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实验血液肿瘤。2013年；2: 4.
2013年2月19日在线发布。 数字对象标识：10.1186/2162-3619-2-4
预防性维修识别码：项目经理3585857
PMID：23422267

靶向早期B细胞受体信号诱导白血病套细胞淋巴瘤细胞凋亡

Mohand-Akli Boukhiar公司,1中，2 克劳迪娜·罗杰,三 朱莉·特兰,三 雷米·格雷森,5,6,7 安托万·马丁,1中，2,4,7 佛罗伦萨·Ajchenbaum-Cymbalista,1中，2,三 Nadine Varin-空白,1中，2 多米尼克·勒杜,1中，2,7和范妮·巴拉恩·马尔扎克通讯作者1中，2,三，7
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关联数据

补充资料

摘要

背景

我们之前表明，B细胞受体（BCR）信号通路对在体外套细胞淋巴瘤（MCL）细胞的存活。为了进一步确定参与MCL细胞生存的早期BCR激活信号通路，我们将研究重点放在BCR近端激酶，如LYN，其失调可能导致MCL的侵袭性进程。

方法

从14例白血病患者中分离出原代MCL细胞。通过qRT-PCR阵列鉴定BCR诱导的早期基因。通过免疫印迹法评估LYN和JNK的基础磷酸化和BCR诱导的磷酸化。用流式细胞术通过凋亡评估细胞存活信号。

结果

我们发现，在MCL细胞系和9/10白血病MCL病例中，LYN被组成性磷酸化。达沙替尼或Src激酶的特异性抑制剂（如PP2）治疗抑制构成性LYN活化并增加在体外原代MCL细胞的自发凋亡。BCR参与导致LYN磷酸化增加，导致c-JUN NH2-末端激酶（JNK）激活和早期生长反应基因-1（EGR-1）过度表达。SP600125抑制JNK可诱导细胞凋亡，并降低基础和BCR诱导的EGR-1表达水平。此外，通过siRNA降低EGR1表达降低了BCR诱导的细胞存活率。PP2或达沙替尼治疗抑制BCR诱导的LYN和JNK磷酸化以及EGR-1上调，并与所有分析病例中细胞存活率的降低相关。

结论

这项研究强调了BCR信号在MCL细胞生存中的重要性，并指出激酶抑制剂在抑制近端BCR信号事件和诱导凋亡方面的效率。

关键词：套细胞淋巴瘤、LYN、BCR、EGR-1、达沙替尼

背景

外套细胞淋巴瘤（MCL）约占非霍奇金淋巴瘤的6%–10%，尽管最近在治疗方面取得了进展，但该病通常尚未治愈，大量患者的无进展生存率较差。因此，针对特定信号分子的新疗法具有潜在价值。近年来，一些研究试图揭示新的合适的治疗靶点[1-9]并阐明了几种信号通路对MCL细胞增殖增强和抗凋亡的影响。成分活性B细胞受体（BCR）介导的信号传导与许多NHL的发病机制有关，包括弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）、滤泡性淋巴瘤、胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤和B细胞慢性淋巴细胞白血病（CLL）[10-13]. 最近，我们在原代MCL细胞中证明了活性BCR信号在MCL细胞存活中的中心作用[14]. BCR-相关激酶LYN和脾酪氨酸激酶（SYK）的活化形式存在于MCL肿瘤组织中，因此支持了MCL肿瘤的发生体内BCR信号在该病理学中的作用[15]. 此外，MCL的特征是高度受限的免疫球蛋白基因库，具有定型的VH CDR3和精确的体细胞超突变靶向，因此强烈暗示了抗原驱动的克隆祖细胞选择的作用[16].

抗原结合后，Igα–Igβ异二聚体（CD79a-CD79b）在免疫受体酪氨酸基激活基序（ITAM）酪氨酸上被属于Src家族激酶（SFK）的BCR相关激酶LYN磷酸化。然后，SYK蛋白通过其SH2结构域被招募到磷酸化的Igα–Igβ异二聚体，从而触发不同的信号级联[17]. 其中，PLCγ2/PKC通路对各种丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的激活至关重要，如细胞外信号调节激酶（ERK）和c-JUN NH2-末端激酶（JNK）。多个小组的广泛研究已经证实MAP激酶途径在各种血液恶性肿瘤的发病机制中发挥着关键作用，为未来的治疗方法提供了新的潜在分子靶点[18]. 事实上，DLBCL的基因表达谱显示，至少60%的病例中JNK mRNA的表达增强[19]. 此外，药物抑制剂SP600125抑制JNK激活可诱导骨髓瘤细胞生长停滞[20]. 有趣的是，JNK在MCL中被组成性激活，SP600125对磷酸化JNK的抑制导致MCL细胞系（Jeko-1、HBL-2、UPN-1、Granta-519）的生长停滞[21].

JNK激活的一个关键下游靶点是早期生长反应基因-1（EGR-1）转录因子，在细胞周期调控、细胞增殖和凋亡中发挥重要作用[22,23]. EGR-1在淋巴细胞培养中首次被鉴定为G0/G1开关调节基因[24]. 组成性EGR-1表达与B-1淋巴细胞的自我更新能力有关[25]和造血干细胞[26]. EGR-1也在未成熟的BKS-2B淋巴瘤中组成性表达，并使用特异性反义寡核苷酸抑制EGR-1诱导的凋亡[22]. 或者，成熟的B2细胞在BCR参与时随着EGR-1表达的增加而增殖[25]. 此外，EGR-1在SP600125抑制JNK后下调，其过表达部分保护B淋巴瘤细胞株免受JNK抑制剂诱导的凋亡[27].

鉴于BCR信号在包括MCL细胞在内的肿瘤细胞生存中的重要性，我们假设靶向BCR相关激酶（如SFK）是治疗MCL的一种潜在有用的策略。LYN激酶是B细胞中表达的主要SFK，其组成性磷酸化在Jeko-1细胞系中已有报道[28]. 然而，到目前为止，尚未探讨其在MCL中的作用。因此，我们分析了原代MCL细胞中LYN的激活状态，并评估了在体外其抑制作用对MCL细胞存活的影响。我们表明，在大多数MCL病例中，LYN被组成性磷酸化，BCR参与导致LYN磷酸化增加。达沙替尼（酪氨酸激酶的口服广泛抑制剂）治疗可抑制BCR诱导的原代MCL细胞中LYN和JNK磷酸化。同样，达沙替尼治疗抑制BCR-依赖性EGR-1的上调和细胞存活。使用PP2，一种更特异的BCR-相关SFK抑制剂，我们证明了阻断BCR-发射信号抑制MCL细胞存活的有效性。

结果

在MCL中BCR参与后快速诱导EGR-1和c-MYC

我们之前描述过BCR的参与通过IL6/IL10依赖的STAT3激活抑制在MCL中诱导生存信号[14]. 为了进一步研究BCR诱导的信号通路是关键的，我们从原发性白血病MCL中筛选纯化的B细胞，在抗IgM刺激下用RT筛选84个基因的差异表达2Profiler PCR阵列（SA Biosciences PAHS-027）。与未刺激细胞相比，15个基因的表达显著增加或减少（附加文件1：表S2；使用UPN 5、10、13和14的4个单独实验的平均折叠变化）。四个基因下调（APAF1、CCNG2、ATM、BTG2），均对应促凋亡蛋白。相反，有11个基因过度表达（CDK4、MCL1、NFkB1、IFNB1、SESN2、BCL2A、IL6、TNF、HK2、EGR-1、c-MYC），所有这些基因都参与细胞周期进展或抑制凋亡。在这个组中，三个基因编码转录因子；即NF-kB、c-MYC和EGR-1，后者是抗IgM刺激后最上调的两个基因（平均分别增加23.6倍和17.6倍）。

BCR诱导的c-MYC和EGR-1的表达随后通过MCL细胞系（Granta-519和HBL-2）的动力学实验得到证实（图1A和B）和MCL患者样本（图1C） ●●●●。对于MCL细胞系，BCR结扎后30 min内EGR-1 mRNA的基础水平迅速升高，1 h达到峰值，3～6 h内逐渐恢复到基础水平。类似地，EGR-1蛋白水平在抗IgM刺激后增加，并在6小时内恢复到基础水平（图1B） ●●●●。在6小时仍能检测到EGR-1蛋白的原代细胞（UPN7和UPN10）中观察到类似的增加（图1C） ●●●●。仅在患者细胞中BCR参与后，C-MYC表达显著诱导（图1Granta-519和HBL-2细胞的A，图1C代表UPN7）。c-MYC mRNA诱导的模式与EGR-1的不同，并且在至少3小时内显示出与c-MYC蛋白增加相关的持续增加（图1C） ●●●●。接下来，我们评估了BCR刺激对一系列7名患者样本的影响（图1D） ●●●●。在抗IgM刺激1小时后，7例患者中有4例EGR-1 mRNA表达高度上调，与c-MYC诱导相比明显上调（EGR-1和c-MYC的中位倍数分别增加30.1和2.98）。IGHV突变状态与BCR诱导的反应强度之间没有相关性（未显示）。

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BCR诱导MCL细胞系和原代MCL细胞EGR-1和c-MYC表达的动力学。(A类)BCR诱导Granta-519和HBL-2细胞株中EGR-1和c-MYC mRNA表达的动力学。3×106用10μg/ml的固定化抗IgM抗体刺激每毫升细胞15分钟、30分钟、1小时、3小时和6小时。用qRT-PCR分析EGR-1和c-MYC的表达。(B类)西区基因证实了BCR参与后EGR-1蛋白的诱导。(C类)对主要患者的细胞进行了相同的实验。通过qRT-PCR（左面板）和western-blot（右面板）分析EGR-1和c-MYC的表达。(D类)通过qRT-PCR分析7例患者（UPN2、3、4、5、6、7和8）在抗IgM刺激（1h）后EGR-1和c-MYC mRNA的表达。计算所有实验中mRNA水平与未刺激细胞相比的倍增。所有测量均重复进行，并提供平均值。

抑制JNK抑制BCR诱导的EGR-1上调和细胞存活

由于EGR-1在各种细胞模型中被描述为JNK激活的下游靶点，我们在MCL中分析了JNK参与BCR诱导的EGR-1上调及其对MCL细胞生存的作用。在特征性患者样本（UPN9）中，轻微检测到基础JNK磷酸化，并且在BCR结扎5分钟后进一步增强，磷酸化JNK p46的增加更高（图2A） ●●●●。此外，在存在选择性JNK抑制剂（SP600125，20μM）的情况下，BCR诱导的磷酸化JNK p46的增加被完全消除（图2A） ●●●●。SP600125对JNK的抑制诱导HBL-2和Granta-519细胞中EGR-1 mRNA表达的快速下调，并伴随EGR-1蛋白的随后降低（图2B） ●●●●。此外，在抗IgM刺激后用SP600125治疗也能阻止BCR诱导的MCL细胞系（HBL-2和Granta-519）和原代MCL细胞（UPN1）中EGR-1的上调（图2C） ●●●●。为了证实EGR-1是JNK对BCR激活的下游靶点，抗IgM刺激的HBL-2细胞与5Z-7-Oxozeanol孵育，5Z-7-Oxoze anol是转化生长因子-β活化激酶-1（TAK1）的抑制剂，对BCR诱导的B细胞JNK激活至关重要[29]. 如附加文件所示2：图S1，用5Z-7-环氧乙烷醇（0.5μM）治疗完全消除BCR诱导的EGR-1上调。总之，这些结果表明组成型和BCR诱导的EGR-1表达依赖于MCL细胞中JNK的激活。

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碱性和BCR诱导的EGR-1表达依赖于JNK激活。(A类)用SP600125（10μM）预处理原代细胞（UPN9）1小时，然后用可溶性抗IgM抗体（10μg/ml）刺激5分钟。通过western blot分析碱性磷酸酶和BCR诱导的JNK磷酸化（p54和p46）。ns：非特定波段。(B类)SP600125治疗导致Granta-519和HBL-2细胞中的mRNA和蛋白EGR-1水平随时间而降低。(C类)SP600125对BCR诱导的EGR-1表达的影响。用SP600125预处理Granta-519、HBL-2和原代细胞（UPN1）1h，然后用固定化抗IgM抗体刺激。通过qRT-PCR和蛋白质印迹分别分析EGR-1的mRNA和蛋白质水平。在所有实验中，相对于未刺激的细胞计算mRNA水平的倍数增加。所有测量均重复进行，并提供平均值。

接下来我们研究了JNK抑制对MCL细胞存活的影响。用SP600125处理HBL-2和Granta-519细胞48小时后，凋亡增加（HBL-2与Granta-5129的凋亡细胞分别从27%和34%增加到68%和61%）（图三A） ●●●●。MCL原代细胞中也观察到类似的凋亡增加（未经处理和处理的细胞分别为36±5%和50±3%，n=4）（图三B） ●●●●。此外，在大多数情况下，BCR参与诱导了自发凋亡的显著抑制（p=0.039），而SP600125的治疗消除了这种抑制（p=0.009）（图三B） ●●●●。为了证实EGR-1参与BCR诱导的细胞存活，用抗IgM刺激转染EGR-1 siRNA的MCL原代细胞。如图所示三C、 与对照siRNA转染相比，细胞存活率降低了20%至30%。总之，这些结果表明EGR-1是MCL细胞中JNK的下游靶点，JNK促进MCL中构成性和BCR诱导的细胞存活，这与EGR-1的诱导密切相关。

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靶向JNK和EGR-1可诱导MCL凋亡并降低BCR诱导的细胞存活率。(A类)SP600125处理HBL-2和Granta-519细胞48 h，流式细胞仪检测细胞凋亡。凋亡细胞的百分比相当于膜联蛋白V阳性细胞的%，包括PI阴性和PI阳性细胞。表示了2个独立实验的平均值±SD。(B类)用固定化抗IgM刺激患者细胞（UPN1、2、8和11）24小时，加或不加SP600125（10μM），并在CD19+细胞上选通后用流式细胞仪测定凋亡细胞百分比(左侧面板). 所有测量均重复进行，并提供平均值。结果也显示为中位数±四分位数(箱)±SE(酒吧)（n=4）(右侧面板). 使用配对学生确定各组之间的差异t吨测试。(C类)用对照siRNA（Ctrl1）或EGR-1 siRNA转染Jeko-1细胞，培养72小时后用western blot测定EGR1蛋白水平(左侧面板). 用对照siRNA（Ctrl1，Ctrl2）或EGR-1 siRNA转染原代MCL细胞（UPN9），然后用抗IgM刺激24小时或不刺激(右侧面板). 将凋亡细胞的百分比归一化为非刺激细胞，计算如下：[（%凋亡BCR刺激细胞-%凋亡BCR-非刺激细胞）/（%凋亡BC R-非模拟细胞）]x100。所有测量均重复进行，并提供平均值。

抑制LYN活性与MCL细胞凋亡增加有关

BCR信号最初由LYN激酶传递，从而激活包括JNK在内的各种信号通路。因此，我们评估了MCL细胞中LYN的激活状态及其与细胞生存的关系。使用识别几个Src激酶（其中LYN的Tyr397）的催化位点的抗磷酸-SFK，我们在10个测试的UPN病例中的9个（UPN 1,3,5,7,8,9,10,13,14）中检测到这种特定信号到不同程度的组成性磷酸化，形成53–56 kDa双链（图4A和附加文件三：图S2）。我们通过使用抗LYN抗体的免疫沉淀分析证实了该双联物对应于磷酸化LYN（图4B） ●●●●。考虑到MCL细胞中LYN的组成性激活，我们接下来评估了PP2（一种合成的吡唑啉嘧啶选择性SFK抑制剂）和达沙替尼（BMS-354825）（一种口服多激酶抑制剂）的影响，后者也抑制LYN活性Tyr397残基的反式自磷酸化[30]. 用PP2或达沙替尼处理原代细胞导致Tyr397 LYN磷酸化的剂量依赖性降低，PP2和达沙替尼可分别达到10μM和100nM的完全抑制（图4C） ●●●●。PP2对磷酸化Tyr397 LYN的抑制与凋亡率的显著和剂量依赖性增加有关（未经处理和24 h处理（10μM）细胞的凋亡率分别从49±4%增加到67±3%；p=0.006；n=6）（图4D） ●●●●。达沙替尼治疗24小时也导致凋亡显著且呈剂量依赖性增加（未治疗和治疗（100nM）细胞的凋亡细胞分别从46±5%增加到64±5%；p=0.0001；n=7）（图4E） ●●●●。值得注意的是，在高达200nM的浓度下，达沙替尼对磷酸-Tyr397 LYN阴性细胞（UPN4）几乎没有凋亡作用（图4E、，顶部面板). 总之，这些结果表明MCL细胞显示出BCR相关LYN的组成型磷酸化，并且用达沙替尼或PP2处理抑制了LYN的激活并增加了自发凋亡。

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PP2和达沙替尼抑制LYN的结构性磷酸化并诱导原代MCL细胞凋亡。(A类)MCL患者样本中LYN的组成性磷酸化谱。使用泛磷酸-src家族抗体检测磷酸-Tyr397 LYN。去除斑点并重新检测总LYN。(B类)用抗LYN抗体（Ig-LYN）或不相关的IgG对照物免疫沉淀HBL-2细胞的总蛋白，并用抗磷酸酪氨酸抗体（P-Tyr）或抗-LYN抗体免疫印迹（IB）。(C类)用不同浓度的PP2（2至20μM）或达沙替尼（1至200nM）处理原代MCL细胞（UPN3、UPN14）2小时。通过western blot分析磷酸-Tyr397 LYN和LYN总量。(D类)用不同浓度的PP2（UPN3，顶部面板)或10μM PP2（UPN 1–3-7–8-9–14，中间面板)24h后用流式细胞仪检测CD19+细胞的凋亡。所有测量均重复进行，并提供平均值。结果也显示为中位数±四分位数(箱)±SE(酒吧)底部面板). 使用配对学生确定各组之间的差异t吨测试。(E类)用不同浓度的达沙替尼处理原代MCL细胞24小时（顶部面板）或100nM（中间面板）。如上所述测量细胞凋亡。结果也显示为中位数±四分位数(箱)±SE(酒吧)底部面板)。

PP2或达沙替尼抑制BCR诱导的LYN磷酸化与抑制BCR介导的细胞存活相关

由于PP2和达沙替尼有效地阻断了MCL细胞中BCR相关LYN的激活，我们接下来评估了这些化合物对JNK磷酸化、EGR-1表达和BCR参与时细胞存活的影响。如图所示5A、 BCR结扎反应中观察到磷酸化Tyr397 LYN的强烈增加（与第4通道相比，第1通道），而达沙替尼（100nM）治疗完全阻断了这种作用，而影响JNK的SP600125则没有。同样，PP2降低了原代MCL细胞中BCR诱导的磷酸化Tyr397 LYN（图5B） ●●●●。达沙替尼还降低了BCR诱导的磷酸化JNK p46（图5C、 将JNK定位为LYN的下游目标，以响应BCR的接入。接下来，我们评估了达沙替尼对作为JNK靶点的基础和BCR诱导的EGR-1水平的影响。如图所示5D类(左侧面板)，达沙替尼（100nM）降低EGR1 mRNA的基础表达，并完全消除其对BCR结扎（UPN3，UPN13）的上调反应。达沙替尼还略微降低了EGR1蛋白的基础水平，并阻断了其BCR诱导的上调（图5D、，右侧面板和其他文件4：图S3）。最后，我们评估了PP2和达沙替尼治疗对BCR诱导的细胞存活的影响。达沙替尼浓度的增加以剂量依赖性的方式消除了BCR诱导的生存反应，并显著抑制了所有受试UPN病例的生存信号（未经治疗和达沙替尼经治疗的BCR激活细胞的凋亡细胞分别从34±6%到54±7%；n=6；p<0.001）（图6A） ●●●●。类似地，PP2处理也减少或消除了BCR诱导的细胞存活（图6B） ●●●●。总的来说，这些结果强调了LYN、JNK和EGR1作为BCR信号传导的中间体在介导MCL细胞中的存活信号中的重要性，并指出了达沙替尼在抑制BCR发出的细胞存活信号方面的效率。

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PP2和达沙替尼抑制BCR诱导的LYN和JNK激活和EGR-1上调。(A类)患者细胞（UPN9）用达沙替尼（100nM）或SP600125（10μM）预处理1 h，并用可溶性抗IgM（10μg/ml）刺激5 min或15 min。使用泛磷酸-src家族抗体检测磷酸-Tyr397 LYN。(B类)在相同的BCR刺激条件下，对UPN9和UPN13上的PP2（10μM）进行10分钟的相同实验。必须对第1行和第2行进行比较，以证明PP2对Lyn磷酸化组成水平的影响。类似地，第3行和第4行反映了对BCR刺激的这种影响。(C类)用达沙替尼（100nM）或SP600125（10μM）处理BCR诱导的磷酸化JNK（p54和p46），作为磷酸化JNH抑制的阳性对照物，对其进行分析。(D类)达沙替尼对BCR诱导的EGR-1表达的影响。用不同浓度的达沙替尼预处理MCL细胞，并用固定化抗IgM刺激。刺激1h后用qRT-PCR分析EGR-1 mRNA和蛋白(左侧面板)刺激3小时后出现西区(右侧面板). 计算与未刺激细胞相比的相对mRNA表达。

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PP2和达沙替尼抑制BCR诱导的细胞存活。(A类)原代MCL细胞（UPN3）未经处理或在存在或不存在不同浓度达沙替尼（10至200nM）的情况下用抗IgM抗体刺激24小时（顶部面板）CD19+细胞门控后，用流式细胞仪测定细胞凋亡率（Annexin V+/PI+细胞）。对于每个BCR刺激条件（±达沙替尼），凋亡细胞的百分比归一化为非刺激细胞，并计算如下：[（%凋亡BCR刺激细胞-%凋亡BCR-非刺激细胞）/（%凋亡BC R-非模拟细胞）]x100.中间面板：在没有或存在10 nM达沙替尼的情况下，从未刺激或BCR刺激的细胞（24小时）中测量6例MCL患者的凋亡率。所有测量均重复进行，并提供平均值。结果也显示为中位数±四分位数(箱)±SE(酒吧)（n=6）(底部面板). 使用配对学生确定各组之间的差异t吨测试。(B类)根据中描述的相同方案，用PP2处理原代细胞(A类)。

讨论

在本研究中，我们发现原代MCL细胞表现出组成型和BCR诱导的LYN激活，用达沙替尼或更特异的LYN抑制剂处理抑制了BCR诱导的JNK磷酸化和EGR-1上调，并与细胞存活率下降有关。

最近的研究表明，BCR信号通路在DLBCL细胞存活中的重要性[10]和CLL细胞[11]但很少有研究关注BCR信号在MCL细胞存活中的作用[14,15]. 我们之前已经在MCL细胞中显示，BCR参与通过IL6/IL10自分泌依赖性STAT3激活诱导细胞生存信号[14]. 为了进一步确定参与BCR诱导生存的早期基因，我们观察了BCR刺激后的差异基因表达。我们证明，BCR参与导致EGR-1 mRNA和蛋白水平的快速但短暂的诱导。EGR-1是一种锌指转录因子，其表达被描述为直接依赖于抗原受体信号[31,32]. EGR-1是JNK的下游靶点，它调节CD44、NF-kB1、胸苷激酶、细胞周期蛋白D1和血小板衍生生长因子等对细胞生存和增殖至关重要的基因的表达[23,33-35]. 因此，我们评估了EGR-1在MCL细胞存活中的作用，并表明SP600125对JNK的抑制诱导了组成型和BCR诱导的EGR-1表达的降低，与细胞凋亡的增加和BCR诱导的存活的抑制有关。我们通过阻断JNK上游激活剂TAK1的活性证实了EGR-1的JNK依赖性上调，TAK1最近被描述为在MCL生存中发挥重要作用[36]. 我们的结果表明，在MCL细胞中，EGR-1是BCR信号的下游靶点，在抗原刺激下其表达可以增强，从而导致细胞存活。除了EGR-1外，我们还观察到BCR的参与也仅导致患者细胞中c-MYC的增加。细胞系和原代细胞之间的这种差异反应可能反映了与患者细胞相比，细胞系中c-MYC表达水平更高[37]. 因此，细胞株可能对BCR的进一步刺激无反应。与EGR-1相比，患者细胞中c-Myc的延迟动力学诱导可能证明c-Myc是后一种诱导。这种诱导是否与CLL中提出的EGR-1的表达有关[38]CpG ODN激活的BKS2细胞[39]尚待确定。然而，我们的结果表明EGR-1和c-MYC上调可能在BCR诱导的MCL细胞存活中发挥重要作用。

最近使用高通量磷酸蛋白质组学技术研究了MCL中BCR信号的重要性，该技术鉴定了300多个酪氨酸磷酸化蛋白[15]. 最丰富的肽是构成BCR相关信号体的蛋白质的一部分。其中，激酶LYN和SYK被发现具有组成性强磷酸化，因此即使在没有抗原刺激的情况下也能反映活性BCR信号。通过激活SYK，BCR信号在MCL中的重要性也被认为可能是由于LYN和CSK结合蛋白/磷酸蛋白组成的组成性激活的信号体与富含鞘糖脂的微域（Cbp/PAG）膜适配器有关[6,40]. 在本研究中，我们在一组原代MCL细胞中显示，LYN以组成活性形式存在，如活性Tyr397 LYN残基的磷酸化所示。LYN被认为是细胞膜脂筏的关键成分。此外，在MCL质膜中发现了一组异常表达的跨膜蛋白[41]. 特别是，与正常B细胞相比，通过CSK募集参与静息B细胞LYN负调控的Cbp/PAG在MCL原代细胞中表达不足。因此，Cbp/PAG的这种低表达可能有助于MCL细胞中LYN的结构性激活。

Dasatinib是一种BCR/ABL和SFK双重抑制剂，已证明其在抑制淋巴瘤B细胞增殖方面的功效，表现出Src激酶的结构性激活。杨等证明达沙替尼抑制Src-SYK-PLCg2通路可诱导DLBCL G1期阻滞[42]. 在本研究中，我们证明了LYN的组成性和BCR诱导的磷酸化，从而证明了评估达沙替尼对MCL细胞存活影响的理论基础。我们发现达沙替尼靶向LYN的ATP结合囊[30]，抑制Tyr397 LYN的磷酸化可能是通过阻断其反式自磷酸化。我们还首次发现达沙替尼在纳米范围内诱导原代MCL细胞凋亡，并抑制抗原触发后BCR诱导的存活。令人感兴趣的是，诱导的达沙替尼（100nM）的浓度水平在体外MCL细胞凋亡与临床可达到的剂量一致[43]. 达沙替尼治疗复发性或难治性CLL的II期研究显示，15名患者中有3名出现部分反应，其余12名患者中，有5名出现淋巴结反应。因此，研究人员得出结论，达沙替尼作为单一药物对复发和难治性CLL具有活性[44]. 达沙替尼的Ⅰ/Ⅱ期研究目前正在招募复发或难治性非霍奇金淋巴瘤（NHL）患者，包括套细胞淋巴瘤患者(NCT00550615号)。

结论

总之，对原代MCL淋巴细胞进行的这项研究证实了早期BCR信号的失调，其特征是组成性LYN磷酸化，可通过BCR参与而增强。此外，靶向近端BCR-相关激酶可有效诱导MCL细胞凋亡。因此，抑制LYN激酶和下游JNK/EGR-1通路可能是MCL中克服BCR发出的生存前信号的一种新的治疗策略。

方法

MCL样品和细胞系

通过Ficoll-Hypaque密度梯度法（法国格勒诺布尔干细胞技术公司）从14名MCL白血病患者中获得外周血单个核细胞。淋巴细胞数量大于8.0×109/L和14个样本中的10个样本含有至少80%的B淋巴细胞（附加文件5：表S1）。所有B淋巴细胞都是单克隆肿瘤B细胞，通过表面免疫球蛋白轻链（单型κ或λ）的流式细胞术表型分析证明。7例（7/14）显示IGHV突变，CD79B的ITAM序列无突变。通过t（11；14）的免疫表型、细胞遗传学和FISH分析确定MCL的诊断，并根据世界卫生组织分类，通过竞争性RT-PCR检测cyclin D1的过度表达。在GOELAMS组“Lamphome du manteau 2006 SA”的前瞻性试验中，所有患者均接受了均匀治疗[45]. 根据赫尔辛基宣言，向所有患者提供书面知情同意书，并由GOELAMS小组的道德委员会进行验证。患者通常在采样后很快接受治疗，因此很难在同一样本上多次重复所有实验。Jeko-1和Granta-519细胞系购自德国微生物和细胞培养收藏中心（DSMZ，Braunshweig，Germany），HBL-2细胞系是B.Sola博士（法国卡昂）慷慨赠送的礼物[46].

患者的细胞要么新鲜分离，要么在10%二甲基亚砜和20%热灭活FCS存在下在液氮中冷冻保存。MCL白血病细胞（3×106细胞/ml）在添加10%热灭活胎牛血清的完整RPMI 1640培养基中培养。Jeko-1、HBL-2和Granta-519细胞系在同一培养基中培养。如前所述，为了刺激BCR，平板预先涂有兔抗人IgM抗体（10μg/mL；Jackson ImmunoResearch，马里兰州巴尔的摩[14]或在相同浓度的培养基中加入抗IgM抗体，刺激时间较短。

抗体和试剂

EGR-1（单抗44D5）、c-MYC（单抗9B11）、磷酸化Src家族（单抗100 F9）的抗体也与磷酸化Tyr397 LYN（催化位点）和磷酸化JNK（Thr183/Tyr185）反应，这些抗体来自Cell Signaling（马萨诸塞州贝弗利）。抗LYN的单克隆小鼠抗体（H-6）和多克隆兔抗体（44）来自Santa-Cruz（加州圣克鲁斯）。抗磷酪氨酸单克隆抗体（克隆4 G10)来自Millipore（马萨诸塞州Billerica）。除非另有说明，否则Dasatinib（Clini Sciences，Montrouge，France）的用量为100nM。JNK抑制剂SP600125和PP2（4-氨基-3-（4-氯苯基）-1-（叔丁基）-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶）来自Sigma（法国圣昆廷-法拉维），（5Z）-7-氧代烯醇（TAK1抑制剂）来自Tocris Bioscience（英国布里斯托尔）。

RT公司2剖面仪PCR阵列

MCL患者的肿瘤B淋巴细胞通过RosetteSep®人类B细胞富集鸡尾酒（Stemcell technologies，法国格勒诺布尔）进行纯化。细胞在BCR刺激下培养3小时或不处理。根据制造商的说明（SA Biosciences，Frederick，MD），使用Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR Systems提取总RNA，并使用“p53信号通路”阵列（SA Bios ciences PAHS-027）进行分析。将每个基因表达归一化为PCR阵列中可用的四个看家基因（β2-微球蛋白、β-肌动蛋白核糖体蛋白L13A、次黄嘌呤磷糖基转移酶-1和β-肌动蛋白）的平均Ct值，然后将其归一化至未刺激的对照细胞，以确定fold变化。用ΔΔCt方法计算表达的相对折叠变化，数值表示为2-ΔΔCt。所有分数均为一式两份。

细胞凋亡测定

在使用膜联蛋白V-FITC和碘化丙啶染色（BD Biosciences，San Jose，CA）对CD19+细胞进行门控后，使用流式细胞术（FACSCantoTM II Becton Dickinson）对白血病MCL PBMC评估细胞凋亡。凋亡细胞的百分比相当于膜联蛋白V阳性细胞的%，包括PI阴性和PI阳性细胞。所有测量均重复进行，并显示平均值。

用qRT-PCR定量EGR-1和c-MYC mRNA

使用RNeasy Mini kit（QIAGEN）提取未刺激或抗IgM刺激细胞的RNA，并使用SYBR Green试剂通过qRT-PCR分析EGR-1和c-MYC的表达。将结果归一化为亲环素A看家基因的平均Ct值，然后将其归一化至未刺激的对照细胞，以确定折叠变化。用ΔΔCt方法计算表达的相对折叠变化，数值表示为2-ΔΔCt。所有分数均为一式两份。用于扩增的引物（Sigma-Aldrich）如下：

EGR-1正向引物（5′CGAGCAGCCCTACGACCTGAC3公司′),

EGR-1反向底漆（5′TGCGCAGCTCAGGGTGGGCTCTG3′),

c-MYC正向底漆（5′GCTGCTTAGACGCTGGATTTTT3公司′),

c-MYC反向底漆（5′ACCGAGGTTAGTCGAGGTCAT3′),

亲环素A正向引物（5′GCACTGGAGAAAGGATTTGG3公司′)和

亲环素A反向引物（5′AGTGCCATTATGCGTGA3公司′)。

蛋白质印迹和免疫沉淀

3×10的总蛋白提取物6MCL细胞（PBMC）在10%聚丙烯酰胺变性凝胶上分离，转移到硝化纤维素膜上，与适当的抗体孵育过夜，然后再孵育二级辣根过氧化物酶结合抗体（Bio-Rad）。使用ECL（英国白金汉郡Amersham Biosciences）和放射自显影术（美国罗切斯特柯达Biomax）进行检测。对于LYN免疫沉淀，HBL-2细胞在1%Nonide P-40（NP-40）裂解缓冲液中在冰上裂解30分钟。通过在4°C下以27 000 g离心10分钟，去除不溶物质，并在4°C下用兔抗LYN（H-6）抗体免疫沉淀可溶性蛋白2小时。将免疫复合物溶解在SDS样品缓冲液中，在SDS-PAGE上分析，转移免疫复合物，并使用小鼠抗磷酸酪氨酸抗体（克隆4 G10）进行免疫印迹，如上所述)或小鼠抗LYN（44）抗体。

siRNA分析

在100μL含有1μM EGR-1 siRNA（靶向加SMART池人类EGR-1，Dharmacon）或1μM对照siRNA（Ctrl1：靶向加非靶向；Ctrl2：靶向+非靶向。使用U-015程序将细胞转染到Nucleofector II设备（Lonza）中，将其转移到培养板上，并如上所述进行western blot和凋亡分析。

统计分析

使用学生的t吨测试。使用GraphPad Prism软件（加利福尼亚州圣地亚哥）进行统计分析。P（P）低于0.05的数值被认为具有统计学意义。

缩写

MCL：外套细胞淋巴瘤；SFK：Src家族激酶；BCR：B细胞受体；JNK：c-JUN NH2-末端激酶；EGR-1：早期生长反应基因-1；IGHV：免疫球蛋白重链可变区；MAPK：丝裂原活化蛋白激酶；ERK：细胞外信号调节激酶；CLL：慢性淋巴细胞白血病；DLBCL：弥漫性大B细胞淋巴瘤；PBMC：外周血单个核细胞；TAK1：转化生长因子-β活化激酶-1；ITAM：基于免疫受体酪氨酸的激活基序；SYK：脾脏酪氨酸激酶；MYC：骨髓细胞瘤病；SH2:Src-同源性2；PLC：磷脂酶C；PKC：蛋白激酶C；IL：白细胞介素；STAT3：信号转导子和转录激活子3

竞争性利益

提交人声明他们没有利益冲突。

作者的贡献

MB、JT、CR进行了研究。RG、AM提供试剂和GOELAMS组成员。NVB和FC提供了试剂，并帮助设计研究和撰写手稿。DL设计了研究，分析了结果，制作了图表并撰写了手稿。FBM设计了研究，进行了实验，分析了结果，制作了数字并撰写了手稿。所有作者阅读并批准了最终手稿。

作者信息

这项工作得到了GOELAMS小组（group Ouest-Est des Leucémies Aigués et Maladies du Sang.）和国家癌症研究所（INCA）肿瘤生物库的支持。M.A.B.得到法国卫生学会（SFH）的支持。

FBM和DL是联合高级作者。

补充材料

附加文件1：表S2：

BCR刺激的MCL细胞（3小时）与未刺激细胞中差异表达的基因。

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附加文件2：图S1：

（5Z）-7-氧代烯醇抑制TAK1蛋白抑制BCR诱导的EGR1表达。HBL2细胞用（5Z）-7-氧代烯醇（5Z-7-氧基）（0.3和0.5μM）预处理1h，然后用固定化抗IgM（10μg/ml）刺激。通过western blot分析总蛋白提取物中EGR1的表达。

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附加文件3：图S2：

原代MCL细胞中LYN的组成性磷酸化。提取UPN1、UPN5、UPN13和UPN14的总蛋白并进行western blot分析。使用泛磷酸src家族抗体检测磷酸-Tyr397 LYN。去除斑点并重新检测总LYN。

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附加文件4：图S3：

达沙替尼治疗抑制BCR诱导的EGR-1蛋白上调。用不同浓度的达萨替尼（1nM-200nM）对HBL-2细胞进行预处理（1 h），并用固定化抗-IgM刺激1 h（抗IgM）或不刺激（−）。然后用western blot分析EGR1蛋白水平。

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附加文件5：表S1：

14例MCL病例（UPN）的特征。

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文章来自实验血液学与肿瘤学由以下人员提供BMC公司