号诱导痛觉超敏反应(井上，2006;Scholz和Woolf，2007年). 脑源性神经营养因子（BDNF）已被证明是介导这种小胶质细胞-神经元信号的关键分子(Coull等人，2005年)：通过其同源受体原肌球蛋白相关激酶B（TrkB）发挥作用，BDNF从小胶质细胞信号释放到脊髓I层神经元，导致细胞内[Cl升高−]从而抑制GABA一个-以及甘氨酸介导的对这些细胞的抑制。去抑制揭示了I层神经元的无害输入，并促进了它们对有害输入的反应(Keller等人，2007年). 在这种正常的伤害性上升途径中产生的异常输出可能是神经性疼痛症状的基础。与BDNF作为神经病理性疼痛的关键介质的作用一致，BDNF公司+/−与野生型小鼠相比，神经损伤后小鼠的痛觉超敏反应减弱(Yajima等人，2005年). 此外，在P2X4R无突变小鼠中，BDNF在神经损伤后积聚在背角小胶质细胞中，表明P2X4Rs对小胶质细胞释放BDNF至关重要体内(Ulmann等人，2008年).

一个尚未解决的关键问题是P2X4R刺激如何导致小胶质细胞释放BDNF？为了解决这个问题，我们在原代培养中研究并操作小胶质细胞，因为这些小胶质细胞显示P2X4R诱发的BDNF释放，当对幼稚动物进行脊髓给药时，这些细胞可引起与周围神经损伤后相当的强烈疼痛超敏反应(Tsuda等人，2003年;Nasu-Tada等人，2006年). 我们发现，刺激P2X4R会导致BDNF从现有池中释放，并增加BDNF的表达。BDNF的释放和表达均为钙2+-p38-丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）依赖并通过活化介导，MAPK是一种与周围神经损伤后疼痛超敏反应有关的激酶(Jin等人，2003年;Tsuda等人，2004年;庄等人，2007). 我们还证明了P2X4R刺激的BDNF释放通过可溶性N个-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白（SNAP）受体（SNARE）依赖性胞吐。因此，我们的发现为理解小胶质细胞的基本机制步骤提供了一个范例：P2X4R的刺激导致钙内流2+p38-MAPK的激活，其介导BDNF的合成增加和SNARE依赖性释放。

材料和方法

原代小胶质细胞培养。

原代小胶质细胞培养物的制备如前所述Tsuda等人（2003年）简而言之，使用出生后（P1–P3）Sprague-Dawley大鼠皮层制备原代培养物，并在含有10%胎牛血清（Invitrogen）和青霉素-链霉素（1:1000；Wisent）的DMEM培养基（Invit罗gen）中保存10–14天，培养温度为37°C，CO含量为5%2和95%O2通过轻轻摇晃将小胶质细胞从混合原代培养物中分离出来，并将其重新放置在100 mm塑料皿上2 h，使健康的小胶质细胞粘附在表面。这种方法产生纯度>95%的原代小胶质细胞培养物。

在实验中，使用细胞刮板从每个100 mm培养皿中采集小胶质细胞，并收集在100μl PBS中（Wisent）。为了避免活细胞比例的潜在盘碟差异，在每次实验中采集的所有小胶质细胞最初被合并，然后在治疗前均匀地分配到Eppendorf管中。为了最小化BDNF测量中的潜在变异性，每个实验都是在PBS组和仅ATP组中进行的，并且反应标准化为PBS对照。

ATP和其他药物的应用。

通过添加ATP（50μ米; Sigma）直接注入PBS细胞外溶液。ATP浓度（50μ米)用于本研究的药物已被证明优先激活P2X4R而非P2X7R(Tsuda等人，2003年). 在ATP刺激后，将细胞放回37°C培养箱进行实验，实验持续时间为5分钟至5小时。对照组接受PBS，而药物治疗组在ATP刺激前进行预处理，如下所述。实验结束时，用磷酸酶抑制剂混合物（2%；Sigma）和广谱蛋白酶抑制剂（2%；Sigma）处理细胞，并以3000 rpm离心6 min。将颗粒（小胶质细胞）重新悬浮在含有15%甘油和75 m米使用蛋白质印迹分析Tris碱基和蛋白质水平。根据制造商的说明，使用Microcon YM-10离心过滤装置（Millipore生物科学研究试剂）将小胶质细胞释放的BDNF回收到上清液中，并使用BDNF特异性ELISA试剂盒（见下文）分析保留物。

所有药物均以PBS或DMSO储备溶液的形式制备。库存被分为一次性小份，并根据需要储存在4°C或−20°C下。在所有实验中，未服用药物的对照组均接受了载体，对于二甲基亚砜，其最终浓度与含药物溶液的浓度相匹配。最终DMSO的最大浓度为0.1%，与单独使用PBS相比，施用此浓度的DMSO对BDNF的释放或积累没有影响（未说明）。

为了研究P2X4R在ATP诱发的BDNF释放中的作用，在ATP刺激前15分钟开始用2′，3′-O-（2,4,6-三硝基苯基）腺苷5′-三磷酸（TNP-ATP）（10μ米; 西格玛；1000倍PBS储备溶液），P2X1-4R的拮抗剂，或吡哆醇磷酸-6-唑苯基-2′，4′-二硫氰酸（PPAD）（10μ米; 西格玛；1000×PBS），P2X1-3,5,7R的拮抗剂，但不是P2X4R。

调查钙的需求2+在ATP诱发的BDNF反应中，小胶质细胞在含有钙的正常细胞外液中被ATP刺激2+（2米米)或在不添加Ca的细胞外溶液中2+。我们还检查了钙的影响2+离子载体A23187（2μ米; 西格玛；2500×DMSO）和肌浆网/内质网（ER）Ca2+-ATP酶抑制剂thapsigargin（2μ米; 西格玛；2500×DMSO）对小胶质细胞中BDNF的释放和表达的影响。在使用A23187的实验中，细胞外溶液中含有TNP–ATP，以通过小胶质细胞释放ATP来防止P2X4R可能的二次激活。

为了确定BDNF释放和蛋白表达的增加是否是通过转录、翻译或两者的增加介导的，用放线菌素D（1μ米; 西格玛；10000×DMSO）或环己酰亚胺（1μ米; 西格玛；10000×DMSO）ATP刺激前30分钟。对照组在没有ATP刺激的情况下给予放线菌酮或放线菌素D，以检查这些药物对基础BDNF水平的影响。

为了研究小胶质细胞ATP诱发的BDNF释放是否依赖于涉及NSF附着蛋白受体（SNARE）蛋白的囊泡介导的胞吐，我们使用由两个域组成的融合肽TAT–NSF700：一个11 aa HIV反式激活调节蛋白（TAT）域融合到一个22 aa NSF域(Matsushita等人，2005年;Morrell等人，2005年). 用TAT–NSF700（5μ米)ATP刺激前60分钟。对照组使用具有相同氨基酸组成但具有打乱序列TAT–NSF700scr（5μ米)ATP刺激前60分钟。TAT–NSF融合肽来自Anaspec（1000×PBS）。TAT–NSF700融合肽序列为YGRKKRRQR-GGG-LLDYVPIGPRFSNLVLQALLVL，TAT–NSF700scr序列为YGLKKRRRR-GGG-IPPVYFSRLDLVVLLAQL。

为了研究ATP刺激后小胶质细胞释放的BDNF是否有助于小胶质细胞内BDNF表达的增加，在ATP刺激前立即用BDNF螯合融合蛋白TrkB-Fc（5μg/ml；20×PBS）处理细胞。对照组给予融合肽IgG-Fc（5μg/ml；20×PBS）。TrkB-Fc和IgG-Fc来自研发系统。

使用p38-MAPK抑制剂4-（4-氟苯基）-2-（4-甲基亚磺酰基苯基）-5-（4-吡啶基）1研究p38-MAPPK的参与H（H）-咪唑（SB203580）（10μ米; 西格玛；1000×DMSO）和阴性对照物4-乙基-2（对甲氧基苯基）-5-（4′-吡啶基）-IH（H）-咪唑（SB202474）（10μ米; 钙生物化学；1000×二甲基亚砜）。2-（2-氨基-3-甲氧基苯基）-4抑制细胞外信号调节蛋白激酶（ERK）的活性H（H）-1-苯并吡喃-4-酮（PD98059）（5μ米; 西格玛；1000×二甲基亚砜）。蒽[1,9-cd]吡唑-6（2H（H）)-一个（SP600125）（5μ米; 钙生物化学；1000×二甲基亚砜）。对照组在无ATP刺激的情况下接受SB203580、SB202474、PD98059或SP600125。

用小干扰RNA抑制P2X4R表达。

按照制造商的说明，用抗P2X4R（Qiagen）的小干扰RNA（siRNA）在转染试剂（Hi-PerFect转染试剂；Qiagen）中转染如上所述制备的原代小胶质细胞培养物。将序列为（1）5′-UACCUUAUUUCUUUUGUCCC-3′，（2）5′-UUGCAGUCCCACUUGAUCU-3′，以及（3）5′-UGGAAAUGUAACU-UUAGGC-3′和（4）5′-VAACUUUAGGGCGG-3′的四个P2X4R siRNA寡聚体合并，并在72小时内转染对照细胞。非靶向siRNA序列为5′-AATTCTCCGAAGTGTCACGT-3′；该序列与任何已知哺乳动物基因（Qiagen）没有同源性。简单地说，siRNA与转染试剂一起在无血清DMEM中稀释，混合并添加到小胶质细胞培养物中。转染72小时后，收获小胶质细胞并用ATP刺激（如上所述）。通过小胶质细胞裂解物的Western blot分析评估P2X4R蛋白水平，以及P2X4R表达变化对ATP诱发的细胞内Ca的功能影响2+使用荧光钙评估瞬态2+指示剂fura-2 AM（详细说明如下）（参见补充图1，网址为网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。

ELISA法检测培养小胶质细胞释放BDNF。

如前所述，使用BDNF特异性ELISA试剂盒（检测范围为7.8–500 pg/ml）测量小胶质细胞分泌到上清液中的BDNFCoull等人（2005）简单地说，BDNF标准品（7.82–500 pg/ml）和100μl上清液样品一式三份，按照制造商的指示在2°C下培养过夜（Millipore Bioscience Research试剂）。然后清洗样品，并在室温下用生物素化小鼠抗BDNF单克隆抗体孵育3 h。然后用链霉亲和素-HRP结合物孵育1 h。用3,3′，5,5′-四甲基联苯胺底物处理后，样品在450 nm处由分光光度计读板器（分子器件）读取。如果样品的信号高于背景信号并且在标准曲线的范围内，则将其视为BDNF阳性。每次分析都是在PBS和仅ATP的内部对照组存在的情况下进行的，测量结果表明与PBS对照组相比发生了百分比变化。

为了确定是否从小胶质细胞上清液中清除BDNF，将外源性BDNF重组蛋白（25 pg；Abcam）添加到Eppendorf管中，该管含有以下成分：（1）细胞外溶液和小胶质细胞，或（2）单独的细胞外溶液，小胶质细胞已从中去除。在37°C下孵育15分钟后，用磷酸酶抑制剂混合物（2%；西格玛）和广谱蛋白酶抑制剂（2%；西格玛）处理样品。使用BDNF-ELISA测定上清液中的BDNF水平。

Western blotting检测培养小胶质细胞中BDNF蛋白。

分离小胶质细胞后，使用BCA（双钦酸测定）蛋白测定试剂盒（Pierce）测定总蛋白含量。每个实验都会生成总蛋白的标准曲线。样品在95°C下于2×样品缓冲液中加热10 min，该缓冲液由4%十二烷基硫酸钠、20%甘油、0.2%溴酚蓝、100 m米Tris-Cl和断键剂TCEP[三（2-羧乙基）膦]溶液（Pierce）。样品在12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶上电泳，并转移到2μm硝化纤维素膜上。用溶解在PBS-T中的5%牛奶封闭膜，然后用兔抗BDNF（1:1000；Santa Cruz）、兔抗P2X4（1:1500；Alomone）、鼠抗磷酸p38 MAPK（1:1000，Cell Signaling Technology）、鼠抗p38 MAPK（1:1000）或鼠抗β-actin（1:4000；Santa Cruz）孵育过夜。在TBS-T中洗涤后，将膜与适当的HRP结合二级抗体孵育1 h，然后进行增强化学发光检测。为了测试BDNF和P2X4R的抗体特异性，用对照BDNF或P2X4R肽预先吸收抗体。此外，在没有BDNF一级抗体的情况下处理印迹。作为对照，PBS和ATP组同时在每个凝胶中运行，并量化相对于PBS对照表达的BDNF带强度。对于密度定量，免疫印迹在平板扫描仪上数字化，数字图像使用Image J分析软件定量[美国国立卫生研究院（NIH）]。使用已知浓度的大鼠脑小胶质细胞裂解物蛋白和所用抗体的线性检测范围生成标准曲线稀释系列。只有线性范围内的值才纳入最终分析。Western blot分析比较了未经ATP或其他刺激的原代培养的小胶质细胞和健康大鼠脑的全匀浆中BDNF的表达，结果表明，全脑匀浆中归一化为总蛋白的BDNF比小胶质细胞裂解液中的大约80%。

细胞内钙的荧光测量2+小胶质细胞。

如上所述制备培养中的原代小胶质细胞并转移到标准聚乳酸-我-赖氨酸涂层盖玻片并允许其粘附24小时。记录前，在室温下用荧光钙培养细胞30分钟2+指示染料fura-2 AM（2.5μ米; Invitrogen）在含有140 m的细胞外记录溶液中米氯化钠，5.4米米KCl，1.3米米氯化钙2，10米米HEPES和33 m米葡萄糖，pH 7.35，渗透压315–320 mOsm。荧光团负载后，用缺乏fura-2 AM的细胞外溶液彻底冲洗细胞，并将其安装在倒置显微镜上（Diaphot-TMD；Nikon）。所有实验均在室温（20–22°C）下进行。对于ATP实验，5 s的ATP应用（50μ米)用微量移液管激发钙离子2+单个小胶质细胞的反应。对于A23187和thapsigargin实验，药物通过浴在细胞外记录溶液中施用。如前所述(Salter和Hicks，1995年)激发光由75 W氙弧灯产生，交替通过340或380 nm带通滤波器（欧米茄光学）。发射的光被引导通过510nm带通滤波器，并且光被光电倍增管检测器收集。数据由计算机以约2.5/s的速度采集，并存储在硬盘上。减去基线后，计算340 nm激发的发射光与380 nm激发发射光的荧光比率。初始荧光比（ΔF类/F类)已脱机计算。Ca的硬件和软件2+测量结果来自光子技术国际。

量化和统计。

使用Image J分析软件（NIH）对蛋白质印迹进行分析，以量化条带强度，并将数据归一化为PBS或载体对照。对于Western blots和BDNF ELISA，通过单因素方差分析（ANOVA）和学生-纽曼-基尔斯（Student–Newman–Keuls）来确定治疗组之间的统计显著性事后（post-hoc）测试各组之间的多重比较（Prism 2；GraphPad软件）。n个这份手稿中报告的数值代表了独立的实验。所有数据均表示为平均值±SEM。第页<0.05被认为是显著的。

结果

已经证明，通过鞘内急性给药原代培养的小胶质细胞，在幼稚动物中诱发疼痛超敏反应，与外周神经损伤后产生的疼痛超敏反应相当，其中P2X4Rs通过应用ATP刺激(Tsuda等人，2003年)导致BDNF的释放(Coull等人，2005年). 因此，我们使用在相同原代培养条件下制备的小胶质细胞来研究P2X4R刺激释放BDNF的细胞内机制。我们首先通过在添加ATP（50μ米) (图1). 我们发现，与PBS对照组相比，上清液中BDNF的水平在添加ATP后5分钟和60分钟显著增加，表明ATP刺激引起BDNF释放的两个不同阶段(图1一). BDNF在每5分钟和60分钟达到峰值后的下降归因于细胞外空间的降解，外源性BDNF添加到含有或不含小胶质细胞的上清液中后下降了20±11(n个=5）与28±14(n个=5）pg/ml，分别超过15分钟(第页>0.05），足以解释ATP刺激期间内源性释放的BDNF量的清除。加入ATP后小胶质细胞内BDNF水平升高(图1b条). 然而，与释放到上清液中的BDNF相比，细胞中BDNF的水平仅显示出一个单相，在添加ATP后60分钟达到峰值。

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ATP导致大鼠原代小胶质细胞培养物中BDNF的双相释放和BDNF蛋白的增加。一左，基于ELISA的BDNF测量，在添加ATP后的不同时间点释放到上清液中。一，右，代表性BDNF-ELISA标准曲线(R（右）2= 0.97); PBS和ATP的平均BDNF测量值（50μ米)治疗组在5min和60min时的情况如图所示。b条左，添加ATP后小胶质细胞裂解物中BDNF蛋白的Western blot分析。将带强度定量为平均灰度值，并将其标准化为PBS处理的对照。b条右，从初级小胶质细胞裂解物蛋白的系列稀释液中得出的代表性标准曲线(R（右）2= 0.98). 来自小胶质细胞裂解物的BDNF蛋白的代表性蛋白质印迹。在每条通道中，装载35μg蛋白质。每个时间点代表n个= 6–8. 数据表示为PBS处理对照的平均百分比（±SEM）**第页与PBS治疗对照组相比，<0.01。

为了确定添加ATP的效果是否由P2X4R的刺激介导，我们测试了嘌呤受体拮抗剂、TNP–ATP和PPADS，以及P2X4R表达的siRNA抑制(图2). 已知TNP–ATP可阻断P2XR的P2X1-4亚型并逆转外周神经损伤引起的疼痛超敏反应(Tsuda等人，2003年;Coull等人，2005年)，而PPADS阻断P2X1,2,3,5,7Rs，但不阻断P2X4Rs，并且不影响周围神经损伤后的痛觉敏感性(Tsuda等人，2003年). 我们发现在TNP–ATP（10μ米)在5分钟或60分钟的时间点，ATP对上清液中BDNF的水平没有影响(图2一). 此外，在用PBS处理而不添加ATP的对照中，TNP–ATP在这些时候不影响上清液中的BDNF。因此，TNP-ATP阻止了ATP诱发的BDNF的释放。TNP–ATP还可阻止小胶质细胞内ATP诱发的BDNF增加(图2b条)不影响控制BDNF水平。相反，PPADS（10μ米)没有减少ATP诱发的BDNF释放或积累(图2一,b条)PPADS也不影响上清液或细胞中BDNF的控制水平。

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阻断或抑制小胶质细胞P2X4R的表达可减弱ATP诱发的释放和BDNF的积累。一,b条用P2XRs的药理拮抗剂TNP–ATP（50μ米)或PPAD（50μ米).c（c）,d日72h后，用P2X4R靶向siRNA（600 ng）转染小胶质细胞；对照组只接受载体或非靶向siRNA（600 ng）。一,c（c）添加ATP（50μ米)采用基于ELISA的方法进行测量。b条,d日Western blot分析检测加入ATP后60 min BDNF蛋白的表达。将数据归一化为PBS对照，并表示为百分比对照（±SEM）。在siRNA转染实验中，数据被归一化为载体对照。每个实验组代表n个= 4–7. *表示与PBS或车辆控制的显著差异*第页< 0.05; **第页< 0.01.

为了确定抑制P2X4R表达的作用，我们用针对P2X4R的siRNA转染小胶质细胞（5米)或使用不针对P2X4R（5 n）的加扰控制siRNA米). 转染后（72 h），P2X4R siRNA处理细胞中P2X4R蛋白水平为15.7±5.2%(第页<0.05；n个=8），在扰乱的对照siRNA中为98.5±0.8%(n个=6）细胞与车辆处理对照组的P2X4R蛋白水平进行比较。此外，在P2X4R siRNA处理的细胞中，瞬时Ca2+对ATP的反应降低，钙最大值降低2+响应（ΔF/F）为32.6±8.2%(n个=10个细胞）；然而，瞬态Ca2+用干扰对照siRNA转染的细胞对ATP的反应与经载体处理的对照相当（补充图1，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。P2X4R siRNA处理的小胶质细胞中BDNF的基础水平（即不添加ATP）与载体处理的对照组没有差异。因此，用P2X4R siRNA治疗，而不是用打乱的对照siRNA，大大降低了小胶质细胞中功能性PX4R的表达，但不影响BDNF的基本表达。在这些条件下，我们发现P2X4R siRNA阻止ATP诱发的BDNF释放到上清液中(图2c（c）)以及细胞中BDNF的增加(图2d日). 相反，BDNF的释放和积累均不受干扰控制siRNA的影响。总之，我们的研究结果表明，ATP刺激诱发的小胶质细胞释放BDNF及其在小胶质细胞内的积累依赖于P2X4R。此外，似乎没有持续刺激P2X4R，即没有外源性添加ATP，从而驱动BDNF的基础表达或释放。

因为P2X4Rs是Ca可渗透的非特异性阳离子通道2+(Ralevic和Burnstock，1998年;北，2002年)，我们质疑BDNF的释放或积累是否依赖于ATP刺激的细胞内[Ca2+] (图3). 为了验证这一点，我们在含有钙的正常细胞外液中用ATP刺激小胶质细胞2+（2米米)或在不添加钙的细胞外溶液中2+.细胞外钙缺乏2+降低细胞内[Ca的峰值上升2+]对ATP的响应大于85%（补充图1，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。我们发现，在不添加钙的细胞外溶液中，上清液中ATP诱发的BDNF增加的早期和晚期均被消除2+(图3一). 同样，ATP诱导的细胞内BDNF的增加在Ca中被阻断2+-游离细胞外液(图3b条). 因此，细胞外钙2+是ATP引起的BDNF释放和积累所必需的。根据这些发现，我们推断钙的流入2+通过P2X4R是将这些受体的刺激与小胶质细胞中BDNF表达和释放的增加联系起来的关键步骤。

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ATP诱发的BDNF释放和积累依赖于细胞外钙的存在2+.一,b条，小胶质细胞受到ATP（50μ米)在含有钙的细胞外溶液中2+（2米米)或在不添加钙的细胞外溶液中2+.c（c）,d日，小胶质细胞用钙处理2+-离子载体A23187（2μ米)或使用肌浆网/内质网抑制剂thapsigargin（2μ米).一,c（c）基于ELISA的药物治疗后5分钟和60分钟BDNF释放的测量。b条,d日Western blot分析药物治疗60分钟后小胶质细胞裂解物中的BDNF蛋白。在使用A23187的实验中，细胞外溶液中含有TNP–ATP，以通过小胶质细胞释放ATP来防止P2X4R可能的二次激活。将数据归一化为PBS对照，并以PBS对照的平均百分比表示（±SEM）。每个实验组代表n个= 5. *第页< 0.05; **第页与PBS治疗对照组相比，<0.01。

考虑到细胞外钙的需求2+，我们质疑钙的流入2+本身足以引起小胶质细胞中BDNF的释放和积累。为了测试这种可能性，我们使用了Ca2+-离子载体A23187（2μ米)应用于正常的细胞外溶液，引起细胞内[Ca快速持续增加2+]（补充图2c（c），网址为网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。在使用A23187进行的实验中，细胞外溶液中含有TNP–ATP，以通过小胶质细胞释放ATP来防止P2X4R可能的二次激活。我们发现，与PBS对照组相比，A23187在5分钟和60分钟时增加了BDNF在上清液中的释放(图3c（c）). 此外，用A23187治疗60分钟后，小胶质细胞内BDNF蛋白表达随之增加(图3d日). 相反，在不添加Ca的细胞外溶液中2+，A23187不影响上清液中的BDNF水平(图3c（c）)或小胶质细胞内(图3d日). 总之，结果表明细胞外钙的内流2+足以导致BDNF的释放及其在小胶质细胞内的积聚。

确定是否释放钙2+从细胞内储存的BDNF可能导致BDNF的释放和积累，我们使用了一种ER-Ca抑制剂thapsigargin2+-螯合Ca的ATP酶2+在ER商店。thapsigargin治疗（2μ米)引起细胞内[Ca迅速升高并持续增加2+]小胶质细胞（补充图2b条，网址为网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。然而，尽管细胞内[Ca增加2+]thapsigargin对释放没有影响(图3c（c）)或BDNF在小胶质细胞中的表达(图3d日). 同样，用谷氨酸（100μ米)（补充图3，网址：网址：www.jneurosci.org作为补充材料）或脂多糖（1μg/ml），这两种物质都会导致Ca的释放2+来自小胶质细胞的ER储存(Bader等人，1994年;D'Antoni等人，2008年). 因此，与细胞外钙内流相反2+，钙的释放2+内质网储存不足以引起BDNF的释放或其在小胶质细胞中的积聚。

然后我们讨论了刺激P2X4R释放的BDNF是来自预先存在的池还是依赖于从头开始的蛋白质的合成。我们用转录抑制剂放线菌素D（1μ米)或与平移抑制剂环己酰亚胺（1μ米). 当用不含ATP的PBS处理小胶质细胞时，这两种抑制剂都不影响上清液中BDNF的水平(图4一). 此外，添加ATP后5分钟上清液中BDNF的增加不受放线菌素D或放线菌酮的影响。相反，在添加ATP 60分钟后，这些药物都阻止了BDNF上清液水平的增加(图4一)并阻止了细胞中BDNF蛋白的伴随增加(图4b条). 由于ATP诱发的BDNF释放的早期阶段对放线菌素D和环己酰亚胺具有耐药性，因此这一阶段似乎可归因于已合成BDNF池的释放。然而，P2X4R刺激的BDNF释放的晚期及其在小胶质细胞中的积累是通过BDNF的转录和翻译介导的。

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抑制转录或翻译可防止ATP诱发的BDNF释放的晚期以及BDNF蛋白的伴随增加。用转录抑制剂放线菌素D（1μ米)或翻译抑制剂环己酰亚胺（1μ米).一基于ELISA的ATP刺激后5分钟和60分钟BDNF释放的测量。b条，ATP刺激后60分钟小胶质细胞中BDNF蛋白的Western blot分析。数据表示为PBS处理对照的平均百分比（±SEM）。每个实验组代表n个= 5. **第页与PBS治疗对照组相比，<0.01。

我们研究了BDNF的释放是否可能是通过胞吐，因为已知小胶质细胞表达SNAP-23(Hepp等人，1999年)与非神经元细胞的胞吐有关(Castle等人，2002年;Montana等人，2006年). SNAP和SNARE介导的胞吐依赖于蛋白质NSF，一种作为六聚体的ATP酶(Lowenstein和Tsuda，2006年). NSF结构域2的23 aa肽（NSF700–722）干扰NSF六聚体化，从而抑制ATP酶活性。已知细胞中的胞吐作用被膜透性形式TAT–NSF700抑制，该形式由与HIV TAT蛋白（TAT）的11个氨基蛋白转导结构域融合的NSF700–722组成(Morrell等人，2005年). 已知一种NSF700–722序列被打乱的对照肽（TAT–NSF700scr）不抑制SNARE介导的胞吐(Morrell等人，2005年). 我们发现服用TAT–NSF700（5μ米)在ATP刺激前1小时开始，在5分钟时阻止BDNF释放到上清液中，而TAT–NSF700scr（5μ米)没有效果(图5一). TAT–NSF700和TAT–NSF700scr均不影响仅接受PBS的小胶质细胞上清液中BDNF的水平(图5一)在ATP刺激5分钟后，这两种药物均未影响小胶质细胞内BDNF的水平（数据未显示）。此外，细胞内[Ca升高2+]由ATP诱发的反应不受TAT–NSF700或TAT–NS F700scr的影响（补充图4，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。因此，我们的研究结果表明，预先存在的BDNF的释放本身是通过SNARE介导的胞吐作用实现的。

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ATP诱发的小胶质细胞BDNF释放可通过抑制SNARE介导的胞吐来阻止，BDNF-TrkB信号不需要在小胶质细胞内积累BDNF。用TAT–NSF700（5μ米)SNARE介导的胞吐抑制剂，或控制肽TAT–NSF700scr（5μ米)ATP刺激前60分钟。一基于ELISA的ATP刺激后5分钟和60分钟BDNF释放的测量。b条，ATP刺激后60分钟小胶质细胞中BDNF蛋白的Western blot分析。c（c）在ATP刺激后60分钟，用BDNF-寻求蛋白TrkB-Fc（5μg/ml）或对照肽IgG-Fc（5ug/ml）处理的小胶质细胞裂解液中BDNF蛋白的Western blot分析。数据归一化为PBS对照，并以PBS对照的平均百分比表示（±SEM）。TAT–NSF实验代表n个=每个实验组6个。TrkB-Fc实验代表n个=每个实验组4个*第页< 0.05; **第页< 0.01; ***第页与PBS治疗的对照组相比<0.001。

TAT–NSF700也阻止了60分钟ATP刺激的BDNF释放，但TAT–NS F700 scr没有阻止BDNF的释放(图5一); 这两种方法都不影响60分钟PBS处理后上清液中的BDNF水平。此外，TAT–NSF700显著增加了60分钟ATP刺激下小胶质细胞中BDNF的积累，但TAT–SNF700scr对这种积累没有影响(图5b条). 仅用PBS处理的细胞内BDNF水平不会因TAT–NSF700或TAT–NS F700 scr处理而改变。总的来说，这些发现表明，与先前存在的BDNF的释放一样，ATP刺激的新合成的BNDF的释放是通过SNARE介导的胞吐作用进行的。

由于小胶质细胞可能表达TrkB，即BDNF的同源受体，我们质疑释放的BDNF是否通过涉及自分泌前馈信号的机制促进小胶质细胞内BDNF表达的增加(Canossa等人，1997年). 因此，我们检测了BDNF-寻求融合蛋白TrkB-Fc的作用(Mannion等人，1999年). 我们发现，在用TrkB-Fc（5μg/ml）或对照IgG-Fc（6μg/ml(图5c（c）). 此外，在仅用PBS处理的未刺激的小胶质细胞中，TrkB-Fc和IgG-Fc都不影响BDNF的基础水平。总之，这些发现表明，在ATP刺激过程中，释放的BDNF不会向小胶质细胞发出信号，导致BDNF在细胞内积聚。

接下来我们研究了P2X4R刺激导致BDNF释放和合成的细胞内信号通路。MAPK家族成员p38-MAPK是一种与周围神经损伤后疼痛超敏反应相关的候选分子：周围神经损伤导致小胶质细胞而非背角神经元或星形胶质细胞中p38-MAPPK的激活，并且这种激酶的药理学抑制既能逆转又能防止疼痛超敏反应的诱导(Jin等人，2003年;Tsuda等人，2004年;庄等人，2007). 因此，我们想知道p38-MAPK是否是P2X4R刺激小胶质细胞释放或合成BDNF的细胞内介质。为此，我们测试了p38-MAPK抑制剂SB203580及其非活性类似物SB202474。我们发现SB203580（10μ米)在ATP后5分钟和60分钟阻止BDNF的释放，并阻止细胞中BDNF表达的增加(图6). SB202474（10μ米)对ATP诱发的BDNF的释放或积累均无影响。此外，SB203580和SB202474均不影响对照组、PBS处理的小胶质细胞中BDNF的释放或水平。因此，p38-MAPK活性对于P2X4R刺激诱发的BDNF的释放和合成似乎是必要的。相比之下，MAPK家族其他两个成员MEK/ERK和JNK的活性似乎没有必要，因为这些激酶的抑制剂PD98059和SP600125分别对BDNF的释放或表达没有影响（补充图5，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。

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用p38 MAPK SB203580治疗抑制ATP诱发的BDNF释放和合成。用p38-MAPK抑制剂SB203580（10μ米)或其非活动模拟SB202474（10μ米).一基于ELISA的ATP后5分钟和60分钟BDNF释放的测量（50μ米)刺激。b条，ATP刺激后60分钟小胶质细胞中BDNF蛋白的Western blot分析。数据表示为PBS处理对照的平均百分比（±SEM）。每个实验组代表n个= 5. *第页< 0.05; **第页与PBS治疗对照组相比，<0.01。

为了研究p38-MAPK在从P2X4Rs到BDNF释放和表达的信号通路中是允许的还是指导性的，我们测量了磷酸化p38-MAPPK的水平，即该激酶的活性形式(Chang和Karin，2001年). 我们发现，向小胶质细胞中添加ATP可以增加磷酸化p38-MAPK的水平，而不会改变p38-MAPPK蛋白的总表达(图7一). ATP在60分钟时诱导磷酸化p38 MAPK水平显著增加，但在5分钟时没有显著增加，抑制p38 MAPK在这两个时间点阻断BDNF的释放。因此，基础p38 MAPK活性可能有助于ATP诱发BDNF释放的早期阶段。TNP–ATP（10μ米)但不是通过PPADS（10μ米)表明ATP的作用是由P2X4Rs介导的(图7b条). 此外，在不添加钙的细胞外溶液中应用ATP时，磷酸化p38-MAPK没有增加2+(图7c（c）). 此外，用A23187（2μ米)模拟ATP诱发的磷酸化p38 MAPK增加(图7d日)而thapsigargin（2μ米)对磷酸化p38 MAPK水平无影响(图7d日). 总之，我们认为钙激活p38-MAPK2+通过P2X4R的内流介导BDNF释放和表达的增加。

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TNP–ATP、SB203580或在不含Ca的细胞外溶液中可阻止ATP诱导的p38-MAPK激活2+.一ATP（50μg）后5 min和60 min小胶质细胞裂解物中磷酸化p38-MAPK表达的Western blot分析米)刺激。b条P2XR拮抗剂的作用，PPADS（50μ米)或TNP–ATP（50μ米)和p38-MAPK抑制剂SB203580（10μ米)ATP刺激后60分钟，磷酸化p38-MAPK水平。c（c），磷酸-p38-MAPK在含有Ca的细胞外溶液中的表达2+（2米米)或在不添加钙的细胞外溶液中2+ATP刺激后60分钟。d日、钙处理效果2+-离子载体A23187（2μ米)或肌浆网/内质网抑制剂thapsigargin（2μ米)治疗后60分钟磷酸化p38-MAPK的表达。将数据归一化为PBS对照，并表示为百分比对照（±SEM）。每个实验组代表n个= 5. *第页与PBS治疗对照组相比，<0.01。

讨论

在本研究中，我们已经确定了小胶质细胞P2X4R激活导致BDNF释放的细胞内信号机制中的关键步骤。对我们的发现最简约的解释是钙的流入2+通过P2X4R导致p38-MAPK激活，随后导致BDNF自身SNARE依赖性释放增加，BDNF合成增加(图8).

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ATP诱发的小胶质细胞BDNF释放和合成的模型。ATP刺激P2X4R导致SNARE介导的BDNF释放和合成，BDNF依赖于细胞外钙2+p38-MAPK的激活。释放的早期阶段来自预先存在的BDNF池，而BDNF释放的晚期和小胶质细胞中BDNF的积累依赖于从头开始的BDNF。

TNP–ATP阻断ATP诱发的BDNF释放和积累，加上对PPADS的耐药性，是P2X4R介导的反应的药理学特征(Khakh等人，2001年;Tsuda等人，2003年). 此外，我们发现用siRNA抑制P2X4R表达可以抑制ATP对BDNF的影响。因此，我们的研究结果共同提供了强有力的证据，证明ATP刺激的BDNF释放和积累需要激活P2X4R。小胶质细胞表达其他几个嘌呤受体亚型，包括P2X7R、P2Y1R、P2Y2R、P2Y-6R和P2Y12R(Färber和Kettenmann，2006年;井上，2006). 这些其他嘌呤受体均不受TNP的影响–ATP和P2X7Rs，P2Y1Rs、P2Y2Rs和P2Y6Rs在本研究中使用的浓度下均被PPADS阻断(Ralevic和Burnstock，1998年;加拉赫和索尔特，2003年)表明这些其他嘌呤受体均不足以介导ATP诱发的BDNF释放和积累。

P2X4R是对Ca具有渗透性的非选择性阳离子通道2+(北，2002年)我们证明细胞外钙2+是P2X4R刺激释放预先存在和新合成的BDNF所必需的。此外，Ca的受体非依赖性内流2+，但不释放Ca2+细胞内储存的BDNF足以引起BDNF的释放。钙2+依赖性是胞吐释放的标志，我们发现TAT–NSF700治疗可消除P2X4R刺激的BDNF释放的早期和晚期。与释放阻断一致，与未经TAT–NSF700处理的细胞相比，经TAT-NSF700治疗的小胶质细胞中P2X4R刺激的BDNF表达增加更大。基于这些发现，我们得出结论，P2X4R刺激的小胶质细胞释放BDNF涉及Ca2+-和SNARE依赖性细胞外途径。以前还没有在小胶质细胞中建立SNARE依赖性胞吐，但我们的结论与SNARE蛋白SNAP-23、syntaxin-1和cellubrevin在小胶质瘤细胞中表达的证据一致(Hepp等人，1999年).

与P2X4R刺激的BDNF释放相反，在小胶质细胞上清液中检测到的基本BDNF水平并不依赖于（1）细胞外Ca内流2+，（2）钙的释放2+从细胞内储存，（3）P2X4Rs，（4）转录，（5）翻译，（6）p38 MAPK、ERK或JNK信号，或（7）SNARE依赖性胞吐。因此，BDNF的基础水平似乎不是分泌，而是由于小胶质细胞培养物采集固有方法的背景。一个重要的暗示是钙的基础水平2+-与刺激P2X4R释放的BDNF水平相比，SNARE依赖性胞吐可忽略不计。

钙2+-BDNF的依赖性释放在神经元中最为明显，神经营养素储存在大的致密核小泡中(Altar和DiStefano，1998年)并从突触前终末和突触后树突释放(Balkowiec和Katz，2002年;Kolarow等人，2007年). 在神经末梢，去极化触发的BDNF释放依赖于钙2+通过电压门控Ca流入2+以及钙的释放2+来自细胞内储存(Lever等人，2001年;Buldyrev等人，2006年). 突触后树突释放BDNF也由钙内流介导2+通过打开NMDA受体或电压门控钙启动2+通道(Kolarow等人，2007年). 细胞内钙的作用2+然而，BDNF突触后释放的储存取决于刺激的类型，因为高钾触发的释放需要细胞内钙2+商店(Kolarow等人，2007年;Kuczewski等人，2008年)但由反向传播动作电位或持续的突触活动触发的反应并不依赖于钙2+商店(Kuczewski等人，2008年). 目前，我们发现刺激细胞内Ca的释放2+用他司加金不会引起小胶质细胞分泌BDNF。因此，小胶质细胞BDNF的分泌可能独立于细胞内钙2+因此，类似于神经元中由反向传播动作电位驱动的BDNF突触后释放。P2X4R刺激的小胶质细胞释放BDNF依赖于p38-MAPK的激活。蛋白激酶参与BDNF释放并非没有先例，因为BDNF的去极化释放依赖于神经元中的CaMKII和蛋白激酶A(Kolarow等人，2007年;Kuczewski等人，2008年).

除了导致BDNF释放外，P2X4R刺激还增加了小胶质细胞中的BDNF水平。P2X4R刺激增加了BDNF的积累和释放，表明这种积累是从头开始的合成BDNF，而不是减少肽的基础释放。对从头开始的通过用转录抑制剂放线菌素-D或翻译抑制剂环己酰亚胺处理证实了这种合成，每种抑制剂都阻止了小胶质细胞中BDNF的积累。放线菌素D的作用表明需要通过激活P2X4R来刺激转录。与此相一致，我们有证据表明，ATP给药增加了培养的小胶质细胞中BDNF mRNA的表达（T.Trang、M.Marchese、M.Fahnestock和M.W.Salter，未发表的观察结果）。

BDNF最初在神经元中被鉴定为一种即时早期基因(Lauterborn等人，1996年;West等人，2001年)，其转录由钙启动2+通过L型电压门控钙的流入2+通道或通过NMDA受体(Ghosh等人，1994年;Tao等人，1998年;Kolarow等人，2007年). 因此，我们的发现表明钙2+-BDNF转录的依赖性刺激在神经元和小胶质细胞中是常见的。在神经元中，刺激诱发的Ca增加2+已证明激活与BDNF基因表达上调相关的关键转录因子，包括cAMP反应元件结合蛋白(Tao等人，1998年)和核因子kappaB(Lipsky等人，2001年;Marini等人，2004年). 细胞内[Ca升高2+]也有报道称，通过去抑制甲基-CpG-结合蛋白2（一种抑制BDNF基因表达的蛋白）来增加BDNF转录(Chen等人，2003年;Zhou等人，2006年). 目前发现的P2X4R刺激的小胶质细胞BDNF转录增加是否涉及这些转录因子或其他转录因子，尚不确定。

ERK和p38-MAPK信号通路上调BDNF的神经表达(吉和伍尔夫，2001;Obata等人，2004年;Rao等人，2007年). 脊髓小胶质细胞中这些通路的激活已被证明有助于神经损伤大鼠神经病理性疼痛行为的发展(Jin等人，2003年;Tsuda等人，2004年). 目前，我们发现ERK抑制剂PD98059对BDNF的释放或积累没有影响，表明小胶质细胞P2X4R–BDNF信号通路中不需要ERK。相反，p38-MAPK抑制剂SB203580的治疗不仅阻止了P2X4R诱发的BDNF合成增加，而且还阻断了BDNF释放的早期阶段。这一发现意味着ATP激活p38-MAPK对于BDNF从预先存在的池中释放是必要的，并且与Ca一起2+早期释放的依赖性，一个机械上简单的解释是Ca2+诱导p38-MAPK激活，进而刺激BDNF释放。钙2+-p38-MAPK的依赖性激活已在多种细胞类型中得到证实(毛毯，2000;Dehez等人，2001年)包括免疫细胞(Kreideweiss等人，1999年;Elzi等人，2001年;Shigemoto-Mogami等人，2001年). 然而，文献中没有证据表明p38-MAPK参与了细胞释放肽的过程，因此，另一种可能性是p38-MAPPK的激活对Ca是允许的2+-依赖性BDNF释放。

总之，我们发现ATP刺激P2X4R可导致SNARE介导的BDNF释放和合成，BDNF依赖于细胞外钙2+p38-MAPK的激活。通过证明p38 MAPK是刺激小胶质细胞P2X4Rs引起的BDNF释放的细胞中介，本研究结果为观察到神经性疼痛行为的持续表达需要P2X4Rs的激活提供了一个统一的机制(Tsuda等人，2003年;Coull等人，2005年;Ulmann等人，2008年)和p38-MAPK(Jin等人，2003年;Tsuda等人，2004年;庄等人，2007). 因此，这些结果统一了先前看似不同的发现，并指出小胶质细胞中P2X4Rs和p38-MAPK的信号传导对于BDNF参与周围神经损伤后的疼痛行为至关重要。因此，以脊髓小胶质细胞中的P2X4R–p38–MAPK信号通路为靶点，可能有助于开发治疗神经损伤引起的疼痛超敏反应的新治疗方法。此外，周围神经损伤后报告的小胶质细胞P2X4R参与在其他CNS病理模型中越来越多，如炎症(郭等，2005;Zhang等人，2008年)，CNS损伤(Schwab等人，2005年;Zhang等人，2006年)和胶质母细胞瘤脑肿瘤(郭等，2004). 因此，我们的研究结果可能不仅适用于病理性疼痛状态，也适用于多种中枢神经系统疾病。

脚注

这项工作得到了加拿大卫生研究院（CIHR；拨款编号MT-11219）和加拿大神经科学脑修复计划对M.W.S.的资助。M.W.S.是霍华德·休斯医学研究所的国际研究学者，并担任加拿大神经可塑性和疼痛研究主席（一级）。T.T.得到了CIHR奖学金的支持。我们感谢Ron Bouchard对该项目的技术投入，感谢Janice Hicks对这份手稿的有益评论以及对小胶质细胞培养的帮助。

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文章来自神经科学杂志由以下人员提供神经科学学会