线粒体复合物I活性和NAD⁺/NADH平衡调节乳腺癌进展

通过增强复合物I功能抑制转移活性依赖于自噬。

为了研究复杂I活性如何影响肿瘤生长和转移，我们首先分析了Ndi1表达对肿瘤细胞生存和生长的影响。虽然Ndi1不影响体外增殖（补充图4，A和B），但Ndi1增加了MDA-MB-231细胞对葡萄糖剥夺的抵抗力（图​（图3A）三A） 并抑制两种细胞系的致瘤性（图​（图2A）。2A） ●●●●。此前曾描述过一种类似的悖论现象，并将其与肿瘤细胞进行自噬的能力联系起来(27——29)当时没有迹象表明线粒体复合体I可能参与。根据乳腺癌细胞复合体I活性可以影响自噬的假设，我们分析了Ndi1表达对p62的影响，p62是一种在自噬过程中被消除的泛素结合支架蛋白(27，30). Ndi1表达增加了p62降解（图​（图3B），三B） 这表明线粒体复合物I活性的增强导致了自噬。根据调节自噬的信号通路，我们分析了Ndi1对mTORC1活性和mTOR主要调节因子之一AKT的影响。通过mTORC1相关底物S6和4EBP1的磷酸化测定mTORC2活性；AKT活性基于磷酸-AKT底物的水平。Ndi1明显降低MDA-MB-231细胞中的AKT活性，并抑制两种细胞系中的mTORC1（图​（图3B），三B） 这表明复合物I活性可以通过调节mTORC1信号传导诱导自噬。这一过程可能涉及MDA-MB-231细胞中的AKT和MDA-MB-435细胞中的替代机制。

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图3

线粒体复合物I活性调节mTORC1和自噬。

(A类)在含有5 mM与1 mM葡萄糖的培养基中培养72小时后，Ndi1表达增强了MDA-MB-231细胞对葡萄糖剥夺的抵抗力。通过流式细胞术测定存活率（非G0/G1亚群）。n个=3个独立分析*P（P）<0.05，未配对双尾学生t吨测试。(B类)Ndi1表达影响mTORC1活性和自噬。p62、磷酸化AKT底物和mTORC1激酶相关底物磷酸化-S6的蛋白质印迹分析^{序列240/244}和磷酸化-4EBP^通过37/46在MDA-MB-435或MDA-MB-231对照细胞和Ndi1-表达细胞中。以β-管蛋白为蛋白质负荷对照。通过红外成像测量的信号量化（可检测波段的总数），并相对于对照表达，如下所示。结果代表了5个独立实验。Lanes在同一凝胶上运行，但不连续（白线）。(C类)乳腺脂肪垫肿瘤植入2.5×10后5周H&E染色及p62、Ki67或Ndi1表达⁵MDA-MB-435对照SCID小鼠Ndi1表达细胞。每组显示6个代表性肿瘤中的2个。原始放大倍数，×10。(天)通过NDUFV1敲除抑制复合物I活性会影响mTORC1活性和p62消除。p62、磷酸-AKT底物、磷酸-S6的蛋白质印迹分析^{序列240/244}，和磷酸-4EBP^通过37/46，比较NDUFV1敲除与对照MDA-MB-435细胞。信号量化由红外成像（可检测波段总数）测量，并相对于对照表示，如下所示。结果代表了3个独立实验。Lanes在同一凝胶上运行，但不连续（白线）。

重要的是，表达Ndi1的原发性肿瘤中p62和Ki67的水平显著降低（图​（图3C），三C） 这表明复合物I的增强增加了肿瘤细胞自噬并抑制体内增殖。这一结论得到了AKT和mTORC1活性增强以及NDUFV1敲除对p62清除的明显抑制的有力支持，NDUFV2敲除降低了肿瘤细胞中的复合物I功能（图​（图3D）三D） 不影响其扩散（补充图4C）。这些结果表明，肿瘤细胞复合物I的活性可以调节体内外肿瘤细胞mTORC1信号转导和自噬。

为了直接分析复杂I介导的乳腺癌转移调控是否涉及肿瘤细胞自噬的控制，我们敲除了ATG5，一种诱导自噬所需的蛋白(31). 用shRNA稳定转导靶向对照和表达Ndi1的MDA-MB-435和MDA-MB-231细胞中的ATG5（图​（图4A4A和补充图5A）抑制自噬，如p62和LC3BI积累所示（图​（图4A），4A） ，不影响体外增殖（补充图5B）。重要的是，尽管基本水平的自噬促进了MDA-MB-231细胞的转移，但ATG5敲除消除了Ndi1介导的复合物I增强对转移器官定植的抑制作用（图​（图4，4、B和C）。MDA-MB-231主要见于肺部，MDA-MB-435主要见于多个器官，包括肺、肝、骨、脑和肾上腺。这些发现证实了以下结论：在2种侵袭性肿瘤细胞模型中，通过增强线粒体复合物I活性抑制转移依赖于自噬诱导。

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图4

复合物I活性增强对转移的抑制依赖于自噬。

(A类)ATG5敲除（shATG5）抑制MDA-MB-435和MDA-MB-231对照细胞和Ndi1表达细胞的自噬，如p62和LC3BI积累所示。ATG5、p62信号和LC3BI/II比率的信号量化，通过红外成像（可检测频带总数）测量并相对于对照表示，如下所示。β-管蛋白作为蛋白质负荷控制。Lanes在同一凝胶上运行，但不连续（白线）。(B类)ATG5敲低阻断了Ndi1在MDA-MB-435和MDA-MB-231细胞中的抗转移作用。静脉注射2.5×10后7周，通过体外肺成像测量肺定植⁵肿瘤细胞(n个=每组8个）。方框表示四分位范围；方框内的线表示中值；胡须表示最小值和最大值*P（P）<0.05，非参数Mann-Whitney检验。(C类)ATG5敲除增强了MDA-MB-435细胞的多器官转移，并通过Ndi1逆转了转移抑制。显示的是尾静脉注射2.5×10后7周每组5只代表性小鼠的无创生物发光成像⁵MDA-MB-435对照或Ndi1-表达细胞，有或没有ATG5敲除。

北美⁺复数I的电平调制和NAD的改变⁺合成和再循环途径调节AKT/mTORC1活性、自噬和转移活性。

为了进一步研究复合物I活性增强抑制肿瘤进展的机制，我们接下来排除了ROS或NADPH生成的改变是主要潜在原因。MDA-MB-435和MDA-MB-231细胞中Ndi1的表达没有显著改变ROS水平或NADPH减少当量（补充图6、A和B）。同样，NDUFV1敲除对ROS没有显著影响（补充图6C），这表明Ndi1对复合物I活性的增强以ROS依赖的方式抑制肿瘤的致瘤性和转移。

哺乳动物复合体I和Ndi1的主要功能是NADH脱氢酶活性。MDA-MB-435和MDA-MB-231细胞中Ndi1的表达增加了NAD⁺/全细胞提取物和纯化线粒体中的NADH比率，特别是在葡萄糖或缺氧诱导的代谢应激下（图​（图5A）。5A） ●●●●。在培养中，Ndi1介导的NAD增加⁺/NADH比率在指数细胞生长期间可以测量（补充图7，A和B）。相反，通过NDUFV1敲除干扰内源性复合物I活性可降低NAD⁺/NADH比率（补充图8）。我们推断细胞氧化还原电位（NAD）的调节⁺/NADH比值）通过线粒体复合物I活性可以调节肿瘤细胞的转移活性。为了用独立的方法检验这个假设，我们实验性地降低了NAD⁺/MDA-MB-435和MDA-MB-231细胞中的NADH比率，并分析其对体内转移的影响。

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图5

北美⁺复数I和NAD的电平调制⁺合成和再循环途径调节AKT/mTORC1活性、自噬和转移。

(A类)Ndi1表达增强NAD⁺/NADH平衡。北美⁺/MDA-MB-435或MDA-MB-231对照组的全细胞或线粒体提取物与Ndi1表达细胞的NADH比率。Ndi1稳定NAD⁺/NADH比值，尤其是在葡萄糖缺乏和缺氧引起的代谢应激下。北美⁺/在培养48小时后，在全细胞提取物中测量应激下的NADH比率。(B类)对NAD的干扰⁺合成和循环途径减少NAD⁺/NADH比率。敲除MDA-MB-435和MDA-MB-231细胞中的NAMPT（shNAMPT）可降低NAD⁺/NADH比率（在5 mM葡萄糖和常氧条件下生长48小时后的全细胞提取物）。(C类)NAMPT敲除增加MDA-MB-435和MDA-MB-231细胞的肺定植活性(n个=每组6人）。(天)NAMPT敲除影响mTORC1活性和p62消除。p62、磷酸-AKT底物、磷酸-S6的蛋白质印迹分析^{序列240/244}，和磷酸-4EBP^通过37/46与对照细胞相比，MDA-MB-435和MDA-MB-231 NAMPT敲除。β-管蛋白作为蛋白质负荷控制。信号量化由红外成像（可检测波段总数）测量，并相对于对照表示，如下所示。Lanes在同一凝胶上运行，但不连续（白线）。结果代表了3个独立实验。(A类——C类)数据为平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，未配对双尾学生t吨测试(A类和B类)或非参数Mann-Whitney检验(C类).

降低NAD⁺/肿瘤细胞中的NADH比率，我们干扰了NAD⁺靶向烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）的合成和再循环途径。NAMPT对烟酰胺（NAM）的利用和再循环以及NAD的生物合成至关重要⁺(32). 通过shRNA稳定转导对NAMPT表达的干扰（补充图9A）降低了细胞NAD⁺/NADH比率（图​（图5B），5B） ，与肿瘤细胞的生长状态无关（补充图10、A和B），且不影响体外细胞增殖（补充图9B）。然而，在体内，NAMPT敲除显著增强了MDA-MB-435和MDA-MB-231细胞的转移（图​（图5C），5C） ，表明NAD降低之间存在因果关系⁺/NADH比率和转移活性。细胞NAD干扰导致转移活性增加⁺/NADH比率涉及mTORC1活性和自噬的改变。在正常条件和葡萄糖剥夺条件下分析NAMPT敲除细胞。在因葡萄糖缺乏（1 mM葡萄糖）导致的代谢应激下，NAMPT敲除诱导p62积累并增强AKT和mTORC1活性（图​（图5D），5D） ，这表明NAD⁺这些水平可以调节MDA-MB-435和MDA-MB-231细胞中AKT/mTORC1信号和自噬途径。

尽管我们的研究结果表明，NAMPT表达的下调增强了转移活性，但化学NAMPT抑制剂此前已被建议用于抗癌治疗(33). 为了研究这种潜在的差异，我们分析了非竞争性NAMPT抑制剂FK866的作用(34)在体外和体内。在体外，FK866降低细胞NAD⁺/MDA-MB-435和MDA-MB-231细胞中的NADH比率与NAMPT敲除后的水平相似（补充图11A），表明该药物对NAD代谢的影响。FK866降低NAD治疗NAMPT敲除细胞⁺/NADH水平进一步升高，可能是由于NAMPT抑制的剂量效应（补充图11A）。在体内，FK866在42天的观察期内确实降低了转移活性（补充图11B）。这种体内效应可能与药物的细胞毒性有关。虽然对肿瘤细胞NAMPT表达的遗传干扰在体外不会影响细胞生长或导致细胞死亡（补充图9B），但FK866治疗诱导了S-G2/M细胞周期停滞和坏死（补充图11，C和D）。FK866在NAMPT敲除细胞中的细胞毒作用增强。这些结果表明，该药物最初在高通量筛选中被确定为细胞增殖抑制剂，对细胞活性有影响。降低NAD的FK866浓度⁺/肿瘤细胞中NADH的比率与NAMPT的敲除一样，在体外确实导致了显著的细胞死亡，而基因NAMPT干扰则没有。因此，该药物的细胞毒性作用可能与NAMPT抑制无关。

Ndi1表达。

用Ndi1基因稳定地转导肿瘤细胞酿酒酵母(19)亚克隆到慢病毒表达载体cFUW中。在所有实验中，转导的细胞被用作池。如前所述，Ndi1表达通过Western分析分析，亚细胞定位通过免疫荧光分析(18).

NDUFV1、NAMPT和ATG5敲除。

含有抗NDUFV1 shRNA的慢病毒载体（克隆TRCN0000025872）、ATG5（克隆TRCN0000151963）、NAMPT（克隆TRCH0000116180）或非靶向对照shRNA（SHC0002）来自Sigma-Aldrich。使用FastStart Universal SYBR Green Master（Rox）（Roche）和以下引物通过实时PCR定量敲除效率：ATG5 forward，TGGGATTGCAAAATGACAGA；ATG5反面，TTCCCCATCTCAGGATCAA；NAMPT转发，GCCAGCAGGAATTTGTTA；NAMPT背面，TGATGTGCTGCTTCAGTTC；NDUFV1正向，AAGGTTCCCTGAGTCGAGGT；NDUFV1反面，TTGTGAGGATCATGGCGTAA；GAPDH转发，GGGAAGGTGAAGGTCGGAGT；GAPDH反向，TCCACTTACCAGAGTTAAAAGCAG。使用ABI-PRISM 7700序列检测系统（Applied Biosystems）和序列检测软件（2.0版；SDS）记录和分析数据。

动物实验。

对于实验性转移，将6-8周龄雌性C.B-17/SCID小鼠注射氟-氯–标记的癌细胞：2.5×10⁵静脉注射MDA-MB-231或MDA-MB-435细胞，或5×10⁵立体定向引导MDA-MB-453细胞进入左心室。对于原发性肿瘤生长，1×10⁶MDA-MB-231电池或2.5×10⁵将MDA-MB-435细胞注入腋窝乳腺脂肪垫。对于自发转移，8周龄雌性BALB/c小鼠注射1×10⁵ 氟-氯–将4T1细胞标记到第四个乳腺脂肪垫中。当肿瘤达到300毫米时，手术切除肿瘤^三在大小和动物濒死时进行安乐死，以确定存活率。每周（IVIS 200；Xenogen）在腹腔注射d日-荧光素（100 mg/kg）。为了评估MDA-MB-453细胞的脑转移，在心脏注射后直接对小鼠进行成像，通过验证大脑区域的肿瘤细胞信号和肺部的信号缺失来验证正确的路径。对于实验和自发转移研究结束时的体外器官成像，在尸检前5分钟向小鼠注射荧光素。对于生存分析，影像学也证实转移是死亡的原因。生物发光被量化为光子/s/cm²使用Living Image软件在指定的感兴趣区域中。MMTV-PyMT小鼠（株MT634；W.J.Muller的礼物，加拿大魁北克省蒙特利尔市麦吉尔大学；参考。38)PyMT转基因为杂合子，用正向引物5′-CGGCGGAGCGGAGGAGACTGAGGAG-3′和反向引物5’-TCAGAGACTCGGCAGTCTAGGCG-3′进行PCR分型。对于NAD⁺前体处理，小鼠在饮用水中接受1%NIC或NAM，每周改变一次。组织学方面，乳腺脂肪垫和肺部采用锌固定，连续切片（5μm），H&E染色。在PyMT模型中，对4个形态学阶段（增生、腺瘤、早期癌和晚期癌）进行评分；参考文献。39)通过图像分析和形态测量（Metamorph成像软件；7.6版）对全玻片扫描（Leica SCN400数字玻片扫描仪）进行。使用蔡司Axio Imager M1m显微镜和AxioVision软件对选定区域进行成像。MMTV-PyMT小鼠的肺转移在每个肺10个H&E染色步骤切片上进行定量（5μm厚，相隔80μm）。

Ndi1融入细胞呼吸。

2 × 10⁶将细胞收集到完整的培养基中，并使用Oroboros血氧饱和度仪系列D和DatLab软件（Oroboros-Instruments）在37°C的2 ml室中通过高分辨率呼吸测量法测量呼吸。在完整培养基中的完整细胞中测量常规线粒体呼吸，校正因氧化副反应引起的残余氧消耗。通过添加鱼藤酮（2.5μM）抑制内源性复合物I和最终添加复合物III抑制剂抗霉素A（2.5μM）终止线粒体呼吸后的耗氧量来确定Ndi1与肿瘤细胞线粒体呼吸的功能整合。

线粒体复合物I活性的酶分析。

NADH氧化为NAD⁺通过免疫捕获复合物I酶活性测定（MS-141；MitoSciences）分析复合物I。

北美⁺/全细胞和线粒体提取物中的NADH分析。

北美⁺在全细胞提取物（1×10）中独立分析NADH⁶)或分离的线粒体（从1×10⁷电池）按上述方法制备(18，63). 使用NAD/NADH荧光检测试剂盒（Cell Technology Inc.）测定浓度。

mtDNA。用实时定量PCR法对2×10提取的总DNA进行mtDNA含量测定⁶细胞。

使用MT-RNR1（线粒体S12 RNA）特异性TaqMan探针（Hs02596859_g1，FAM标记），参照核基因RPPH1（RNase P，VIC标记），进行四重PCR反应。使用ABI-PRISM 7700序列检测系统（Applied Biosystems）和序列检测软件（2.0版；SDS）记录并分析PCR数据。

ATP测量。

从细胞颗粒（2×10）中提取ATP⁶细胞）与100μl冰镇2M高氯酸共三份。将提取物放在冰上15分钟，混合，然后在12000℃下离心克在4°C下保持5分钟。用35μl 1M Bicine和4M碳酸钾将上清液中和至pH 7.5，并在冰上保存15分钟。离心后，使用ATP测定试剂盒（Invitrogen）根据ATP依赖的荧光素酶活性测量上清液中的ATP浓度。

乳酸生产。

培养10天后，在条件培养基中测量三倍的乳酸浓度⁵细胞置于6孔板（1.5 ml培养基/孔）中48小时。用166μl冰镇2M高氯酸将500μl培养基脱蛋白，置于冰上15分钟，混合，并在12000℃下离心克在4°C下保持10分钟。上清液用58μl 1M Bicine和4M碳酸钾中和至pH 7，并在冰上保存20分钟。离心后，如前所述，在添加乳酸脱氢酶之前和60分钟后，在340 nm激发和466 nm发射（460 nm）下用荧光法测定上清液中的乳酸浓度(5).

线粒体膜电位和细胞活力分析。

采用膜电位敏感型荧光铬四甲基罗丹明甲酯（TMRM；Invitrogen）测量线粒体膜电位。细胞在37°C的黑暗中与150 nM TMRM孵育30分钟，然后通过流式细胞仪（FACSCalibur）进行分析。通过使用CellQuest软件测量FL-2荧光，收集每个样本10000个事件的数据并进行分析。通过流式细胞术测量非亚二倍体人群（非亚G0/G1）的百分比来分析细胞活力。将细胞固定在冰冷的70%乙醇中，用PBS洗涤，并与50μg/ml碘化丙啶和100μg/ml RNAse A在37°C下孵育30分钟。通过测量FL-2荧光收集每个样本20000个事件的数据。

免疫组织化学。

肿瘤组织用多聚甲醛或锌固定，石蜡包埋，切片（5μm），转移到玻片上，在安全透明II中脱蜡，并在一系列乙醇溶液中再水化。分别用1 mM EDTA（pH 8）、10 mM柠檬酸盐缓冲液或1 mM乙二胺四乙酸加10 mM三氯化碳（pH8）进行抗原回收后，进行p62、Ki67或Ndi1染色。切片在PBS中清洗3次，用3%的H处理₂哦₂在PBS（或甲醇中用于Ndi1）中培养15分钟，在10%的山羊血清和0.3%的Triton X-100中培养1小时，用抗p62（Santa Cruz Biotechnology Inc.）、Ki67（BD Biosciences-Pharmingen）或Ndi1的一级抗体培养(18)过夜（或p62为1小时），然后用二级辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素缀合的Abs（Jackson ImmunoResearch Laboratories和Vector Laboratories）孵育2小时。使用亲和素-生物素复合物试剂盒（Vector Laboratories）扩增生物素化抗体的信号。用DAB底物开发辣根过氧化物酶（BD Biosciences-Pharmingen），细胞核用对比绿染色（Kirkegaard&Perry Laboratories）。载玻片用异丙醇清洗，并在安装在Permount（Fisher Scientific）之前在SafeClear II（Fisher-Scientistic）中短暂培养。图像由配备数字相机的蔡司Axio成像仪M1m显微镜采集，使用×20空气物镜。使用AxioVision 4.6软件（蔡司）分析数字图像。

蛋白质印迹分析。

用Laemmli或RIPA提取缓冲液溶解细胞。用Ndi1抗体孵育蛋白质印迹(20)，p62（Santa Cruz Biotechnology），磷酸化AKT底物（Ser/Thr），phopho-S6^{序列240/244}，磷酸-4E-BP1^通过37/46、LC3B（细胞信号传递技术）、ATG5（细胞信号传导技术）、β-微管蛋白（Sigma-Aldrich）、NDUFA9（复合物I）、SDHA（复合物II）、UQCR2（复合物III）、COXI（复合物IV）、ATP5A1（复合物V）或线粒体孔蛋白（VDAC1）（线粒体）。使用奥德赛红外成像系统（LI-COR Biosciences）与与IRDye 800结合的二级抗体孵育后检测抗体结合。使用奥德赛红外成像系统应用软件（3.0版）对数据进行分析和量化。

统计。

使用未配对双尾Student’st吨体外结果方差不等的试验；体内结果的非参数Mann-Whitney检验，因为无法假设正态分布；动物生存的卡普兰-迈尔曲线和对数库检验。使用GraphPad Prism软件进行统计计算。A类P（P）值小于0.05被认为是显著的。结果显示为独立实验中获得的值的平均值±SEM。

本研究得到了NIH拨款R01CA11287、R01CA170737和R01CA140140（给B.Felding-Habermann）、UL1RR025774（给Eric J.Topol，给B.Feldeng-Haberman颁发飞行员奖）和R01DK053244（给T.Yagi）的支持；CDMRP国防部拨款W81XWH-08-0468（给B.Felding-Habermann）；加利福尼亚州乳腺癌研究项目（向B.Felding-Habermann）授予17NB-0058、16IB-0052、12NB-0176和13NB-0180。A.F.Santidrian获得了Susan G.Komen基金会的博士后奖学金。S.E.LeBoeuf和L.J.Gay获得了美国国立卫生研究院5TL1RR02572-03助学金的实习生奖学金。我们感谢Bruce E.Torbet的cFUW慢病毒构建；William J.Muller，用于MMTV-PyMT小鼠；罗尔夫·哈伯曼（Rolf Habermann），用于形态计量分析；以及米哈拉·洛格、迪尔德丽·奥沙利文、卡琳·斯塔夫林和简·福赛斯，进行了有益的讨论。我们感谢美国加利福尼亚州拉霍拉市拉斯帕特罗纳斯的捐赠。这是斯克里普斯研究所的21583份手稿。