抑制肌成纤维细胞的机械敏感性信号改善实验性肺纤维化

法舒地尔通过下调BCL-2表达诱导肺肌成纤维细胞凋亡。

ROCK途径调节肌动蛋白动力学，这可能通过线粒体途径影响细胞凋亡敏感性(21). 细胞色素的释放c（c）线粒体是激活固有凋亡途径的关键步骤(31). 我们首先研究了法舒地尔是否诱导线粒体细胞色素的激活c（c）释放。法舒地尔治疗IPF（myo）成纤维细胞诱导细胞色素的时间依赖性释放c（c）来自线粒体（图​（图2A）。2A） ●●●●。细胞色素水平下降c（c）法舒地尔治疗后8～24h，观察线粒体内细胞分数；细胞色素水平c（c）在同一时间段内，细胞溶质分数增加。

在单独的窗口中打开

图2

Fasudil通过下调BCL-2促进肌成纤维细胞凋亡。

(A类)用25μM法舒地尔治疗IPF肺肌成纤维细胞24小时。在指定的时间点收集细胞裂解物。细胞色素释放c（c）通过细胞色素水平的变化评估线粒体的（Cyto-c）c（c）线粒体（Mito）和细胞质（Cyto）部分。VDAC和GAPDH分别用作线粒体和细胞质蛋白的负荷控制。(B类)用0–50μM法舒地尔处理IPF肺肌成纤维细胞24小时。的相对水平BCL2级,Bcl-xL公司、和Mlc-1型实时RT-PCR检测mRNA。18秒rRNA被用作内部参考对照。数据为3个单独实验的平均值±SD。(C类)用免疫印迹法测定BCL-2、BCL-xL和Mlc-1（治疗24小时后）的蛋白水平。GAPDH被用作负荷控制。(D类)用25μM法舒地尔或等量PBS处理IPF肺肌成纤维细胞24小时。免疫印迹分析测定caspase 9和caspase 3的裂解。GAPDH被用作负荷控制。用比色法测定半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶活性。数据为3个独立实验的平均值±标准差。(E类)通过免疫印迹分析测定IPF肌成纤维细胞和非IPF对照成纤维细胞BCL-2蛋白的组成性表达。GAPDH被用作负荷控制。使用ImageJ进行密度测定。BCL-2的相对密度归一化为GAPDH。数据为平均值±SD(n个=每组4人）*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01.

B细胞淋巴瘤2（BCL-2）是控制线粒体外膜通透性的BCL-2家族的原型成员，已知其抑制细胞色素的释放c（c）来自线粒体(32). 我们接下来试图确定法舒地尔是否调节肺肌成纤维细胞中BCL-2的表达。尽管法舒地尔在24小时后以剂量依赖性方式下调了IPF肺肌成纤维细胞BCL-2的mRNA和蛋白表达，但BCL-2家族另外2个成员BCL-xL和Mlc-1的mRNA及蛋白水平不受法舒地勒治疗的影响（图​（图2，2、B和C）。此外，法舒地尔诱导的BCL-2表达下调与caspase 9和caspase 3的激活有关，如前酶裂解和酶活性增加所证明的（图​（图2D）。2D） 。Fasudil没有激活caspase 8，这是死亡受体介导的外源性凋亡途径的下游效应器（补充图2）。总之，这些结果表明，法舒地尔介导了BCL-2表达的下调，并激活了固有的线粒体凋亡途径。

与法舒地尔对IPF肌成纤维细胞的促凋亡作用相反，该ROCK抑制剂不会使对照成纤维细胞对线粒体凋亡途径的激活敏感，因为法舒地l治疗不会诱导细胞色素c（c）释放、调节BCL-2蛋白表达或激活caspase 9/3（补充图3）。因此，法舒地尔通过下调BCL-2表达和激活固有线粒体凋亡途径选择性诱导肌成纤维细胞凋亡。为了确定在人IPF肌成纤维细胞中这种生存前BCL-2通路是否构成性上调，我们对非IPF对照成纤维细胞和IPF肌纤维细胞的细胞裂解物进行了免疫印迹分析，后者表达的BCL-2水平显著升高（图​（图22E） ●●●●。

Fasudil通过MKL1介导的内在机械转导的失活来下调BCL-2的表达。

MKL1是一种肌动蛋白动力学传感器和SRF辅激活子，在许多纤维化前基因的激活中起着关键作用(20,33–38). 当G-actin聚合成F-actin时，MKL1从G-actin释放并进入细胞核，在那里它与SRF结合并靶向启动子区的CArG共有序列以激活基因转录(38). 生物信息学搜索显示，在人类近端控制区有2个CArG盒、盒1（约-565至-558 bp）和盒2（约-1190至-1181 bp）BCL2级基因。确定fasudil-regulatedBCL2级MKL1介导了肺肌成纤维细胞中的基因表达，我们比较了IPF肺肌成细胞和对照肺成纤维细胞的MKL1-细胞质-核穿梭。MKL1亚细胞定位分析表明，与对照细胞相比，IPF肺肌成纤维细胞在核组分中表达更高水平的MKL2（图​（图3A）。三A） ●●●●。G-actin和F-actin含量分析表明，与对照肺成纤维细胞相比，肺肌成纤维细胞在总肌动蛋白池中含有更多的F-actin（图​（图3B）。三B） ●●●●。发现肺肌成纤维细胞和对照肺成纤维细胞中的总肌动蛋白水平相等（补充图4）。这些数据表明，F-actin聚合增加与IPF肺肌成纤维细胞中MKL1核信号的组成性激活有关。

在单独的窗口中打开

图3

Fasudil下调BCL-2表达是通过MKL1介导的内在机械传导失活实现的。

(A类)通过亚细胞分离和免疫印迹测定MKL1在IPF肺肌成纤维细胞和对照成纤维细胞中的亚细胞分布。层蛋白A/C和GAPDH分别用作核酸和细胞质蛋白的负载控制。(B类)通过免疫印迹和密度分析测定IPF肺成纤维细胞和对照成纤维细胞中的F-actin（F）和G-actin（G）含量。(C类和D类)IPF肌成纤维细胞和对照成纤维细胞用PBS或25μM法舒地尔处理24小时。(C类)MKL1亚细胞定位，如A类. (D类)F-actin和G-actin含量，按B类. (E类)MKL1-SRF复合物与BCL2级启动子通过定量ChIP进行定量。数据为3个单独实验的平均值±SD。(F类)WT和3突变人类BCL2级启动子：CArG box1（b1 mut）、CArG box 2（b2 mut）或box1和box2（b1&2 mut）。将启动子报告子转染到IPF肌成纤维细胞中，并用PBS或25μM法舒地尔处理24小时。通过荧光素酶分析测定启动子活性。数据为三个单独实验的平均值±SD，每个实验一式三份。EV，空矢量。(G公司)用PBS或25μM法舒地尔处理IPF肌成纤维细胞，加入或不加入200 nM茉莉糖苷（Jas）24小时。在法舒地尔治疗前，用组成活性MKL1（caMKL1）或空载体转染一组细胞。免疫印迹法检测BCL-2和GAPDH蛋白水平。(H（H）)IPF肌成纤维细胞在1μM latrunculin B（LatB）或1μM CCG-1423（CCG）存在或不存在下培养24小时。用dnMKL1表达质粒或空载体转染细胞亚群。免疫印迹法检测BCL-2和GAPDH蛋白水平*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01.

在IPF肺肌成纤维细胞中，法舒地尔治疗降低了核组分中MKL1的水平，同时增加了细胞质中MKL2的表达（图​（图3C），三C） ，这表明法舒地尔在“患病”细胞中“失活”组成型MKL1核信号传导。法舒地尔治疗后，在对照肺成纤维细胞中未观察到MKL1亚细胞定位的明显变化。尽管法舒地尔显著降低了肺肌成纤维细胞中的F-actin含量，但在正常肺成纤维细胞内，法舒地尔治疗后仅观察到F-actin的含量略有下降（图​（图3D）。三D） 。这些数据表明，法舒地尔抑制肺肌成纤维细胞中的F-actin聚合，并使MKL1信号激活失活。

进一步确定MKL1核信号的fasudil失活是否与观察到的BCL2级基因表达，我们进行了定量ChIP分析，以检查法舒地尔对MKL1-SRF复合物与BCL2级发起人。本构富集BCL2级SRF抗体中的启动子DNA——IPF肌成纤维细胞的免疫沉淀染色质被法舒地尔抑制（图​（图3三E） ●●●●。

接下来，我们确定法舒地尔是否诱导MKL1-SRF与BCL2级启动子抑制BCL2级启动子活性。1096 bp WT人类近端BCL2级启动子报告子和3个在特定MKL1-SRF-binding DNA序列（CArG box1、CArG box2或box1和box2两者）存在突变的突变启动子报告员被转染到肺肌成纤维细胞中（图​（图3F）。三F） ●●●●。转染WT的细胞内BCL2级启动子报告者，fasudil显著降低荧光素酶的表达（图​（图3F），三F） 这表明法舒地尔抑制BCL2级启动子活性。CArG box1的突变既没有降低组成型BCL2级启动子活性或消除法舒地尔对此活性的抑制（图​（图3F），三F） 这表明它不参与BCL-2调节。CArG box2突变以及box1和box2组合基线降低BCL2级肺肌成纤维细胞中的启动子活性（图​（图3F），三F） 这表明组成型启动子活性依赖于MKL1-SRF。总的来说，这些结果表明CArG盒2（约为-1190至-1181 bpBCL2级启动子）负责MKL1依赖的本构激活BCL2级肺肌成纤维细胞的基因表达。这些数据表明fasudil下调BCL2级通过抑制MKL1-SRF复合物与CArG盒2的结合实现基因表达。

F-肌动蛋白稳定剂茉莉酸激酶内酯处理MKL1的强迫核移位(38)或过表达组成活性（即核）MKL1(33)挽救法舒地尔下调肺肌成纤维细胞BCL-2表达（图​（图3G）。三G） ●●●●。相反，通过用latrunculin B破坏F-actin聚合抑制MKL1核信号(39)，阻止MKL1-SRF复合物绑定到BCL2级CCG-1423启动子(40)或显性负性MKL1（dnMKL2）过度表达(33)肺肌成纤维细胞中BCL-2表达下调（图​（图3H），三H） ，效果与法舒地尔治疗相当。综上所述，这些数据表明，法舒地尔下调肺肌成纤维细胞BCL-2表达至少部分是通过激活肌动蛋白细胞骨架依赖的MKL1核信号介导的。

法舒地尔预防肺成纤维细胞向肌成纤维细胞分化，以应对TGF-β1和基质硬度。

成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化以α-SMA表达和增强收缩活性为特征(4). 虽然成纤维细胞因子/生长因子已被公认为成纤维细胞向肌成纤维细胞分化的促进剂，但直到最近才认识到ECM的机械特性（即基质硬度）是肌成纤维组织分化的重要调节器(20,41). 因此，我们试图确定法舒地尔是否阻断肺成纤维细胞向肌成纤维细胞分化，以响应TGF-β1和基质硬度。TGF-β1和/或基质硬化在有或无法舒地尔的情况下诱导成纤维细胞向肌成纤维细胞分化。定量实时PCR和免疫印迹分析表明，TGF-β1和基质硬化单独或联合促进α-SMA的mRNA和蛋白表达显著增加，表明肌成纤维细胞分化，而法舒地尔在这些条件下消除了α-SMA蛋白和mRNA表达的诱导（图​（图4，4、A和B）。共聚焦免疫荧光显微镜显示TGF-β1和/或基质硬化促进α-SMA掺入应力纤维；用fasudil阻断α-SMA–正应力纤维形成共同处理，以响应TGF-β1和基体硬化（图​（图4C）。4C） ●●●●。这些数据表明，法舒地尔能够阻断来自调节肌成纤维细胞分化的生化（TGF-β1）和生物力学（基质硬度）线索的整合信号。

在单独的窗口中打开

图4

Fasudil抑制肺成纤维细胞向肌成纤维细胞分化，以应对TGF-β1和基质硬化。

(A类)将正常人肺成纤维细胞培养在软（0.5 kPa）和硬（20 kPa）PA凝胶上，加入PBS、25μM法舒地尔、4 ng/ml TGF-β1或法舒地尔加TGF-。α的相对水平-斯马实时RT-PCR检测mRNA。18秒rRNA被用作内部参考对照。条形图是3个单独实验的平均值±SD。(B类)免疫印迹法测定α-SMA和GAPDH蛋白水平。(C类)通过共焦免疫荧光双重染色法检测α-SMA（绿色）和F-actin（红色）在应激纤维中的掺入。细胞核用DAPI（蓝色）染色。比例尺：50μm。(D类)磷酸化（p-）和总MLC的表达₂₀免疫印迹法检测GAPDH。(E类)成纤维细胞的收缩性通过三维胶原凝胶法进行评估。柱状图是三个单独实验的平均值±SD，每个实验重复三次*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001.

（肌）成纤维细胞的收缩性与肌球蛋白轻链（MLC）的磷酸化有关₂₀) (4). 我们检测到最高水平的MLC₂₀生长在经TGF-β1处理的硬基质上的成纤维细胞磷酸化，然后是生长在未经处理的硬基体上的成细胞，最后是生长在经转化生长因子-β1处理过的软基质上的纤维细胞；法舒地尔治疗抑制了这些对可溶性和基质信号的反应（图​（图4D）。4D） 。在三维胶原凝胶系统中评估的收缩性功能测量结果表明，法舒地尔抑制了基线和TGF-β1诱导的收缩性（图​（图4E）。4E） ●●●●。总之，这些数据表明，法舒地尔抑制了可溶性（TGF-β1）和基质（硬度）信号诱导的肌成纤维细胞分化（通过生化、形态学和功能参数测量）。

Fasudil通过防止MKL1核转位来抑制肌成纤维细胞分化。

为了确定MKL1在fasudil-调节的肌成纤维细胞分化中对TGF-β1和/或基质硬化的反应中的作用，我们要么过度表达核MKL2，要么添加茉莉花碱内酯迫使MKL1进入细胞核(20). MKL1的强制核定位消除了fasudil对肺成纤维细胞中α-SMA表达的抑制，以应对TGF-β1和基质硬化（补充图5A）。此外，latrunculin B对肌动蛋白聚合的抑制或CCG-1423对MKL1-SRF相互作用的破坏阻断了TGF-β1和基质硬化诱导的肺成纤维细胞中α-SMA的表达（补充图5B），与fasudil的作用类似。总之，这些数据表明，法舒地尔通过阻断MKL1核转位抑制肺成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化。

RhoA/ROCK信号在人IPF和博莱霉素损伤诱导的小鼠肺纤维化中被激活。

MLC公司₂₀和肌球蛋白磷酸酶靶向亚单位1（MYPT-1）是ROCK特异性底物(42–44). 此前，我们报道了MLC的磷酸化₂₀人IPF成纤维细胞病灶中丝氨酸19残基增加(45). 这里，使用检测MLC的抗体₂₀只有当苏氨酸18和丝氨酸19双重磷酸化时，我们才证明MLC的双重磷酸化₂₀在人IPF的成纤维细胞病灶中（图​（图5A）。5A） ●●●●。此外，我们在博莱霉素诱导的肺损伤小鼠的活动性纤维化区域中证明了MYPT-1磷酸化增加（图​（图5A）。5A） ●●●●。法舒地尔（25 mg/kg/d腹腔注射）阻断了纤维化小鼠肺中MYPT-1的磷酸化（图​（图5A），5A） 验证法舒地尔对博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化中ROCK信号的抑制作用。从博来霉素损伤后的IPF肺和小鼠肺中分离的（Myo）成纤维细胞与各自的对照相比，表现出高的组成型ROCK活性，如基于ELISA的ROCK活性测定所示（图​（图5B）。5B） ●●●●。埃兹林磷酸化的免疫印迹分析^通过567/根素^通过564/莫西因^通过558（ERM），一组ROCK特异性底物，在质膜和肌动蛋白细胞骨架之间起连接作用(42,46)，表明小鼠和人类纤维化肺成纤维细胞中磷酸化ERM的基线水平较高（图​（图5C）。5C） ●●●●。基于GTP-结合（即活性）RhoA的亲和沉淀，使用谷胱甘肽S-转移酶-Rhotekin（GST-RBD）融合蛋白和免疫印迹分析进行的Rhotein下拉分析表明，从纤维化肺分离的（肌）成纤维细胞表达的活性RhoA水平高于从对照未受损肺分离的细胞（图​（图5D）。5D） 。这些数据表明，RhoA/ROCK信号在体内肺纤维化以及从纤维化肺分离的（肌）成纤维细胞中被激活。

在单独的窗口中打开

图5

RhoA/ROCK信号在人IPF和博莱霉素诱导的肺损伤小鼠的活动性纤维化区域以及从纤维化肺分离的（肌）成纤维细胞中增强。

(A类)非IPF对照受试者的石蜡包埋肺组织切片(n个=3）和IPF患者(n个=5）对磷酸化MLC进行免疫组织化学染色₂₀.生理盐水或博莱霉素处理小鼠的冷冻小鼠肺组织切片(n个=5个/组）对α-SMA（红色）和磷酸化MYPT-1（绿色）进行双重染色。细胞核用DAPI染色。重叠共聚焦显微镜图像以显示MYPT-1磷酸化与纤维化的相关性。箭头表示相对正常的肺部区域；箭头表示肺纤维化区域。比例尺：50μm；200μm（IPF面板中方框区域的高放大视图）。用免疫印迹法测定小鼠肺匀浆中磷酸化和总MYPT-1的水平。GAPDH用于装载控制。数据为平均值±标准差(n个=每组5人）。(B类)从IPF患者肺部分离的（Myo）成纤维细胞(n个=8），非IPF对照受试者(n个=6），博莱霉素治疗小鼠(n个=8）和盐处理小鼠(n个=8）使用比色法进行ROCK活性分析。数据为平均值±标准偏差(C类)通过密度分析测定分离（肌）成纤维细胞磷酸化与总ERM的相对蛋白水平。数据为平均值±SD(n个=6或8）。显示了具有代表性的免疫印迹。(D类)密度分析法测定分离（肌）成纤维细胞中活性RhoA水平（用GAPDH标准化）。数据为平均值±SD(n个=每组8个）。显示了具有代表性的免疫印迹*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001.

TUNEL和免疫荧光双标记分析。

为了将TUNEL染色与特异性抗原的免疫荧光染色相结合，首先使用TdT-fluor原位凋亡检测试剂盒（Trevigen）进行TUNEL着色，然后用一种主要抗体暴露24小时。根据制造商的建议使用氟铬结合二级抗体。细胞核用DAPI染色。

共焦激光扫描显微镜。

荧光信号使用配备数字彩色相机（AxioCam）的蔡司LSM510共焦激光扫描显微镜进行检测。所有荧光图像都是使用顺序激光扫描生成的，仅使用相应的单波长激光线，使用声光可调谐滤波器激活，以避免交叉检测任何一个荧光通道。

定量ChIP分析。

成纤维细胞（1×10⁶细胞）在37°C下用1%甲醛处理10分钟，以将组蛋白交联到DNA。对交联的染色质进行超声处理，剪切200-1000 bp的染色质片段。部分剪切的染色质在65°C下翻转4小时，交联DNA通过苯酚/氯仿萃取纯化。保存DNA并在随后的实时PCR反应中用作内部参考对照。其余的超声染色质用制造商推荐的浓度的抗SRF抗体进行免疫沉淀，而阴性对照则不使用抗体进行免疫沉淀。用蛋白A琼脂糖珠回收免疫复合物。反向交联并用蛋白酶K处理，以从DNA中去除蛋白质。通过苯酚/氯仿萃取纯化DNA。实时PCR用于量化SRF结合BCL2级启动子片段使用以下引物：正向，5′-CGCGCAGGACCAGGAGGAGAGAA-3′；背面为5′-CGGCGAGGGGGTGGGAGAGAGAGGGT-3′。

动物和实验方案。

伯明翰阿拉巴马大学动物护理和使用委员会批准了动物使用和博莱霉素方案。本研究选用6-8周龄无致病性雌性小鼠。将硫酸博来霉素（Almirall）溶解在无菌盐水溶液中，并使用步进式重复吸管（Tridak）将其气管内滴入小鼠，每只动物在50μl盐水溶液中单次剂量为0.08 mg（5 U/kg BW）。对照小鼠接受50μl生理盐水。对于法舒地尔治疗，在给予博莱霉素后14天开始，向小鼠腹腔注射25 mg/kg BW/d的剂量，持续14天或等量的PBS。第28天处死小鼠。切除肺组织，用OCT或PBS中4%（m/v）多聚甲醛充气，进行免疫荧光或免疫组织化学分析。

为了制备肺匀浆，将新鲜肺组织转移到含有T-PER（Thermo Scientific）和完整微型蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche）的预冷试管中，比例为1片/10 ml T-PER，并在4°C下进行匀浆。匀浆在9000℃下离心克在4°C下保持10分钟。上清液被转移到清洁的微型离心管中。使用BCA蛋白质测定试剂盒（Thermo Scientific）测定肺组织匀浆中的总蛋白质浓度。

统计。

使用单因素方差分析和纽曼-凯尔斯方法确定治疗条件之间的统计差异，以进行多重比较。A类P（P）值小于0.05被认为是显著的。

这项工作得到了NIH拨款HL097215、美国心脏协会科学家发展拨款0835432N、伯明翰阿拉巴马大学医学系向Y.Zhou提供的启动资金以及NIH向V.J.Thannickal提供的HL067967和HL107181的部分支持。