《分子医学杂志》（柏林）。作者手稿；PMC 2013年3月4日提供。
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PMCID公司：项目经理3587336
NIHMSID公司：美国国立卫生研究院44403
衰老损害骨髓源性血管生成细胞在烧伤创面的动员和归巢
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和 张贤杰
亨德里克斯·伯恩实验室，外科，约翰·霍普金斯湾景医疗中心，巴尔的摩，马里兰州21224，美国
卡卡利·萨卡尔
美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院细胞工程研究所血管项目，邮编：21205
美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院医学系，邮编：21205
塞尔吉奥·雷伊
美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院细胞工程研究所血管项目，邮编：21205
美国马里兰州巴尔的摩约翰·霍普金斯大学医学院麦库西克·纳桑遗传医学研究所，邮编：21205
劳尔·塞巴斯蒂安
亨德里克斯·伯恩实验室，外科，约翰·霍普金斯湾景医疗中心，巴尔的摩，马里兰州21224，美国
埃夫斯塔提亚·安德里科波卢奥
亨德里克斯·伯恩实验室，外科，约翰·霍普金斯湾景医疗中心，巴尔的摩，马里兰州21224，美国
盖伊·P·马蒂
亨德里克斯·伯恩实验室，外科，约翰·霍普金斯湾景医疗中心，巴尔的摩，马里兰州21224，美国
凯伦·福克斯·塔尔博特
美国马里兰州巴尔的摩市约翰斯·霍普金斯大学医学院病理学系21205
格雷格·塞门扎
美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院细胞工程研究所血管项目，邮编：21205ude.imhj@aznemesg
美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院儿科、肿瘤学、放射肿瘤学和生物化学系，邮编21205
美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院医学系，邮编：21205
美国马里兰州巴尔的摩约翰·霍普金斯大学医学院麦库西克·纳桑遗传医学研究所，邮编：21205
张贤杰，亨德里克斯·伯恩实验室，外科，约翰·霍普金斯Bayview医疗中心，巴尔的摩，MD 21224，美国；
通讯作者。 出席地址：中国首都医科大学北京天坛医院外科X.Zhang科室
摘要
老年人伤口愈合受损是一个主要的临床问题。阐明衰老损害伤口愈合的细胞和分子机制，可能有助于开发出针对未愈合伤口的老年患者的改进治疗策略。新生血管化是创伤愈合的关键步骤，骨髓源性血管生成细胞（BMDAC）在血管化过程中起着重要作用。使用小鼠全层烧伤模型，我们证明烧伤伤口的灌注和血管化因衰老而受损，并与携带细胞表面分子CXCR4和Sca1的BMDAC的动员显著减少有关。基质衍生因子1（SDF-1）是CXCR4的细胞因子配体，在老年小鼠的外周血和烧伤创面中的表达显著降低。低氧诱导因子（HIF）-1α在幼年（2个月龄）而非老年（2岁）小鼠的烧伤创面中表达。当静脉注射年轻供体小鼠的BMDAC时，老年受体小鼠烧伤创面组织的归巢受到损害，而BMDAC供体小鼠年龄对归巢没有影响。我们的研究结果表明，由于HIF-1诱导和SDF-1信号传导受损，衰老会损害BMDAC的动员及其在烧伤创面组织中的归巢，从而损害烧伤创面的血管生成。
关键词：烧伤创面愈合、衰老、新生血管、骨髓源性血管生成细胞、缺氧诱导因子1、基质衍生因子1
介绍
有效管理烧伤是一个重大的公共卫生问题。每年有一百多万美国人因烧伤需要治疗[1]. 美国老年人口（65岁或以上）增长迅速，约占烧伤病房入院人数的15%[2]. 人类和小鼠的伤口愈合因衰老而受损[三–5]. 虽然对烧伤伤口的研究较少，但老年人的烧伤与发病率和死亡率增加有关[6]. 了解衰老影响烧伤创面愈合的细胞和分子机制将有助于改善老年人烧伤的管理。
新生血管是创伤愈合过程的重要组成部分，通过血管生成和血管生成发生[7]. 血管生成是指从伤口组织中预先存在的血管中萌生新的毛细血管，而血管生成则是指从创伤外部招募参与新生血管形成的细胞。衰老延缓血管形成，从而导致伤口延迟愈合[8]. 血管化由关键血管生成因子和细胞因子的低氧诱导表达触发，包括血管内皮生长因子（VEGF）和基质衍生因子1（SDF-1；也称为CXCL12）。VEGF编码基因的转录激活[9]和SDF-1[10]由缺氧诱导因子1（HIF-1）介导，HIF-1是缺氧/缺血适应性反应的主调节器[11]. HIF-1是一种异二聚体，由组成性表达的HIF-1β亚单位和O2-调节HIF-1α亚单位[12]. 与切除伤口相比，烧伤伤口的特征是HIF-1α水平降低[13].Hif1a型+/–编码HIF-1α的基因座为空（敲除）等位基因杂合的小鼠，其烧伤创面愈合受损，这与烧伤创面组织中HIF-1β和SDF-1表达诱导受损有关[14].
血管生成因子和细胞因子（如VEGF和SDF-1）通过与近端和远端细胞上的同源受体（分别为VEGFR1/VEGFR2和CXCR4）结合来介导生物效应。近端细胞是现有伤口血管中的内皮细胞，被激活以启动血管生成。远端细胞包括一群骨髓源性血管生成细胞（BMDACs），这些细胞从骨髓和其他组织动员到循环中并回到伤口，在那里它们可以分化为内皮细胞，从而参与血管生成或产生血管生成因子，从而刺激血管生成[15]. BMDAC表达祖细胞标记物（如Sca1）和受体（如CXCR4），以确定它们对哪些血管生成细胞因子（如SDF-1）作出反应。尽管BMDAC最初被描述为内皮祖细胞，但最近的证据表明大多数是促血管生成的髓样细胞[16].Hif1a型+/–小鼠Sca1动员受损+/CXCR4系列+BMDAC对烧伤的反应[14]注射编码组成活性形式HIF-1α的腺病毒足以诱导BMDAC动员并促进伤口愈合[17].
在本研究中，我们使用了一种小鼠模型，该模型可产生直径和深度可重复的烧伤创面[18]探讨衰老对C57BL/6和129株小鼠烧伤创面愈合过程中血管生成的影响。在这两种菌株中，老化对伤口灌注和血管形成有显著影响。我们证明，老化会损害BMDAC动员和归巢、SDF-1血清蛋白水平以及烧伤创面HIF-1α和SDF-1的表达。这些结果为年龄相关性烧伤创面愈合障碍提供了细胞和分子基础。
材料和方法
老鼠
C57BL/6J和129S1/SvImJ雄性小鼠从杰克逊实验室（缅因州巴尔港）获得。年轻人和老年人的年龄分别为2个月和2岁。所有涉及小鼠的程序都得到了约翰霍普金斯大学动物护理和使用委员会的批准。
烧伤模型
小鼠通过腹腔注射氯胺酮（100 mg/kg）和甲苯噻嗪（10 mg/kg）麻醉，背部刮毛，并用奈尔乳膏脱毛（新泽西州普林斯顿Church&Dwight Co.）。最初在大鼠中建立的烧伤创面方案[19]然后适应老鼠[18]，已被利用。简单地说，将一根定制的220-g铝棒在100°C水浴中加热5分钟。在动物背部产生两处直径为1.2-cm的烧伤，总计约占身体总表面积的10%。为了确保燃烧均匀性，只有杆的重量才能向皮肤表面提供压力。选择用节拍器测量4s的接触时间，以产生标准化的全层烧伤。烧伤后1h内腹腔注射生理盐水，按照Parkland配方（4ml/kg×%受伤体表面积）进行液体复苏。在头24小时内，皮下注射丁丙诺啡（0.1 mg/kg）用于镇痛。
伤口面积测量
在第0天、第3天、第7天、第14天和第21天，在透明醋酸纤维纸上原位追踪伤口边界。图像以600 dpi进行数字化（Paperport 6000，Visioner，Fremont，CA）。使用Adobe Photoshop CS3 Image软件（加利福尼亚州圣何塞市Adobe Systems Inc.）计算伤口面积（像素）。烧伤后第0天的创面面积为100%。
激光多普勒灌注成像
伤口区域的血流由632.6-nm氦氖扫描激光多普勒成像设备（英国德文郡摩尔仪器公司）测量，该设备利用近红外激光二极管测量皮下血流，作为运动红细胞光散射的函数。扫描仪位于每只动物上方70厘米处，进行扫描以评估伤口的血流。对于每个测量点，都会生成一个信号，该信号与组织灌注成线性比例，组织灌注定义为血细胞速度和浓度的乘积。该信号称为激光多普勒灌注指数（LDPI），在计算机屏幕上以二维彩色图像表示。同时生成了一张摄影数字图像，可以对相应的烧伤区域进行直接的解剖比较。对于每次烧伤，在将图像导出到软件包LDISOFT（Lisca Development AB，Lisca，Sweden）后，通过选择感兴趣的区域来选择伤口部位。然后，计算该感兴趣区域内的平均LDPI值。
流式细胞术
CXCR4的百分比+/Sca1类+如前所述，通过流式细胞术测定外周血中的细胞[20]. 采集非烧伤和烧伤小鼠的血液样本，并进行红细胞裂解和FC类封锁（CD16/CD32，BD Pharmingen，加利福尼亚州圣地亚哥）。单核细胞与藻红蛋白结合的抗CXCR4单克隆抗体（2B11/CXCR4，BD Pharmingen）和FITC-结合的抗Sca1单抗（E13-161.7，BD Farmingen）孵育。对正向和侧向散射窗口中的活细胞数进行门控，并根据150000例事件确定双阳性细胞的百分比。
定量实时逆转录PCR
使用TRIzol（Invitrogen）从小鼠非烧伤皮肤和烧伤创面提取总RNA，在异丙醇中沉淀，并根据制造商的方案用DNase I（Ambion）处理。使用iScript cDNA合成系统（加利福尼亚州Hercules的BioRad实验室）对1微克总RNA进行反转录。使用iQ SYBR Green Supermix和iCycler实时PCR检测系统（BioRad实验室）进行实时PCR。使用Beacon Designer软件设计引物，并通过离解曲线分析确定其特异性。根据比较Δ计算SDF-1 mRNA相对于次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1 mRNA的表达C类T型方法[21].
血清SDF-1酶联免疫吸附试验
根据制造商的说明，使用SDF-1α小鼠Quantikine®酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（明尼苏达州明尼阿波利斯研发系统公司）对血清中的小鼠SDF-1蛋白进行定量。
免疫印迹分析
如前所述，在第2天从小鼠背部烧伤和非烧伤皮肤上采集组织样本[14]. 蛋白裂解物在含有完整蛋白酶抑制剂（印第安纳波利斯罗氏诊断公司）的RIPA缓冲液中制备，并通过SDS/PAGE进行分离。抗-HIF-1α抗体来自Novus Biologicals（Littleton，CO）。
免疫组织化学
烧伤创面的边缘是正常皮肤。用免疫组织化学锌固定剂（不含福尔马林；BD Pharmingen）固定标本24小时，并制备5μm厚的石蜡切片。为了防止非特异性结合，将含有2%正常兔血清的100μl封闭溶液（Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA）涂敷30分钟，然后在室温下将100μl初级抗CD31抗体（1:50稀释；BD Pharmingen）涂敷于切片上1小时。用生物素化二级抗体进一步培养切片（1:500稀释；加利福尼亚州伯林盖姆Vector Laboratories）。链亲和素-生物素-辣根过氧化物酶用于信号放大，二氨基联苯胺用于染色（Vector Laboratories）。用苏木精和核固红进行反染色，各30 s。用于阻断内源性过氧化物酶活性，3%H2O（运行）2（Fisher Scientific，新泽西州Fair Lawn）。所有载玻片均以盲法检查。CD31型+在烧伤后21天采集的标本中，在上皮细胞正下方的伤口中心每200×场计数血管数。我们之前已经证明，对血管内皮细胞表达的CD31或血管周细胞表达的α-平滑肌肌动蛋白进行染色，都能得到类似的结果[14]这表明CD31是愈合伤口内血管的合适标记物。
对于CXCR4免疫组织化学，在切片脱蜡后进行热诱导抗原回收。内源过氧化物酶活性通过在3%H中孵育而被阻断2O（运行）2用兔抗CXCR4（1:150，Abcam，Cambridge，MA）一级抗体孵育切片。随后使用Super PicTure聚合物检测试剂盒（Invitrogen，Carlsbad，CA）和二氨基联苯。切片用苏木精复染。
BMDAC文化
BMDAC的制备如前所述[22]. 骨髓取自小鼠股骨和胫骨。用Histopaque 1083（密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich）分离单核细胞组分。将细胞接种到涂有卵磷脂的6孔板（Corning，Lowell，MA）上，并在内皮细胞基础培养基中培养，补充有VEGF、成纤维细胞生长因子-2、胰岛素样生长因子-1、表皮生长因子、氢化可的松、庆大霉素、两性霉素-B、5%FBS和抗坏血酸（EGM2-MV；Lonza，Walkersville，宾夕法尼亚州）。BMDAC培养4天。第3天用磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗细胞培养物，以去除非粘附细胞，并添加新鲜培养基。第4天，用PBS中的1 mM EDTA分离细胞，以进行静脉（IV）注射。总计2×106给每只小鼠注射生理盐水中的活细胞。
BMDAC回巢烧伤创面
烧伤后48小时，通过尾静脉注射将雄性供体小鼠的BMDAC注射给雌性受体小鼠。在注射BMDAC后8 h采集正常和烧伤创面皮肤组织，并在55°C的组织溶解缓冲液（5 mM EDTA、0.2%SDS、200 mM NaCl、100 mM Tris–HCl[pH7.5]和100μg/ml蛋白酶K）中培养18 h。分离基因组DNA并在-70°C下冷冻，直到进行分析。通过定量实时聚合酶链反应（qPCR）分析BMDAC归巢，使用引物斯里（Y链接）和名称1（常染色体）基因序列[22]. 在每次qPCR运行中都包括非模板对照，并且没有扩增。将自导作为每只小鼠烧伤创面/正常皮肤的信号比率进行计算，并对效率进行校正[23]根据以下公式[24]:
哪里对是斯里每只小鼠烧伤组织中的信号超过其相应的正常皮肤控制；E、 Sry和E、Nme1是斯里和名称1引物；Cq是斯里或名称1烧伤（b）或非烧伤（n）皮肤。
统计分析
结果显示为平均值±标准平均误差（SEM）。根据Student’st吨测试或方差分析（ANOVA），然后根据需要进行Bonferroni事后分析。
结果
老化损害烧伤创面的闭合、灌注和血管化
我们以前报道过一种具有均匀、分级和可重复热损伤的小鼠烧伤模型[18]. 为了研究衰老的影响，我们使用了我们的全层烧伤模型和两种不同品系的小鼠。用加热棒在每只小鼠的背部产生两处直径为1.2厘米的烧伤，接触时间为4秒。在烧伤后第0天、第3天、第7天、第14天和第21天使用计算机平面测量法测量伤口面积。与2月龄（以下简称“年轻”）C57BL/6J小鼠相比，2岁（以下简称为“老年”）小鼠的伤口闭合明显延迟(P（P）<0.05) (). 同样，与年轻小鼠相比，老129S1/SvImJ小鼠的伤口面积显著增加(P（P）< 0.05) (). 因此，尽管伤口收缩是小鼠模型的一个主要局限性，可能掩盖了伤口愈合的差异，但我们的结果表明，衰老会延迟C57BL/6J和129S1/SvImJ小鼠的伤口闭合。
老化对烧伤创面愈合的影响。一2月龄（年轻）和2岁（老年）C57BL/6J小鼠。b条年轻与老年129S1/SvImJ小鼠。在烧伤后第0天、第3天、第7天、第14天和第21天，采用计算机辅助平面测量法测量创伤面积。平均值±SEM(n个=4–8）。通过双向方差分析评估老化的总体影响(右侧括号)
为了比较烧伤后的组织灌注，采用连续的无创性低密度聚乙烯亚胺（LDPI）测量同一年轻和老年小鼠的皮肤血流量。我们以前在129S1/SvImJ小鼠中进行过实验[18]和Hif1a型tm1jhu公司小鼠[14]烧伤后第7天出现峰值血流。与年轻的C57BL/6J小鼠相比，在7天的时间过程中，老年小鼠的伤口灌注显著降低(P（P）<0.01）和终点(P（P）<0.05) (). 同样，129S1/SvImJ小鼠的组织灌注总体下降与衰老相关(P（P）<0.01），并且在第3天和第7天差异显著(P（P）<0.05) ().
老化对烧伤创面血流量的影响。一年轻与老年C57BL/6J小鼠。b条年轻与老年129S1/SvImJ小鼠。为了测量血流，在烧伤后的指定时间进行连续激光多普勒灌注成像。平均值±SEM(n个=4–10）。通过双向方差分析评估老化的总体影响(右侧括号). *P（P）个别时间点<0.05
我们假设灌注的差异反映了新生血管的差异。在第21天从C57BL/6J小鼠的伤口组织上进行伤口血管的免疫组织化学分析。使用识别血管内皮细胞表达的PECAM-1（CD31）的抗体分析切片。CD31的数量+每个烧伤伤口中心200×区域内的血管()已确定(). 平均CD31+老年小鼠烧伤创面血管计数较年轻小鼠明显减少（20±2.3vs13±1.5；P（P）<0.05). 衰老对伤口灌注的显著影响()和伤口血管化()与衰老对伤口闭合的适度影响形成对比()，这可能反映了在小鼠中观察到的伤口收缩的混杂效应。
老化对烧伤创面血管化的影响。使用抗CD31抗体对C57BL/6J小鼠在第21天的烧伤伤口进行免疫组织化学分析。a、 b条年轻和老年小鼠伤口愈合中心的代表性图像（原始放大倍率，200倍）。c（c）CD31编号+每200×场的容器数。平均值±SEM(n个=7–9）*P（P）<0.05（学生的t吨测试）
老化影响烧伤后BMDAC的动员
我们假设，老年小鼠与年轻小鼠伤口闭合、灌注和血管化的观察差异与BMDAC动员的差异有关。分析BMDAC动员，CXCR4+/Sca1类+对外周血细胞进行分析。在非烧伤C57BL/6J小鼠中，CXCR4的数量+/Sca1类+与年轻小鼠相比，老年小鼠外周血中的BMDAC降低了3.5倍，烧伤导致年轻C57BL/6J小鼠BMDAC进一步增加，而老年C57BL/6J小鼠没有增加(). 年轻和老年非烧伤129S1/SvImJ小鼠的BMDAC数量相似，但烧伤导致年轻小鼠BMDAC水平升高，老年小鼠BMDAC水平降低(). 因此，衰老会损害BMDAC在两种小鼠中对烧伤的反应，使其进入循环的生理活动。这些结果提供了一种细胞机制来解释老年小鼠烧伤创面血管受损的原因().
老化对烧伤后骨髓源性血管生成细胞动员的影响。采集非烧伤对照小鼠的外周血样本(N个)或烧伤后第3天的小鼠(B类)并用流式细胞仪分析以确定循环CXCR4的数量+/Sca1类+细胞。一年轻与老年C57BL/6 J小鼠。b条年轻鼠与老年鼠129只S1/SvImJ。平均值±SEM(n个=5–7个）。通过双向方差分析评估老化的总体影响(顶部的支架); **P（P）<0.01 vs年轻非烧伤小鼠
老化影响SDF-1和HIF-1在烧伤中的表达
低氧/缺血反应中SDF-1的产生为CXCR4的动员和归巢提供了信号+/Sca1类+BMDAC。从年轻和老年129S1/SvImJ小鼠烧伤后2天采集的烧伤和非烧伤皮肤样品中分离出总RNA，并通过逆转录（RT）-qPCR测定SDF-1 mRNA水平。年轻小鼠与老年小鼠非烧伤皮肤的平均mRNA水平没有显著差异。然而，在年轻小鼠中，SDF-1 mRNA水平在烧伤后显著增加，而在老年小鼠中，未观察到SDF-1的mRNA水平增加(). 因此，衰老对SDF-1 mRNA的基础生成没有影响，但对烧伤后SDF-1的表达有重要影响。
老化对烧伤后SDF-1和HIF-1α表达的影响。一SDF-1 mRNA在烧伤创面的表达。从非烧伤小鼠的皮肤中分离出RNA(N个)或是烧伤的伤口(B类)在第2天对129S1/SvImJ幼鼠和老年小鼠进行试验。采用RT-qPCR分析SDF-1 RNA水平。平均值±SEM(n个=3–4个）。通过双向方差分析评估老化的总体影响(顶部的支架); **P（P）<0.01 vs Young N。b条采用ELISA法测定上述同一小鼠血清样品中SDF-1蛋白水平。平均值±SEM(n个=3–4个）。通过双向方差分析评估老化的总体影响(顶部的支架); **P（P）<0.01 vs Young N。c（c）年轻和老年小鼠烧伤伤口中HIF-1α蛋白水平。在烧伤后第2天，采集非烧伤和烧伤组织，并使用抗HIF-1α和β-肌动蛋白抗体对蛋白裂解物等分进行免疫印迹分析
为了确定烧伤创面中SDF-1 mRNA水平的差异是否转化为循环SDF-1蛋白水平的差异，该蛋白水平可作为动员和归巢的信号，我们分析了129S1/SvImJ幼年和老年小鼠烧伤后第2天的血清SDF-1水平。年轻小鼠的血清SDF-1蛋白水平显著升高，而老年小鼠则无此变化(). 与年轻小鼠相比，老年小鼠SDF-1 mRNA和蛋白水平显著降低，这为CXCR4动员受损提供了分子基础+/Sca1类+BMDAC。
在之前的研究中，我们证明了Hif1a型+/–在编码HIF-1α的基因座上有一个空等位基因杂合的小鼠，烧伤后血清SDF-1蛋白水平不会增加，因为烧伤后不能诱导HIF-1β的表达[14]. 基于这些发现，我们假设，烧伤后老年129S1/SvImJ小鼠SDF-1表达受损与HIF-1α表达的老化相关缺陷有关。采用免疫印迹法分析129S1/SvImJ小鼠烧伤后第2天采集的非烧伤和烧伤皮肤样品中HIF-1α蛋白的水平。在年轻小鼠中，未在非烧伤组织中检测到HIF-1α蛋白水平，而在烧伤后，检测到HIF1α蛋白的强烈表达(). 相反，129S1/SvImJ小鼠在烧伤后HIF-1α蛋白水平没有明显升高。烧伤创面HIF-1α蛋白水平的诱导受损为SDF-1表达的显著降低以及老年小鼠BMDAC动员失败提供了分子基础。
衰老与CXCR4的减少有关+烧伤创面细胞
我们的结果表明，由于不能产生细胞因子SDF-1，即与CXCR4结合的配体，衰老会削弱携带CXCR4的BMDAC的动员。我们假设除了BMDAC动员受损外，CXCR4的归巢+在老年小鼠中，烧伤细胞因未能诱导归巢信号SDF-1而受损。为了验证这一假设，我们使用CXCR4抗体对烧伤创面进行免疫组织化学分析(). 当分析第3天年轻129S1/SvImJ小鼠烧伤伤口的切片时，大量的CXCR4+在烧伤创面愈合区下方的皮下组织中观察到细胞(). 相反，CXCR4很少+老年小鼠烧伤创面细胞的观察(). 这些结果与衰老损害CXCR4的动员和归巢的假设一致+用于烧伤伤口的细胞。此外，这些细胞相对于伤口的较远位置表明，它们通过旁分泌作用而不是通过直接并入伤口内的新生血管来促进血管形成。
年龄对CXCR4招募的影响+用于烧伤伤口的细胞。在烧伤后第3天从年轻和老年129S1/SvImJ小鼠身上获取组织，并用抗CXCR4抗体进行免疫组织化学分析。a、 b条伤口和邻近区域的代表性截面(BW公司烧伤伤口，NS公司正常皮肤，HZ（赫兹）愈合区；原始放大倍数，40倍）。c、 d日装箱区域在里面一和b条以更高的功率显示（原始放大倍数为100倍）。e、 （f）装箱区域在里面c（c）和d日以更高的功率显示（原始放大倍数，200倍）；红箭表示CXCR4+细胞
老化影响烧伤后BMDAC的归巢
虽然免疫组化数据与BMDAC归巢到烧伤创面随着年龄增长而受损的假设相一致，但BMDAC可能仅代表表达CXCR4的髓样细胞的一个子集。为了直接分析BMDAC的归巢，我们从年轻雄性供体小鼠中分离骨髓细胞，并在内皮生长条件下培养4天，以选择BMDAC[21,22]在烧伤后48小时，将其静脉注射到年轻或老年雌性受体小鼠体内。为了检测BMDAC在烧伤创面中的归巢，在静脉注射后8小时采集非烧伤和烧伤组织，分离DNA，并使用来自斯里该基因位于Y染色体上，因此是供体雄性小鼠BMDAC的标记。在年轻受体雌性小鼠中，与非烧伤皮肤相比，烧伤后BMDAC的归巢增加了87倍以上，而在老年受体小鼠中，归巢与烧伤皮肤的比率是非烧伤皮肤的0.8倍，表明老年受体小鼠完全失去了归巢().
受体或供体年龄对BMDAC在烧伤创面归巢的影响。在受体雌性C57BL/6J小鼠烧伤48 h后，通过尾静脉注射来自供体雄性C57BL/6J小鼠的BMDAC。注射后8h切取正常皮肤和烧伤创面。提取DNA并使用qPCR检测BMDAC归巢，以确定Y染色体特异性斯里常染色体相关基因名称1基因。Homing表示为烧伤创面/正常皮肤的信号比率。平均值±SEM(n个=3–6个）。通过双向方差分析和Bonferroni事后比较评估统计显著性*P（P）与年轻受试者相比，<0.01。一来自年轻人的BMDAC(Y（Y）)捐赠者被注入Y（Y）或旧的(O（运行）)收件人。b条BMDAC来自Y（Y）或O（运行）捐赠者被注入Y（Y）收件人
为了研究BMDAC供体的年龄是否对归巢有任何影响，我们在烧伤48小时后将年轻或年老男性供体的BMDAC注射到年轻女性受者体内。年轻人和老年人的BMDAC归巢率没有显著差异（年轻人的归巢率为17.4，老年人的归宿率为10.9，P（P）>0.05;). 老年受体小鼠的选择性归巢缺陷与在老年小鼠烧伤创面中观察到的HIF-1→SDF-1信号缺陷一致.
讨论
老化对伤口愈合的影响涉及到几个因素，包括过度炎症反应和基质降解[25]，能量代谢改变[26]，肉芽组织减少[27]以及血管受损[8,27]. 缺血性皮肤伤口肉芽组织中BMDAC的缺失与伤口闭合明显延迟有关[28]. 在这项研究中，我们提供证据表明，老年小鼠烧伤创面中HIF-1→SDF-1信号受损是导致BMDAC动员和归巢受损的主要缺陷，进而导致伤口血管受损(). 这些发现与临床相关，因为对烧伤患者的研究表明，循环BMDAC与外周血SDF-1水平显著相关[29].
老化对烧伤创面愈合的影响。衰老损害HIF-1α的诱导，降低SDF-1的表达，并损害BMDAC的循环动员和伤口归巢，从而导致血管生成减少、组织灌注减少和伤口愈合延迟
这项工作补充了先前的研究，其中我们已经证明：HIF-1α部分缺乏小鼠的HIF-1诱导受损阻断了烧伤创面SDF-1的表达和CXCR4的动员+/Sca1类+BMDAC公司[14]; 衰老损害糖尿病小鼠切除伤口中HIF-1和编码血管生成生长因子的下游靶基因的诱导[17]; 衰老或部分HIF-1α缺乏通过损害编码多种血管生成生长因子的基因表达，损害股动脉闭塞后血流量的恢复[21]. 此外，其他人的研究也表明，在非糖尿病切除伤口模型中，伤口愈合和血管化的年龄相关性损伤也与HIF-1α和SDF-1表达减少有关[27]. 在缺血皮瓣模型中，缺氧组织中HIF-1介导的SDF-1表达可诱导循环CXCR4的迁移和归巢+细胞到缺血组织[10]. 在这个模型中，衰老对归巢的影响也仅限于受体小鼠[30]. 因此，在几种不同的伤口愈合模型中，HIF-1→SDF-1→BMDAC信号似乎起着关键作用。HIF-1可能在伤口愈合中发挥其他重要作用，例如调节缺氧伤口环境中的角质形成细胞增殖[31]，这可能是限制O的一种手段2消耗直至血管形成（并增加O2交付）。
我们的发现为深入了解老年人烧伤的病理生理学，并为制定新的治疗策略指明了潜在目标。最近的研究表明，通过基因治疗或使用化学诱导剂增加HIF-1α的表达可促进糖尿病小鼠伤口模型的血管生成[17,32]. 此外，HIF-1α基因治疗结合BMDAC治疗在老年小鼠肢体缺血模型中显示出改善灌注恢复和肢体挽救的效果，而这两种单独治疗均无效[22]. 需要进一步研究HIF-1α和BMDAC替代疗法是否有助于治疗老年患者的烧伤创面。
致谢
这项工作得到了NIH拨款P20-GM078494、约翰·霍普金斯细胞工程研究所和约翰·霍普金森大学亨德里克斯·伯恩基金会的支持。我们感谢Novus Biologicals Inc.的Karen Padgett慷慨提供抗HIF-1抗体。
脚注
X.Zhang和K.Sarkar为这项工作做出了同等贡献。
披露声明G.L.S.是约翰·霍普金斯大学医学院的C.迈克尔·阿姆斯特朗教授。所有作者均确认本出版物不存在利益冲突。
参与者信息
张贤杰，亨德里克斯·伯恩实验室，外科，约翰·霍普金斯湾景医疗中心，美国马里兰州巴尔的摩，邮编21224。
卡卡利·萨卡尔，美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院细胞工程研究所血管项目，邮编21205。约翰霍普金斯大学医学院医学系，美国马里兰州巴尔的摩，邮编21205。
塞尔吉奥·雷伊，美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院细胞工程研究所血管项目，邮编21205。美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院麦库西克·纳桑遗传医学研究所，邮编：21205。
劳尔·塞巴斯蒂安，亨德里克斯·伯恩实验室，外科，约翰·霍普金斯湾景医疗中心，美国马里兰州巴尔的摩，邮编21224。
Efstathia Andrikopoulou，亨德里克斯·伯恩实验室，外科，约翰·霍普金斯湾景医疗中心，美国马里兰州巴尔的摩，邮编21224。
盖伊·P·马蒂，亨德里克斯·伯恩实验室，外科，约翰·霍普金斯湾景医疗中心，美国马里兰州巴尔的摩，邮编21224。
凯伦·福克斯·塔尔博特，美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院病理学系，邮编21205。
格雷格·塞门扎，美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院细胞工程研究所血管项目，邮编：21205ude.imhj@aznemesg.约翰霍普金斯大学医学院儿科、肿瘤学、放射肿瘤学和生物化学系，美国马里兰州巴尔的摩，邮编21205。约翰霍普金斯大学医学院医学系，美国马里兰州巴尔的摩，邮编21205。美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院麦库西克·纳桑遗传医学研究所，邮编：21205。
约翰·哈蒙，亨德里克斯·伯恩实验室，外科，约翰·霍普金斯湾景医疗中心，巴尔的摩，马里兰州21224，美国ude.imhj@2nomrahj.
工具书类
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