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成瘾生物。作者手稿；PMC 2014年3月1日提供。
以最终编辑形式发布为：
成瘾生物。2013年3月；18(2): 297–306.
2012年12月14日在线发布。 数字对象标识：10.1111/adb.12018
PMCID公司：下午358204
美国国立卫生研究院：NIHMS423881
PMID：23240885

饮酒和剥夺酒精对嗜酒（P）大鼠中边缘系统细胞外谷氨酸基础浓度和清除率的影响

郑明鼎,扎卡里·罗德,埃里克·恩格曼,杰森·A·贝利,德博莫·K·拉希里、和威廉·麦克布莱德
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

本研究确定了自愿饮酒和剥夺饮酒对中边缘系统基础细胞外谷氨酸浓度和清除率的影响，并验证了长期饮酒会持续增加基础谷氨酸神经传递的假设。使用三组嗜酒（P）大鼠：“水组（WG）”、“乙醇维持组（MG；24小时自由选择水vs 15%乙醇）”和“乙醇剥夺组（DG；剥夺2周）”。定量微透析和Western blots用于测量基础细胞外谷氨酸浓度、清除率和与谷氨酸清除率相关的蛋白质。慢性饮酒使后腹被盖区（4.0μM vs 7.0μM）和伏隔核外壳（3.0μM vs.6.0μM）的细胞外基础谷氨酸浓度增加70-100%。与WG大鼠相比，MG大鼠两个区域的谷氨酸清除率降低了30-40%。此外，Western blot显示MG大鼠与WG大鼠的兴奋性氨基转运体1（EAAT1）蛋白减少了40-45%，但EAAT2或胱氨酸-谷氨酸反转运体水平没有显著变化。增加的谷氨酸浓度恢复到控制水平，伴随着剥夺后谷氨酸清除率的恢复。这些结果表明，长期饮酒增加了中边缘系统细胞外谷氨酸的浓度，部分原因是清除率降低，这表明谷氨酸神经传递增强可能有助于维持饮酒。然而，由于谷氨酸水平在剥夺后恢复正常，谷氨酸神经递质升高可能不会导致反复饮酒。

关键词：饮酒、酒精剥夺、嗜酒大鼠、谷氨酸神经传递、谷氨酸转运体、伏隔核、腹侧被盖区

介绍

大脑谷氨酸功能的改变与酒精的影响有关(Gass&Olive 2008年,斯潘格尔2009). 离子型NMDA受体对乙醇的急性抑制敏感，而慢性乙醇暴露可上调NMDA的表达并增加中边缘系统的兴奋性突触强度(Lovinger等人1989年,Stuber等人，2008年,伍德沃德1999). 急性全身注射乙醇可在包括伏隔核（NAC）和腹侧被盖区（VTA）在内的多个脑区内产生细胞外谷氨酸水平的双相改变(Ding等人2012,Moghaddam&Bolinao 1994年). 临床前研究也表明，谷氨酸传递的药理拮抗作用可以减少乙醇在各种动物模型中的增强和奖赏作用(Gass&Olive 2008年,Vengeliene等人2008). 此外，美国食品药品监督管理局（FDA）批准的一种用于预防酒精复发的药物阿卡姆膦的临床疗效与其抗谷氨酸性能有关(Mann等人，2008年). 最近的一项核磁共振波谱研究进一步证实，阿丙膦酸显著降低了戒酒者扣带回皮层的谷氨酸水平(Umhau等人2010).

微透析研究表明，通过各种给药方案，乙醇暴露可使大脑中细胞外谷氨酸的传递普遍上调。乙醇依赖是由反复腹腔内注射乙醇或长时间接触乙醇蒸汽引起的，与停止乙醇治疗后不久纹状体、海马和NAC中细胞外谷氨酸水平增加有关(Dahchour和De Witte，1999年,Dahchour和De Witte 2000年,罗塞蒂和卡博尼1995). 借助定量微透析技术，一些研究小组报告称，反复腹腔注射乙醇显著提高了中边缘系统细胞外谷氨酸的基础浓度(Ding等人2012,卡帕索娃和苏姆林斯基2008,Melendez等人2005年). 这些发现与最近对人类酗酒者或酒精依赖大鼠的神经影像学研究一致，这些人的内侧额叶皮层和纹状体中谷氨酸水平显著升高(Hermann等人2012,Zahr等人2009年). 值得注意的是，所有这些动物研究都使用了强制乙醇给药，而自愿饮酒对基础细胞外谷氨酸传递的影响尚未研究。

细胞外谷氨酸受多种过程调节，其中谷氨酸转运体对谷氨酸的清除起着关键作用。星形胶质细胞衍生的兴奋性氨基酸转运体1和2（EAAT1和EAAT2）是两种最丰富的转运体，负责大多数脑区的大部分谷氨酸清除(丹博尔特2001,Tzingounis&Wadiche 2007年). 大量定量微透析研究表明，反复全身注射乙醇后谷氨酸清除率降低(Ding等人2012,卡帕索娃和苏姆林斯基2008,Melendez等人2005年). 另一方面，来自在体外研究结果并不一致。一些人报告说，急性或反复接触乙醇后谷氨酸再摄取活动减弱(Melendez等人2005年,Othman等人2002)而其他人则指出谷氨酸吸收活性增加(史密斯1997,Smith&Zsigo 1996年). 然而，这些研究并没有充分探讨清除功能改变的分子机制。使用在体外乙醇可以改变各种谷氨酸转运体的蛋白表达(Kim等人2005,Zink等人2004). 除了谷氨酸转运蛋白外，半胱氨酸-谷氨酸反向转运蛋白（xCT）也有助于调节细胞外谷氨酸水平。xCT释放的谷氨酸可在NAC中贡献高达60%的细胞外谷氨酸(贝克等人2002). 大量证据表明xCT在药物滥用和成瘾发展中起着重要作用(卡利瓦斯2009). 因此，研究长期自愿饮酒对这些蛋白质表达水平的影响是很重要的。

目前的研究利用酒精提呈（P）大鼠来检测自愿饮酒和剥夺对后部VTA和NACsh谷氨酸神经递质的影响。P大鼠表现出高度的酒精偏好，并表现出可靠的高度自愿饮酒和长期戒酒后的强烈的酒精剥夺作用(McBride&Li 1998年,Murphy等人2002). 使用这个模型，已经确定了慢性饮酒在中边缘系统产生的神经适应变化，其中一些变化在禁酒一段时间后持续存在(Rodd等人2005年,Thielen等人2004)采用定量无网通量微透析技术测量细胞外谷氨酸浓度和谷氨酸清除率。Western blot检测EAAT1/2和xCT蛋白的表达。中心假设是，长期自愿饮酒将导致中边缘系统内谷氨酸神经递质持续增加。

方法和材料

动物

成年雌性偏爱酒精的P大鼠（实验开始时体重225-250，印第安纳大学）成对被安置在温度和湿度控制的房间中，房间保持12小时的定期光暗循环（早上7:00点亮起），并提供食物和水随意使用雌性P大鼠是因为它们比雄性P大鼠能更好地保持头部大小，以实现更准确的立体定向放置，并且已用于一些需要精确放置的研究(Rodd等人2005年,Thielen等人2004). 本研究未监测发情周期。然而，平衡实验是在不同的日子进行的，所以发情周期的某一特定阶段的任何影响都会在不同的实验条件下进行分配。所有实验程序均在光阶段进行。协议由印第安纳大学医学院动物护理和使用委员会批准。所有实验均按照实验动物的护理和使用指南(1996年国家研究委员会).

化学试剂

乙醇（190标准偏差）是从密苏里州韦斯顿市麦考密克蒸馏厂获得的。邻苯二甲醛粉末和谷氨酸衍生稀释剂是从加利福尼亚州皮克林实验室购买的。aCSF和流动相中使用的盐均为HPLC级，并从西格玛（美国密苏里洲圣路易斯）获得。山羊抗EAAT1和羊抗EAAT2抗体从加利福尼亚州圣克鲁斯获得，兔抗xCT多克隆抗体来自马萨诸塞州Abcam。小鼠抗β-肌动蛋白抗体从Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）购买。增强化学发光剂由Pierce（美国伊利诺伊州赛默科学公司）提供。

乙醇饮用程序

大鼠的乙醇暴露遵循上述程序(Rodd等人2005年,Thielen等人2004). 在适应期结束后，将大鼠转移到金属吊笼中，并在整个实验过程中单独安置。将大鼠随机分为三组（6-10/组）。“水组”（WG）仅接受10周的水。“乙醇维持组”（MG）在前2周连续饮用水，并在两瓶选择模式下混合15%乙醇和水，再服用8周。“乙醇剥夺组”（DG）被给予8周的自由选择15%的乙醇和水，然后是两周的剥夺期，在此期间只有水。对于饮用乙醇的大鼠，每周随机改变乙醇和水瓶的位置，通过每周三次（周一、周三和周五）称量水瓶和乙醇瓶，记录液体摄入量，精确到0.1 g。乙醇液体摄入量换算为每公斤体重的乙醇克数（克/公斤/天）。在称重乙醇和水瓶的同时，记录大鼠的体重。

立体定向手术

立体定向手术在9年期间进行第个饮酒一周。将大鼠立体定向植入一根18号导管（Plastics one，Inc.，Roanoke，VA，USA），瞄准后部VTA（AP−5.6 mm，ML+2.1 mm，DV−9.0 mm）或NACsh（AP+1.7 mm，ML+2.3 mm，DV−8.5 mm）(帕西诺斯和沃森1998). 根据先前的研究结果，对后部VTA和NACsh进行了检查，结果表明这两个区域对乙醇的刺激和增强作用比前部VTA和NAC核心更敏感(Ding等人2009,Engleman等人2009年,Rodd等人2004). 套管与垂直方向成10°角植入。手术后将大鼠单独饲养，并允许其从手术中恢复至少5天，每天在微透析室进行习惯化和处理。恢复后，如前所述，构建微透析探针（活性膜长度1.5 mm，内径200μm，分子量截止值：13000，Spectrum Laboratories，Inc，Rancho Dominguez，CA，USA），并在微透析前约16-18小时插入后部VTA或NACsh(Ding等人2009).

微透析和谷氨酸分析

在微透析日，在开始微透析前至少2-3小时取出乙醇或水瓶，以确保血液中的乙醇降低到检测不到的水平。普通微透析遵循上述程序(Ding等人2012,Ding等人2009). 简单地说，将大鼠置于微透析室中，并用PE20管道（内径0.38 mm，美国马里兰州Becton Dickinson&Co.）连接到哈佛泵。微透析开始于90分钟的冲洗期，在此期间人工脑脊液（aCSF:140.0 mM NaCl，3.0 mM KCl，1.2 mM CaCl2，2.0 mM钠2高性能操作4·7小时2O、 1.0 mM氯化镁2pH7.2-7.4）通过探针灌注，然后收集基线样品。然后，随机通过后部VTA或NACsh灌注四种不同浓度的谷氨酸（aCSF中的1、5、10或20μM）。通过微透析探头灌流每种浓度的谷氨酸25分钟。灌流最后一种谷氨酸浓度后，将灌流介质改为aCSF并灌流20分钟。以2.0μl/min的流速每五分钟采集一次样品。

如前所述，使用反相高效液相色谱系统和电化学检测分析谷氨酸(Ding等人2012). 简言之，谷氨酸的柱前衍生化o个-使用ESA 542型自动取样器进行邻苯二甲醛检测。流动相由25%甲醇（v/v）和100 mM Na组成2高性能操作4·7小时2O、 pH值6.75，由ESA 582溶剂输送系统输送。透析样品注入反相柱（BDS Hypersil C18 Pioneer，150×2 mm），用BAS LC-4C安培检测器分离并检测谷氨酸，氧化电位设置为+550 mV，灵敏度设置为0.2μa。检测器的输出被发送到ChromePerfect色谱数据分析系统。通过比较峰面积和外部标准曲线来量化谷氨酸的浓度。

蛋白质印迹

按照上述程序对NACsh和后部VTA的脑组织进行微穿孔(McBride等人2009年). 微穿孔后，将组织转移到含有蛋白酶抑制剂（美国印第安纳州罗氏诊断公司）的M-PER蛋白质提取缓冲液（美国伊利诺伊州赛默科学公司）中，在4°C下以12000 rpm的速度均质并离心20分钟。上清液在−20°C下保存，直至使用。EAAT1、EAAT2和xCT的蛋白质印迹遵循前面描述的标准程序(Bailey&Lahiri 2010年). 简单地说，蛋白质浓度是用Bradford技术估算的。将大约20μg的组织蛋白加载并分离在10%聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）上，然后转移到聚偏二氟乙烯膜上。用山羊抗EAAT1抗体（1:500，加利福尼亚州圣克鲁斯）检测斑点(Melendez等人2005年)、山羊抗EAAT2抗体（1:500，加州圣克鲁斯）或兔抗xCT抗体（1:1000，马萨诸塞州Abcam）(Pamplega等人2011年)或小鼠抗β-肌动蛋白（1:10000，Sigma-Aldrich，MO）抗体。然后用适当的过氧化物酶结合二级抗体探测印迹，并用增强化学发光技术检测（美国新泽西州皮斯卡塔韦市GE Healthcare）。然后使用IMAGEJ软件对增强化学发光膜进行扫描和定量。蛋白质水平用组成性表达的蛋白质β-肌动蛋白标准化。

组织学

在每个实验结束时，用过量的一氧化碳对大鼠实施安乐死2吸入，并通过后部VTA或NACsh中的探针灌注1%溴酚蓝。大脑被迅速取出，立即冷冻在干冰上，并储存在−70°C下。切片（40μm）在冷冻切片机上切片，并用甲酚紫染色，以根据大鼠脑图谱验证探针的放置Paxinos&Watson（1998）.

统计分析

如前所述，使用多元线性回归分析无净流量数据(Ding等人2012,Thielen等人2004). 通过探针灌注的谷氨酸浓度定义为[GLU]在里面，从微透析样品中获得的谷氨酸浓度定义为[GLU]外面的谷氨酸的净增加或损失被定义为[Glu]在里面-[葡萄糖]外面的并对每个样本进行计算。[GLU]的这些值在里面-【GLU】外面的绘制为相对于[GLU]值的“y”轴在里面作为“x”轴。各组的斜率（提取分数，Ed）和x截距（细胞外谷氨酸浓度）通过多重线性回归建模确定，并使用8.02版SAS Windows系统通过方差分析分析乙醇的影响。Western blot数据采用单向方差分析进行分析。

结果

图1在大脑右半球，显示了后VTA和NACsh中探针的典型位置。后部VTA定义为前角后方5.3 mm至6.0 mm的水平(Ding等人，2009年,Rodd等人2004). 要包括在内，探针应在目标区域内至少有75%的活性膜。大约85%的动物符合标准，并被纳入分析。在NACsh和后部VTA的两侧进行了Western blots的微穿刺样本，但仅显示在大脑的左侧。

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微透析探针和微穿孔样品在伏隔核外壳（NACsh，A）和后腹侧被盖区（VTA，B）中的代表性放置。后部VTA是根据先前的研究结果确定的(Ding等人2009,Rodd等人2004). 线条代表微透析膜，圆圈代表微透析样品。微穿孔样本取自NACsh和后VTA的两侧，但仅显示在大脑的左侧。为了清晰起见，未显示重叠探针和微穿孔样品。

谷氨酸No-net-flux

MG组术前平均每日乙醇摄入量为5.1±0.4 g/kg/天，DG组为4.7±0.3 g/kg/日（t31=0.21，p=0.83）。MG组术前和术后饮酒量无显著差异（t30=1.5，p=0.15）。

在NACsh中，WG组细胞外谷氨酸浓度为2.7±0.4μM，MG组为6.1±0.5μM，DG组为3.3±0.5μM(图2B). 总体方差分析显示治疗效果显著（F（2404）=4.90，第页< 0.01). 事后分析表明，MG组的谷氨酸浓度显著高于WG组和DG组(第页值<0.05）。DG组和WG组之间未观察到显著差异。

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乙醇维持（MG）和剥夺（DG）对伏隔核壳细胞外谷氨酸浓度和提取分数（Eds）的影响（NACsh，n=8-10/组）。A） 水（WG）、MG和DG组的谷氨酸线性回归图；B） 从各组的no-net-flux点测定细胞外谷氨酸浓度；C） 根据每组线性回归分析图的斜率确定谷氨酸的Ed值*第页<0.05，与WG组差异显著。

在NACsh中，WG组、MG组和DG组各组的提取分数（Eds）分别为20±2%、12±2%和25±3%(图2C). 单因素方差分析显示治疗效果显著（F（2402）=12.35，第页< 0.001). 进一步分析表明，MG组的Eds显著低于WG组和DG组(第页值<0.05），而DG组的Eds与WG组没有显著差异。

WG组细胞外谷氨酸浓度为4.2±0.4μM，MG组为6.9±0.4μM，DG组后部VTA为4.8±0.5μM(图3B). 单因素方差分析显示治疗效果显著（F（2379）=6.96，第页< 0.01). 事后分析表明，MG组的谷氨酸浓度显著高于WG组和DG组(第页值<0.05），而DG组的谷氨酸浓度与WG组没有差异。

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乙醇维持（MG）和剥夺（DG）对后腹侧被盖区（VTA，n=7-8/组）细胞外谷氨酸浓度和提取组分（Eds）的影响。A） 水（WG）、MG和DG组的谷氨酸线性回归图；B） 从各组的no-net-flux点测定细胞外谷氨酸浓度；C） 根据每组线性回归分析图的斜率确定谷氨酸的Ed值*第页<0.05，与WG组差异显著。

各组的提取分数（Eds）分别为：WG组31±1%，MG组22±2%，DG组后VTA 31±3%(图3C). 单因素方差分析显示治疗效果显著（F（2377）=7.32，第页< 0.001). 进一步分析表明，MG组的Ed值显著低于WG组和DG组(第页值<0.05），而DG组的Ed值与WG组没有差异。

蛋白质斑点

MG组在8周饮酒期间的平均每日乙醇摄入量为5.8±0.4 g/kg/天，DG组为5.4±0.7 g/kg/日。两组之间没有显著差异（t28=0.44，p=0.63）。

NACsh中蛋白质的相对表达水平见图4对于EAAT1，乙醇饮用和剥夺史有显著影响（n=6-9/组，F（2,18）=5.2，第页<0.05.）MG和DG组EAAT1蛋白水平均显著低于WG组(第页< 0.05). MG组和DG组之间没有差异。三组EAAT2（n=6-7/组）、F（2,17）=0.8，p=0.48）或xCT（n=8/组，F（2,21）=0.9，p>0.05）的蛋白质水平无显著差异。

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Western blot分析表明乙醇维持（MG）和剥夺（DG）对伏隔核壳内兴奋性氨基酸转运蛋白1和2（EAAT1和2）以及胱氨酸-谷氨酸反转运蛋白（xCT）的蛋白水平的影响（NACsh，n=6-9/组）*第页<0.05，与WG组差异显著。

与NACsh相似，EAAT1在后VTA中的表达水平(图5)三组之间存在显著差异（n=6-9/组，F（2,18）=4.5，第页< 0.05). 事后分析表明，MG和DG组的蛋白质水平均显著低于WG组(第页< 0.05). 尽管MG组的EAAT2明显低于WG组（约30%）(图5B)，单因素方差分析未显示这些组之间的显著变化（n=8/组，F（2,21）=1.2，p=0.32）。此外，三组间xCT的表达似乎没有任何显著差异（n=7-8/组，F（2,20）=0.1，p>0.05）。

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Western blot分析表明乙醇维持（MG）和剥夺（DG）对后腹侧被盖区兴奋性氨基酸转运体1和2（EAAT1和2）和半胱氨酸谷氨酸反转运体（xCT）蛋白水平的影响（n=6-9/组）*第页<0.05，与WG组差异显著。

讨论

目前的研究结果表明，P大鼠长期自愿饮用乙醇会降低后部VTA和NACsh的谷氨酸清除率，并增加细胞外谷氨酸浓度。这些变化伴随着EAAT1蛋白水平的降低，而不是EAAT2或xCT蛋白水平的下降。这些结果表明细胞外谷氨酸浓度增加在中边缘系统中，由EAAT1水平降低介导，可能有助于维持饮酒。然而，剥夺两周后，尽管EAAT1水平持续下降，但谷氨酸清除率和浓度仍恢复到控制水平，这表明剥夺期间可能出现了其他因素（例如翻译后变化），以对抗EAAT1的低水平。这些后来的结果也表明细胞外谷氨酸浓度升高可能与反复饮酒无关。

当前研究的一个主要优势是将P大鼠用作自愿饮酒模型，该模型已被证明在当前的连续饮酒模式下可产生药理学相关的血液酒精水平（60-90 mg%）(McBride&Li 1998年,Murphy等人2002). 长期饮酒后，这些大鼠在这两个区域的基础细胞外谷氨酸浓度增加了60-100%。这些结果与之前对强制接触乙醇的动物进行的微透析研究一致(Dahchour&De Witte 2000年,Ding等人2012,Kapasova和Szumlinski 2008年,Melendez等人，2005年). 这些发现表明，乙醇的药理作用是观察到的变化的主要原因。除中边缘系统外，酒精暴露后，其他脑区细胞外谷氨酸水平增加，包括啮齿动物的纹状体和海马(Dahchour&De Witte 1999年,罗塞蒂和卡博尼1995). 最近的神经影像学研究也报告了急性戒酒后，人类酗酒者（前扣带皮层）和动物模型（内侧前额叶皮层和纹状体）的谷氨酸水平升高(Hermann等人2012,Zahr等人2009年). 这些发现表明，乙醇可能会使整个大脑的细胞外谷氨酸水平普遍升高。P大鼠长期饮酒可使后部VTA和NACsh细胞外谷氨酸清除率降低30-40%。这些结果与之前对反复腹腔注射乙醇的动物进行的定量微量透析研究一致(Ding等人2012,卡帕索娃和苏姆林斯基2008,Melendez等人2005年). 对有助于调节细胞外谷氨酸水平和清除的蛋白质的进一步测量表明，EAAT1蛋白质（约50%）在这两个区域显著减少，但EAAT2或xCT蛋白质没有减少。先前的研究梅伦德斯和同事（2005年）还检测了EAAT1和EAAT2芽的蛋白表达，在他们的研究中没有发现显著变化。这些作者使用的乙醇暴露方案（每天重复腹腔注射7天）可能不足以引起这种变化。

这些结果表明，EAAT1蛋白的降低可能是维持饮酒期间谷氨酸清除率降低和细胞外谷氨酸浓度升高的一个潜在机制。然而，应该注意的是，Western blot仅测量蛋白质水平，而不测量功能。因此，可能需要进行功能研究，以验证长期乙醇暴露后谷氨酸再摄取活性降低。EAAT1蛋白减少的机制尚不清楚。可能的解释是（a）乙醇诱导EAAT1 mRNA转录减少；（b） 乙醇对EAAT1基因的表观遗传调控；和/或（c）乙醇诱导EAAT1蛋白降解增加。EAAT1的改变是否发生在细胞膜或细胞内成分也尚不清楚。使用其他技术的未来研究，如细胞表面生物素化或交联结合免疫印迹分析(Boudreau&Wolf 2005年,Xu等人2003)，可能有助于回答此类问题。

另一方面，长期饮酒似乎并没有显著改变中边缘系统EAAT2或xCT的水平。在后部VTA中，EAAT2水平降低了约30%，但WG组的高变异性阻止了观察到统计意义。未来的研究可能需要重新评估乙醇对EAAT2表达和功能的影响。这些数据表明，EAAT2或xCT蛋白水平可能与微透析显示的谷氨酸清除率和浓度的改变无关。然而，鉴于蛋白质印迹不能直接测量功能，因此需要谨慎解释结果。因此，不应排除乙醇可能通过翻译后修饰产生改变EAAT2或xCT活性的变化。

尽管如此，目前的研究结果表明，EAAT1蛋白减少可能在维持饮酒中发挥作用。具有突变时钟基因的小鼠大脑EAAT1 mRNA和蛋白质水平的降低与酒精摄入量的增加有关每2个(Spanagel等人2005年). 这与调查结果一致增加细胞外谷氨酸水平谷氨酸转运体抑制剂DL-三-β-苄基氧天冬氨酸（TBOA）促进小鼠乙醇消耗(卡帕索娃和苏姆林斯基2008). 相比之下，最近的一项研究(Karlsson等人2012年)据报道，EAAT1基因敲除小鼠酒精摄入量减少，乙醇诱导的条件性位置偏爱减弱。然而，这些作者还指出，在野生型和敲除型小鼠之间，细胞外谷氨酸水平没有发现差异，这表明了克服EAAT1缺失的重要代偿机制(Karlsson等人2012年). 因此，未来需要进行更多的研究来阐明EAAT1在饮酒中的作用。

当前研究中测量的谷氨酸的来源未被检查。然而，以前的研究表明，在中边缘系统微透析取样的大量谷氨酸（20-30%）可能来自假定的神经元源(贝克等人2002,Ding等人2012). 乙醇诱导的细胞外谷氨酸浓度增加如何改变突触后谷氨酸信号也尚不清楚。电生理研究表明，TBOA增加谷氨酸水平可增强离子型谷氨酸受体介导的电流(Tzingounis&Wadiche 2007年). 这一间接证据表明，当前研究中细胞外谷氨酸浓度增加可能促进突触后神经元谷氨酸信号传递，导致谷氨酸神经传递增加，这可能有助于维持饮酒。

剥夺两周后，这两个区域的基础谷氨酸浓度和清除率恢复到控制水平，这一发现与Melendez等人（2005年）最近的神经影像学研究还表明，在停止酒精治疗数周后，人类酗酒者和酒精依赖大鼠的谷氨酸水平升高，恢复到控制水平(Hermann等人2012). 此外，与健康对照组相比，戒酒至少两周的年轻酗酒者的前扣带回和脑岛中的谷氨酸水平没有显著差异(Lee等人2007). 这些结果表明，长期饮用乙醇不会导致细胞外基础谷氨酸浓度持续增加。因此，酒精缺乏和随后的反复饮酒可能与中边缘细胞外谷氨酸水平升高无关。

有趣的是，在贫困之后，这两个地区的EAAT1水平仍然下降。这似乎与微透析的结果相反。这种不一致的原因尚不清楚。EAAT1（或其他转运体）的功能活性可能存在代偿性恢复，以应对较低的蛋白质水平。可能的机制包括EAAT1蛋白翻译后修饰的改变，如磷酸化等。另一种可能性是，酒精剥夺可能会增加其他谷氨酸转运体（如EAAT2或3）的活性。

升高的基础谷氨酸神经传递可能具有重要的功能意义。谷氨酸为中边缘多巴胺系统提供主要的兴奋性输入(Kalivas&Volkow 2005年)基础谷氨酸传递的增强可能有助于NAC多巴胺神经传递的增加，以及中边缘系统对乙醇的增强和刺激作用的致敏反应(Ding等人，2009年,卡帕索娃和苏姆林斯基2008,Rodd等人2005年,Thielen等人2004)导致酒精饮用逐步升级，最终导致酒精滥用和依赖。

长期以来，人们一直认为谷氨酸神经传递可以调节包括可卡因在内的其他滥用药物的影响(Gass&Olive 2008年,卡利瓦斯2009). 微透析研究表明，慢性可卡因自我给药可降低NAC细胞外基础谷氨酸水平(Miguens等人2008年,Suto等人2010). 此外，长期禁食可卡因后，谷氨酸水平持续下降，这可能是由于xCT功能下调所致(贝克等人2003,卡利瓦斯2009). 综上所述，这些研究结果表明，谷氨酸神经传递可能在不同滥用药物（如酒精和可卡因）的影响中起着不同的作用。

总之，目前的研究表明，P大鼠长期饮用乙醇会抑制谷氨酸清除并增加基础细胞外谷氨酸浓度在中边缘系统。这些变化可能部分由EAAT1蛋白表达减少介导。谷氨酸神经传递增强可能有助于维持饮酒。然而，由于剥夺后细胞外谷氨酸浓度恢复到控制水平，这个复发性饮酒的开始可能与中边缘系统谷氨酸神经递质的增加无关。

致谢

本研究部分由研究资助AA07611、AA12262和AA10721提供支持。我们感谢Amanda Moran、Sarah R.Hall和Erin Larrabe提供的技术帮助。本手稿的内容完全由作者负责，不一定代表NIAAA或NIH的官方观点。

脚注

作者贡献

WJM、ZMD、ZAR和DKL负责概念开发和研究设计。ZMD、EAE和JAB参与了实验和数据采集。ZMD、JAB和WJM进行了数据分析。ZMD、WJM和ZAR为手稿的撰写做出了贡献。

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