MSH3多态性和蛋白质水平对亨廷顿病小鼠CAG重复不稳定性的影响

摘要

作者摘要

介绍

至少有14种神经退行性疾病和神经肌肉疾病是由CAG/CTG重复序列的扩增引起的，包括亨廷顿病（HD）和强直性肌营养不良1型。HD家系CAG重复束长度与发病年龄呈负相关[1],[2]扩展的CAG重复在几个器官中是不稳定的，随着时间的推移，长度逐渐增加，与疾病进展一致[3]–[7]在大脑中，体细胞CAG扩张是区域特异性的，在纹状体和皮层中观察到最大的不稳定性，这在HD患者中表现出最严重的神经病理学[3]–[7].体细胞重复不稳定性对HD/DM1疾病发病年龄、严重程度和进展的潜在贡献[1],[7],[8]，必须了解不稳定的过程，因为它是一个治疗目标[9].

一些转基因小鼠模型有助于我们了解CAG/CTG不稳定性的机制[10]–[18].两者顺式-元素和反式-改变CAG/CTG重复不稳定性的因素已经确定。Cis公司-这些元素包括侧翼序列上下文，如CTCF结合位点、CpG-甲基化、DNA序列、G+C含量、DNA复制方向和进展、转录水平和方向[9],[11],[17]–[23].变速箱-与CAG/CTG不稳定性相关的因素包括DNA复制、修复和重组蛋白。在小鼠试验中，分1,雷达52,雷达54,Xpc公司，似乎没有效果[24]–[27]，同时Ogg1号机组,尼尔1,Csb公司,照明1,Xpa公司,女士6，或第2页显示部分效果[16],[28]–[33]然而，错配修复（MMR）基因Msh2公司和女士3已经证明重复扩张是绝对必要的[13],[16],[26],[27],[34]–[36].

除了是迄今为止确定的重复不稳定性的最强修正剂之外，[9],[37]MMR蛋白MSH2和MSH3的作用最近被扩展到人类HD和DM1干细胞中的CAG/CTG不稳定性[38].MMR是一种专用于防止错误配对核苷酸和插入/缺失环引起突变的途径[39]有两种异二聚体蛋白复合物可识别未配对的DNA：MutSα由MSH2-MSH6组成，MutSβ由MSH2–MSH3形成。MutSα主要用于修复碱基错配，MutSβ与MutS a具有一定的功能冗余，主要参与插入/缺失环（1-12个核苷酸）的修复[40]–[44].修复短CAG/CTG滑出需要MutSβ，大于MutSα[42]最近的证据表明，MSH2、MSH3和MSH6蛋白的水平在14种不同的小鼠组织类型之间差异很大，在大多数分析的组织中，MSH3蛋白的水平高于MSH6的水平[45]MMR通常起到防止突变的作用；然而，在长CAG/CTG重复等位基因的情况下，额外的重复扩增突变需要MSH2和MSH3[37].Msh2公司转基因HD基因外显子1的R6/1小鼠体细胞组织固有扩增产生的缺陷稳定CAG/CTG重复序列[13],[46],卫生部^问题111敲除小鼠[27],[36]，和几个DM1鼠标模型[16],[26],[47]MSH3蛋白与MSH2一样，是体细胞组织中扩增偏向的CAG/CTG重复不稳定性所必需的[16],[27],[35].缺少女士3阻断HD小鼠组织中CAG/CTG的扩张[16],[27],[35].缺少一个女士3等位基因(女士3/空白小鼠）足以降低HD和DM1小鼠的CAG扩张频率，这表明MSH3可能是导致扩张形成的过程中的限制因素，CAG不稳定性可能紧密依赖于MSH3蛋白水平[16],[27],[35]无MSH6增加CAG/CTG扩张[16],[27],[35]可能是由于MSH3和MSH6之间竞争结合MSH2形成功能复合物[16],[48].

已经提出了MutSβ可以驱动CAG/CTG扩张的几个模型。体内小鼠模型表明，需要MutSβ来驱动CAG扩张[13],[27],[35]防止反复宫缩[16],[26],[27],[34]–[36],[49]MutSβ在扩张中的作用超出了其结合滑移DNA的能力[50]作为ATP酶功能的MutSβ复合物对CAG扩张是必要的[47]和下游错配修复蛋白，如PMS2，是不稳定所必需的部分[28]MutSβ复合物可能在复制分叉错误期间或转录期间作用于CAG重复，因为这两个过程都可以以MMR依赖的方式增强不稳定性[51],[52]当MutSβ对聚集性短CAG/CTG滑脱的修复事件被阻止时，非增殖组织中的不稳定性可能出现[42]。沿这些簇的阻止修复可能会导致股线移位、滑移、进一步失准错位，以及修复合成，从而导致未修复簇滑移的扩张[42]。使用异常修复产品作为基底，重复此类事件可能导致持续扩张。MutSβ的扰动水平降低了短CTG滑脱的修复，使其能够作为扩张物整合[42]短TNR滑脱修复对MutSβ浓度的敏感性与其他关于修复蛋白水平影响重复不稳定性的报告类似[53]–[55].

在本研究中，我们使用了R6/1 HD转基因小鼠模型[10],[56]。R6/1 HD转基因小鼠是通过使用具有约1000 bp人类亨廷顿蛋白基因的构建物生成的HTT公司发起人，整个HTT公司外显子1，包括～116个CAG重复序列和262 bpHTT公司内含子-1[56]据报道，R6/1转基因整合为3号染色体上的头尾二聚体[57]然而，在我们的群体中，经SP-PCR评估，转基因似乎只含有一个CAG重复道长度（见下文）。转基因表达扩展的CAG转录物，并被翻译成带有扩展的聚谷氨酰胺束的HTT外显子1片段。据报道，男性在传播后表现出有限的CAG不稳定性，女性不育[10],[56]R6/1小鼠被广泛用于评估HD发病机制和CAG不稳定性，后者的结果发现组织特异性不稳定性依赖于Msh2公司和女士3 [13]，部分依赖于Ogg1号机组和尼尔1 [31]R6/1小鼠也被发现通过Csb公司，并且不受分1 [25],[32]此外，R6/1小鼠的CAG不稳定性对转录进展敏感[58]碱基切除修复蛋白的组织特异性化学计量水平[54].

几项研究已经报道了CAG/CTG重复不稳定性的其他修饰物的存在，因为携带相同HD或DM1 CAG/CTG转基因的不同小鼠品系具有不同水平的重复不稳定性[16],[59],[60]同样，一些亨廷顿舞蹈症家族的极端重复变化表明，存在可能遗传的家族特异性不稳定性修饰因子[61]然而，这些研究均未提出候选因子作为CAG/CTG不稳定性模式中应变特定变化的来源。在这里，我们已经确定了两个近交系小鼠株C57BL/6J（B6）和BALB/cByJ（CBy）之间可变CAG重复不稳定性的来源，这两个小鼠株是一个同源的CAG重复序列HTT公司外显子1转基因（R6/1）。使用同源和相互同源的小鼠，我们在女士3基因作为不同品系R6/1转基因小鼠体细胞CAG不稳定性的可变水平的来源。B6 MSH3蛋白变体高度表达并与扩张偏向突变相关，而CBy MSH3蛋白质变体表达水平较低，并与CAG道稳定性相关。

结果

C57BL/6J和BALB/cByJ小鼠CAG重复不稳定性

为了评估不同遗传背景小鼠CAG重复序列的不稳定性，我们回交了B6CBA-Tg（HDexon1）61Gpb（R6/1）转基因小鼠[10]以B6和CBy近交系小鼠获得B6.Cg-Tg（HDexon1）61Gpb（B6.Cg-R6/1）和CBy。Cg-Tg（HDexon1）61Gpb（CBy.Cg-R6/1）同源系。这些同源系在每一代都进行了R6/1转基因的分型，因此经过10次回交世代后，预测自交系（B6或CBy）99.8%的基因组是纯合的，而其余0.2%的基因组仍然是杂合的。B6.Cg-R6/1和CBy。Cg-R6/1同源小鼠分别含有（CAG）98和（CAG顺式-元素。全基因组SNP分析证实HTT公司转基因已整合到3号染色体[57]并显示同类菌株相邻区域的污染最小(图S1A,表S1). 我们用SP-PCR分析了20周龄小鼠肝脏、纹状体、尾部和心脏的CAG不稳定性。B6.Cg-R6/1小鼠表现出高度的躯体不稳定性，倾向于肝脏和纹状体的扩张(图1A)而重复在心脏和尾部相对稳定，如前所述[10],[13]令人惊讶的是，CAG重复序列在年龄匹配的CBy的所有这四个组织中都非常稳定。Cg-R6/1小鼠，包括肝脏和纹状体(图1A). 如前所述，CBy背景的稳定作用与MMR蛋白MSH2的遗传缺陷一样显著[13]因此，B6.Cg-R6/1和CBy之间的体细胞CAG扩增水平可能存在显著差异。Cg-R6/1小鼠，表明CAG扩增受遗传背景影响。

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图1

典型的CAG重复分布，以及女士3B6和CBy小鼠的变异。

A） 放射自显影显示了从心脏、肝脏、纹状体和尾部提取的DNA的典型SP-PCR分析。断奶时，B6.Cg-R6/1（B6）和CBy。Cg-R6/1（CBy）同源小鼠分别包含在尾部DNA（CAG）98和94中。为了比较Msh2公司图中显示了−/−鼠标。在每个反应中，用引物MS-1F和MS-1R扩增约5-10个DNA可扩增分子。动物20周大。B） 同源CBy。将Cg-R6/1小鼠与B6杂交，并将所得F1后代杂交以产生具有所有可能基因型的F2小鼠女士3轨迹。通过使用荧光标记引物扩增10 ng基因组DNA并通过毛细管凝胶电泳解析片段来检测重复不稳定性(图1B). 使用这种高分辨率方法，重复长度分布呈现典型的“刺猬”模式(例如 [10],[13],[15],[16]此模式反映了样本中的体细胞镶嵌和由塔克聚合酶滑移[62],[63]PCR人工制品主要是重复收缩，因此这里不考虑这些。CAG重复不稳定性的模式取决于MSH3位点的基因型。B6纯合子导致最大的不稳定性，CBy纯合子造成扩展不足，而杂合子导致中间不稳定性，表明基因剂量效应女士3轨迹。数字表示对应于主要峰值的CAG重复大小。此外，在B6跟踪上，第二个数字表示检测到的最高CAG重复数。C）女士3多态性女士3来自C57BL/6（B6）和BALB/cBy（cBy）小鼠的基因。发起人是相同的。SNP被识别或确认为数据库SNP通过对女士3基因。

体细胞CAG不稳定性女士3基因座互惠同源小鼠

为了测试MSH3蛋白变体对CAG不稳定性的潜在作用，我们创建了女士3-携带B6基因的基因座互惠同源小鼠女士3CBy遗传背景上的变异（CBy.B6-msh3^B6/B6)和CBy女士3B6遗传背景中的变异（B6.CBy-msh3^C年/C年). 每个品系与受体菌株回交10次，如同在R6/1同源品系的创建中一样。接下来，将它们适当地与R6/1同源系杂交，以产生在女士3B6遗传背景上的位点和R6/1转基因的半合子（B6.By-msh3^C年/C年，R6/1）和小鼠B6纯合子女士3CBy遗传背景上的位点和R6/1转基因的半合子（CBy.B6-msh3^B6/B6，R6/1）。使用这些小鼠，我们可以更好地分离每种药物的作用女士3CAG稳定性在两种小鼠背景下均存在差异。全基因组SNP基因分型显示互惠同源菌株B6.CBy-msh3中供体单倍型污染最小^C年/C年和CBy。B6-毫米3^B6/B6以及相应的R6/1同源菌株B6.Cg-R6/1和CBy。抄送至R6/1(图S1B,表S1). R6/1转基因3号染色体整合位点的基因组侧翼区域外[57]在CBy背景系中，供体DNA似乎没有受到污染，而在第6、15和17号染色体上的B6背景系中只有少数区域存在残余杂合性。污染区域与女士3互惠同源中的基因包含数量有限的基因(图S7)，其中没有一个在CAG重复不稳定性中有明显或记录的作用。链接到的区域女士3CBy中的基因。B6-Msh3 R6/1互惠同源小鼠跨度43 Mbp，包含314个基因，其中233个为蛋白质编码基因(图S7). 在B6.CBy-Msh3 R6/1菌株中，连锁基因覆盖了大约22 Mbp的区域，位于CBy的43 Mbp区域内。B6-Msh3 R6/1菌株。在这个区域内共发现151个基因，其中有104个蛋白质编码转录本(图S7). 因此，菌株之间和菌株内部CAG不稳定性的差异被解释为渗入的结果女士3等位基因变异。在16-20周龄时，含有B6的小鼠的肝脏中出现了高水平的CAG扩张女士3B6和CBy背景的基因。这种不稳定性明显表现为广泛的双峰分布，而CBy小鼠的肝脏DNA女士3基因表现出低水平的不稳定性，呈单峰分布(图2A). 纹状体CAG不稳定性的类似模式进一步表明，B6小鼠的CAG不稳定程度更高女士3与CBy患者相比女士3基因(图2B). 携带B6的小鼠之间不稳定性水平的显著差异女士3与CBy相比女士3无论背景如何，都支持B6的概念女士3基因变异比CBy在更大程度上推动CAG扩张女士3基因变异。

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图2

代表性CAG重复分布女士3同类系小鼠。

用于确定CAG重复序列大小的典型GeneScan记录道，如图1B16–20周龄R6/1转基因小鼠的肝脏（A）和纹状体（B）显示纯合子在女士3同源互惠小鼠膨胀模式的位点。无论遗传背景如何，同源位点的CBy纯合子都会导致体细胞膨胀的丧失，而B6纯合子则允许体细胞膨胀。

我们还评估了12周龄和24周龄小鼠睾丸和精子的CAG重复不稳定性(图S2). 无论年龄大小，CAG重复序列在两种小鼠系的种系中都相对稳定，这与在我们的群体中观察到的相对较低水平的传播突变一致，也与之前关于R6/1小鼠的报道一致[10],[13]在24周龄B6的睾丸中观察到单个重复单位的一些变化，在精子DNA的SP-PCR分析中观察到类似的范围。这些微小的变化在CBy小鼠的生殖系中没有明显观察到(图S2). 然而，R6/1转基因小鼠中的CBy。Cg-R6.1系最初有～115个CAG重复序列，在～12年的传播过程中减少到～95个重复序列（未显示）。这一观察结果与MMR蛋白水平降低时CAG收缩发生的趋势一致[16],[26],[27],[34]–[36],[49]通常，R6/1线路会偶尔引起1-2个重复单位/传输的扩张和罕见的大收缩[64].

MSH3，但不是MSH2或MSH6，蛋白质水平为女士3基因变异相关

为了测试以下可能性女士3多态性可能影响MMR蛋白的表达，从而导致小鼠品系间CAG不稳定的程度不同，我们通过Western blotting评估了小鼠组织中MMR蛋白水平[38],[42],[45]在肝脏中，所有小鼠品系的MSH2和MSH6水平相似(图3A). 然而，MSH3蛋白的水平在小鼠之间差异很大，在携带B6的小鼠中高表达女士3携带CBy小鼠的基因和检测不到的水平女士3基因(图3A). 在B6和CBy杂合子小鼠中可重复观察到中等水平的MSH3女士3基因，B6和CBy基因背景，因此表明基因剂量效应女士3变异等位基因。这种模式不随年龄变化(图3A; 比较4周和16周）。仅使用MSH3特异性抗体即可观察到相同的MSH3表达模式(图3B，右侧面板）。纹状体显示出相同的菌株特异性MSH3表达模式，其中小鼠B6纯合女士3该基因显示MSH3蛋白水平最高，而小鼠CBy纯合子女士3基因表达水平最低，小鼠杂合子为女士3等位基因显示中间MSH3蛋白表达(图3B，右侧面板）。值得注意的是，MSH3水平的变化取决于女士3变异，与小鼠品系背景无关。脾脏、胸腺、皮质和小脑也显示出类似的情况女士3MSH3蛋白表达的基因差异特异性模式(图S3). 为了确保明显的表达变化不是由于抗体识别其表位的不同能力所致，我们使用一种独立的单克隆MSH3抗体（5A5，识别第4外显子内的表位，而2F11，识别第1外显子中的表位）分析了MSH3蛋白的表达，如下所述[65]我们观察到相同的表达模式，表明组织中观察到的MSH3水平与MSH3上抗体的结合位点无关(图S4). 因此，无论遗传背景如何，MSH3蛋白表达水平取决于小鼠是否携带B6女士3变体（高）或CBy女士3变量（低）。

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图3

MMR和DHFR蛋白水平的Western blot分析。

4周龄和16周龄小鼠肝脏和纹状体中MMR的表达。肌动蛋白被用作加载控制。MSH2:104 kD，MSH6:160 kD，MSH3:127 kD（Ab=2F11），肌动蛋白：42 kD。DHFR在4周龄和16周龄小鼠皮层中的表达DHFR:21 kD。A） 同时使用肝脏中MSH2-、MSH3-、MSH6-和肌动蛋白特异性抗体进行Western blot。抗体稀释见材料和方法.B）仅使用肝脏和纹状体中的抗MSH3（Ab=2F11）和肌动蛋白抗体进行Western blot。C） 4周龄和16周龄小鼠皮层DHFR的Western blot分析。

MSH3在不同小鼠品系中的表达

B6变异体中MSH3的较高水平可能是由于氨基酸序列稳定，或者CBy变异体的MSH3较低水平可能是因为氨基酸序列不稳定。由于MSH2的水平在同源和互惠同源之间是一致的，我们假设MSH2变体对MSH3水平的贡献小于MSH3。朝向识别女士3可能影响MSH3蛋白水平的基因多态性，我们对女士3来自其他12个近交系小鼠的启动子和外显子2、3、7、8和10变异基因（A、AKR、C3H、CBA、FVB、DBA/2、129P2、129S1、129S2、129S6、129T2和129X1）。这些小鼠系含有类似于CBy或B6的变异氨基酸(图4A,表S2). 接下来，我们评估了含有B6和CBy的各种菌株中的MMR蛋白水平女士3基因编码多态性(图4B). MSH3的表达因菌株而异。MSH3在CBy中几乎检测不到，在B6和C3H/HEJ中最高(图4B). 这些MSH3水平与在我们的CBy-和B6互惠的先天性小鼠中观察到的较低和较高水平相似-女士3等位基因。MSH3在B6和C3H/HEJ小鼠中最高，它们在外显子3、外显子7和外显子10中共享等位基因，表明这些可能对MSH3水平有积极影响。DBA/2J、CBA/J和129/S1的MSH3水平中等(图4B)这些基因都与第10外显子的B6变异体相同，这为第10外显子的稳定关联提供了额外支持。DBA/2中MSH3的表达高于CBy进一步支持了这一点，因为DBA/2与CBy在外显子10中存在两个多态性(图4A). 我们的结果表明，外显子3、外显子7和外显子10内的多态性可能调节小鼠组织中MSH3蛋白的水平。

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图4

不同鼠种MSH3编码多态性和蛋白表达。

A）女士3多态性女士3来自C57BL/6（B6）和BALB/cBy（cBy）小鼠的基因。发起人是相同的。SNP被识别或确认为数据库SNP通过对女士3基因。在DBA/2J外显子8中，AA#392被正确鉴定为T/Valine。对于给定的氨基酸，变体使用相同的密码子。14个小鼠菌株的MSH3蛋白多态性的完整集合表S2.B）使用两种不同的MSH3抗体在不同背景的脾脏提取物中表达MSH3[65]5A5的快速迁移带是一种非特异性交叉反应产物，如5A5所述，但不是2F11[65]本研究中的所有其他数字均使用2F11。C） 用于确定CAG重复序列大小的典型GeneScan记录道，如图1BCBy和其他近交系小鼠F1子代肝脏的典型CAG重复分布。顶部、底部和第二个面板分别显示控件CBy（稳定）、B6（不稳定）和CBy X B6（中间）CAG轮廓。注：蛋白质印迹数据来自近交系小鼠。C3H和B6中较高水平的MSH3在与CBy的交叉中减半。

进一步支持CBy的CAG重复稳定效应女士3变种，我们越过了CBy。Cg-R6/1小鼠与上述12种小鼠（包括B6）相比，其含有不同的女士3基因变体(图4A,表S2). 所有F1小鼠在其肝脏和/或纹状体中恢复了中等水平的CAG不稳定性，这与这组女士3变异是CAG/CTG不稳定性改变的来源(图4C). 值得注意的是，在CBy的3个独立十字架上。Cg-R6/1至C3H/HeJ显示MSH3的最高表达，所有F1小鼠肝脏均表现出相同的CAG不稳定性模式，扩展的等位基因分布广泛，延伸至多达+12个重复。这种剂量效应与MSH3水平对CAG不稳定性的主导作用一致。对MSH3剂量效应的进一步支持是，除了4周龄小鼠的尾部组织外，CBy或B6小鼠的尾部或心脏中几乎完全不存在MSH3蛋白。该表达谱与在这些组织中观察到的相对稳定的重复道相关，而与小鼠菌株无关(图S5，另请参见图1). 这些发现与组织特异性MSH3水平和组织特异性CAG稳定性水平的直接关联一致。

T321I MSH3变体高度保守，可能会破坏MSH3蛋白的稳定性

为了揭示可能导致CBy变异体中MSH3蛋白表达缺失的潜在氨基酸变化，我们检查了MSH3同源物的序列和结构特征。序列比对表明，大多数B6-CBy变异体都很保守，但发生在氨基酸变化预计不会产生物理化学后果的地方，或发生在保守程度低的区域，表明这些区域对蛋白质的结构/功能的贡献最小(图5A). 一个例外是T321I变异体，它在16/17哺乳动物同源物和酵母中保守。此外，在这一例外情况下（在大熊猫和酵母中），苏氨酸被物理化学相似的丝氨酸取代，因此观察到该位置的羟基高度保守(图5A和图S6). 重要的是，T321变型发生在I型β转弯内(图5B)异亮氨酸极为不利(图5B)[69]尽管进化距离很大，但在大肠杆菌MutS（静音）(图5B)[70]，表明该地区对整体功能的重要性。β-转角被认为对蛋白质折叠过程至关重要[71],[72]在那里，它们可能将二级结构元素的核化指向疏水性坍塌[73]在MSH3的转折点内，“i+2”位点苏氨酸转变为不受欢迎的异亮氨酸可能会破坏β-转角，这是蛋白质折叠的一个重要障碍，可能导致蛋白质水解。T321I变化对MSH3蛋白稳定性的全部影响可能需要一些其他氨基酸的变化，这将需要进行实验评估。

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图5

MSH3的结构和序列分析。

A： MSH3的多序列比对。Jalview创建的可视化[120]使用小鼠B6 MSH3的前500个氨基酸({“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“NP_034959.2”，“term_id”：“68299763”}}NP_034959.2号). 守恒值和一致序列基于酿酒酵母3p女士，大肠杆菌MutS和17种哺乳动物MSH3同源物；值的范围从0到9，其中0是最低的，9是最高的。所示的蛋白质相互作用域与人类MSH3蛋白的这些区域有关。此面板仅显示MSH3序列物种的缩写集，分析的完整集如所示图S5.B：β-圈内的MSH3变体。T321I变型发生在I型β转弯内，由特定的主干转弯角度决定[117],[118]来自人类MSH3结构（3THW_B）。左上角：β-圈Cα原子的hMSH3管图（蓝色），我+2（T）残留物（红色）和N端和C端的另外三个残留物。左下表显示整个MutS/MSH3同源物的β-转向倾向相对较强，而CBy变体（异亮氨酸i+2个位置）极不受欢迎（表格左下角）[69]右：Asp（D）和Thr（T）残基β-圈接触部位的球状和棒状图，分别与残基194和214相连。Thr（T）羟基在365位置与邻近苏氨酸残基接触的线图。苏氨酸羟基的缺失可能对稳定β-圈本身很重要，和/或可能改变圈的构象，可能破坏对蛋白质正确折叠很重要的远距离接触。使用PyMol创建的MSH3可视化（PyMol分子图形系统，版本1.2r3pre，Schrödinger，LLC）。

讨论

三核苷酸重复不稳定性由以下因素控制顺式-元素和反式-作用修饰语。重复长度、重复序列、重复纯度、基因组背景和DNA代谢蛋白可能导致DM1、HD和SCA7等三核苷酸重复疾病小鼠模型的重复不稳定模式[19]由于R6/1转基因对本文所述的每种小鼠系都是常见的，因此菌株之间CAG不稳定性的可变水平不太可能是顺式-元素，很可能是由于女士3基因变异。进一步支持反式-可变CAG稳定性来源的因素是B6、FVB和129种小鼠菌株不影响HTT公司敲除或YAC HD小鼠的mRNA水平[59]从而反对转录作为in的作用顺式不稳定性的应变间变化的来源。到目前为止，还没有关于改变重复不稳定性的自然发生的小鼠菌株特异性因子的报告。

在HD和DM1小鼠中Msh2公司和女士3被鉴定为三核苷酸重复不稳定性最强的修饰物，表明MutSβ在三核苷酸重复稳定性中起着重要作用[9],[37]MMR缺陷使两种不同HD小鼠自发扩张的CAG/CTG重复道稳定[13],[27],[36],[46]和三种不同的DM1小鼠模型[16],[26],[28],[34],[35],[74]这些结果表明MMR蛋白对CAG/CTG不稳定性的影响与顺式-元素和序列上下文。我们观察到两种不同类型的体细胞CAG不稳定性小家鼠背景、CBy和B6，并对女士3并在外显子2、3、7、8和10中发现7个多态性，这些多态性在菌株之间存在差异。因此，这两种应变之间CAG/CTG不稳定性的差异可能受到以下因素的调节女士3多态性。通过为女士3基因，我们证明CAG/CTG重复不稳定性似乎受女士3B6纯合子小鼠的肝脏和纹状体的扩张水平最高的变体女士3基因。CBy纯合小鼠女士3该基因显示无CAG不稳定性。我们还表明，MSH3蛋白的表达依赖于女士3基因变异，独立于外部遗传背景女士3基因座：B6 MSH3蛋白变体在高水平表达，而CBy MSH3变体在几乎无法检测到的水平表达。MSH3蛋白表达模式与体细胞CAG扩增水平呈正相关。失去一个B6女士3两种变体的小鼠杂合等位基因足以降低CTG/CAG不稳定性；与结果一致，即MSH3蛋白水平是DM1和HD小鼠模型CAG/CTG重复扩增的限制因素，其中MSH3/null小鼠的扩增比MSH3/MSH3小鼠少，但比null/null小鼠多[16],[27],[35]有趣的是，失去一个女士3等位基因(女士3/null）比失去一个更具戏剧性Msh2公司等位基因[13],[27],[35]表明CAG不稳定性可能对MSH3水平非常敏感。在修复试验中，人类MSH3蛋白水平改变了修复CAG/CTG重复序列形成的滑脱DNA的能力[42]B6和CBy菌株之间MSH3蛋白的不同水平不太可能是由于转录水平的不同，因为我们检测到菌株之间DHFR蛋白的水平相似，其转录物来自与CBy菌株相同的差异转录启动子女士3基因[66]–[68]此外，大量证据表明MMR转录水平并不总是反映MMR蛋白水平[48]MSH3和MSH6蛋白质的稳定性取决于这些蛋白质形成异二聚体复合物的能力[48]; 在小鼠中Msh2公司导致检测不到MSH3蛋白水平[45]然而，B6和CBy菌株的MSH2蛋白水平没有变化(图3)和MSH3蛋白水平（低或高）在互惠同源小鼠中持续存在；通过菌株特异性MSH2表达水平或MSH2变体反对MSH3水平的变化。

MSH3编码区的多态性可能直接或通过改变其与MSH2的相互作用来改变MSH3蛋白的稳定性[47],[48]特别是，尽管我们的同源性建模结果没有深入了解哪些变体位于对整体蛋白质结构至关重要的区域，也没有发现多态性位于已知的蛋白质结合结构域(图5A和图S6)，高度保守的T321I变异体发生在I型β-转角内，这可能是蛋白质折叠的关键[71],[72].β-Turn序列的变化调节蛋白质稳定性[71],[72],[75],[76]其中不利的序列改变可以显著降低蛋白质折叠速率[77],[78]在某些情况下，完全消融蛋白质表达[79]除了T321I变异体带来的潜在变化外，CBy菌株在同源人类MSH3蛋白（hMSH3中的位点116）中实验测定的氨基酸79处获得了潜在的丝氨酸磷酸酯[80]，可能影响整体蛋白质构象、其蛋白质结合能力和稳定性[81]虽然任何MSH3氨基酸变体的实际贡献，单独或与其他变体一致，都需要实验支持，但我们的研究结果支持对蛋白质稳定性的影响。

这里我们已经表明，MMR基因中自然发生的遗传变异，就像MMR基因的工程遗传缺陷一样，可以导致CAG/CTG重复不稳定性的方向和模式发生变化。损失Msh2公司和女士3导致扩张损失和CAG/CTG收缩增加；提示MMR蛋白既可以促进扩张，也可以防止收缩[16],[26],[27],[34]–[36],[49]CAG不稳定性的模式也受MMR基因的影响，可能通过诱变事件中重复单位数量的变化反映出来。大规模扩张可能涉及两种不同的机制；每次诱变事件中许多短（单重复）长度变化的累积；或每个诱变事件的有益大跳跃（多次重复）。体内HD和DM1小鼠某些组织中重复长度双峰分布的观察结果表明存在两种不同的机制[13],[27]这在一些患者组织中也很明显，可能是由于细胞谱系特异性不稳定性[4],[82]–[84]重复长度的这种双峰分布仅在B6纯合的情况下观察到女士3基因(图1和图2). 最近对HD小鼠的建模研究表明，与不同的短期和大型诱变事件有关[25]类似地，据报道，在MMR-缺陷型（hMSH2、hMLH1、hPMS2）人类而非小鼠的肿瘤中，二核苷酸重复出现两种不同的重复不稳定性模式，即重复次数变化小于或等于6次的肿瘤和重复次数变化大于8次的肿瘤[85]–[87]在患有CAG/CTG疾病的患者的培养细胞和某些组织中，突变事件似乎是短增量的，每个突变事件有1到3个CTG/CAG单位[88]，类似于其他简单重复出现的情况，如（CA）n和（A）n[85],[89],[90]有趣的是，在携带CBy的小鼠中，CAG扩增的双峰分布丢失女士3这可能表明MSH3参与了更大的重复扩增。然而，hMutSβ对修复单个重复单元的短滑出而非长滑出（>3个单元）的要求，强烈支持了我们在小鼠中观察到的MSH3敏感性扩张事实上是许多单重复扩张事件的累积这一概念[42].

在HD和DM1小鼠模型中，提出了小鼠遗传背景对CAG/CTG扩增动力学的影响，但未提出变异来源的候选[16],[59]范登·布鲁克等.，（2002）在C3H背景下显示出最大的CTG不稳定性，而Lloret等人，（2006）在B6背景下观察到最大的CAG不稳定性和129Sv背景下的低水平不稳定性[16],[59]。这些对独立转基因小鼠的观察表明，B6小鼠的重复不稳定性最高女士3基因（C3H和B6）和CBy小鼠的低不稳定性女士3基因（129）与我们的发现一致，即B6 MSH3变异体是CAG扩张的主要驱动因素，也与B6和C3H小鼠中MSH3蛋白的高水平一致。尚不清楚为什么女士3多态性似乎影响MSH3蛋白水平，存在于各种小鼠谱系中。我们提出，小鼠品系之间MSH3蛋白的差异可能为其他实验室观察到的体细胞CAG不稳定性的一些品系特异性差异提供了分子解释[16],[59].

其他DNA代谢蛋白中的DNA多态性可能会影响CAG/CTG的不稳定性模式，并且这种家族特异性的不稳定性修饰因子已被认为存在于HD家族中[61].许多反式-CAG/CTG不稳定性的影响因素已被考虑，而对其多态性变体的可能贡献进行评估的因素很少。人类FEN1突变体及其多态性变体均与HD患者的CAG不稳定性无关[91]据报道，OGG1在R6/1小鼠CAG不稳定性中起部分作用[33]据报道，与携带Ser326变异体的HD患者相比，携带Cys326-OGG1等位基因的亨廷顿患者的HD CAG束长度增加，发病时间明显提前[92]然而，在使用较大样本量的研究中没有观察到这种关联[93]我们最近的观察表明，人类错配修复蛋白MLH1是修复短CTG滑脱所必需的，并被聚集滑脱所阻止，这可能表明MLH1参与CAG/CTG扩张，而MLH1变异体可能具有不同的作用[94].人类的多态性MSH2型已在遗传性非息肉病性结直肠癌患者中发现，这些患者被认为灭活了MSH2–MSH3复合物的功能，但没有灭活MSH2-MSH6复合物；导致酵母移码突变的改变[95],[96].的多态变体人MSH3与癌症和辐射敏感性密切相关[97]–[100]然而，在任何情况下，都没有任何证据表明特定的人MSH3变异，也不是hMSH3变异与诱变结果的任何直接联系。

可能的多态性女士3影响其他重复序列的不稳定性？错配修复蛋白以不同的方式作用于不同重复序列的不稳定性/稳定性。损失女士3可导致单二核苷酸、三核苷酸和四核苷酸重复区的单个重复单位发生不同程度的变化（主要是丢失）[101]以及其中的参考）。错配修复蛋白在扩展重复序列不稳定中的作用，包括FRDA疾病相关GAA束、小鼠Ms6-hm（也称为Pc-1）（CAGGG）n和hm-2（GGCA）n重复序列，与它们对CAG/CTG重复序列的影响差异很大[102]–[106]这些发现共同支持了MMR在不同重复序列中的作用可能会显著不同的论点。因此，需要为每个序列确定MMR基因多态性对不同重复序列的影响。然而，由于女士3在不同的转基因环境中，变异似乎对CAG/CTG不稳定性有相似的影响，MMR基因多态性对14个不同的CAG/CTG疾病位点（包括HD、DM1、SCA7等）的影响可能是相似的。

我们的数据提供了第一个证据女士3HD小鼠中与CAG/CTG三核苷酸不稳定性水平相关的多态性变体。这一发现可能导致鉴定人类多态性变体，从而解释HD和DM1患者CAG/CTG不稳定性的极端变异性。由于个体生命中的躯体重复扩张可能会导致疾病的严重程度和进展，因此影响这一点的因素可能具有临床相关性[1],[7],[8],[9]未知遗传因素改变HD家族和HD小鼠疾病的发病和严重程度[60],[107]–[109]HD家族或个体之间体细胞CAG不稳定性水平的未经探索的变化可能是这些临床变化的来源。DNA修复基因中导致体细胞CAG/CTG扩增增强的多态性变体可能最终导致疾病进展和严重程度增加。同样，导致体细胞扩张减少的变异可能危害较小。在患有14种CAG/CTG疾病中的任何一种的个体中鉴定这种变体可能具有预后意义。此外，试图调节MMR以调节CAG/CTG重复相关疾病[9]明智的做法是考虑MMR蛋白的任何特定变体，这些变体可能会对不稳定性水平产生不同的影响。

材料和方法

支持信息

致谢

资金筹措表

这项工作得到了加拿大卫生研究院（CIHR MOP97896）（CEP）、加拿大肌肉营养不良协会（雷切尔基金会）（CEP）的支持，并得到了致敬社区（CEP，李斯特预防医学研究所（DGM）、威康信托基金会（DGM。MMS得到了来自病童医院研究训练比赛和CIHR分子医学合作研究生训练计划的学生奖学金以及安大略省研究生奖学金的支持。GWC得到了CIHR蛋白质折叠：原理和疾病培训项目的一个奖学金的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。

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