体感皮层突触的体内定量蛋白质组学显示哪些蛋白质水平受感觉剥夺的调节

重要性

摘要

感官信息通过化学突触激活特定的神经元回路而在大脑中编码。重要的感官体验是通过加强回路中激活的突触来储存的，这一过程被称为“经验依赖性可塑性”(1). 当动物在发育过程中被剥夺了感官体验时，例如，通过从出生到出生后30天修剪啮齿类动物的胡须，突触强度和成熟的突触形态会减弱，这表明被剥夺的回路中的低活性会干扰正常发育(2——7). 然而，根据经验改变这些突触特性的分子变化尚不清楚。突触激活已被证明可以促进对突触蛋白的调节性和高度局部化作用，如局部翻译、招募和靶向降解(8——11)而这种对蛋白质可用性的时空控制是长期可塑性和突触成熟所必需的，而突触成熟是记忆形成和储存的基础，最终也是生物体生存的基础(12——14). 神经疾病的研究强调需要高度控制蛋白质的可用性，这通常是由于突触处蛋白质可用性的中断造成的(15——17). 因此，很明显，局部突触蛋白动力学对于促进突触形态和强度的变化以稳定适合激活水平的结构至关重要；然而，目前尚不清楚哪些突触蛋白对赋予这些突触特性至关重要。

本研究使用基于MS的定量蛋白质组学来寻找突触蛋白，其水平在发育过程中受到感觉剥夺的影响。为了在不同突触输入水平的条件下产生突触体样本，我们从出生后第4天（P）P30开始每天进行双侧胡须修剪（感觉剥夺小鼠）或刷胡须（感觉正常小鼠）的小鼠的桶状皮层中分离出突触体。小鼠触须三叉神经系统为研究由增强或抑制感觉体验引起的突触特性变化提供了一些优势。首先，感官体验可以在不损伤外周感觉轴突的情况下进行操作，因此任何影响都可以归因于神经元激活的变化。第二，初级体感（S1）皮层可以根据表面血管系统进行解剖定位，并且在皮层组织样本中可以很容易区分其独特的桶形细胞结构(4,18). 第三，触须功能对啮齿类动物在环境中的导航至关重要，有大量文献记录了不同感觉体验对皮层发育的结构和功能影响(1,三,5,6). 尽管由于桶状皮层组织和突触结构的异质性，对粗突触体进行蛋白质组学研究可能是雄心勃勃的，但我们预测，我们的方法可以信心十足地揭示受调控的蛋白质。

在这项研究中，来自¹⁵富氮小鼠作为实验组直接比较的内部标准。¹⁵啮齿类动物的N标记有助于对长寿蛋白质和发育过程中突触范围的变化进行准确的蛋白质全定量分析(19——21). 在7000多个定量蛋白质中，我们在失去感觉的突触中确定了89个显著减少的蛋白质和161个显著升高的蛋白质，并且我们通过免疫印迹和免疫组织化学验证了其中22个蛋白质。在缺乏感觉的动物中显著下调的蛋白质可能是降低突触特性的最有吸引力的候选蛋白，例如突触强度和接受输入活动减少的突触中的脊椎成熟度。促进脊柱增大和突触强度的突触后蛋白，这两个促进突触成熟和稳定的特征，也引起了人们的极大兴趣。重要的是，我们发现了许多被感官经验改变的特征不明显的突触蛋白，该数据集将为理解哺乳动物经验依赖性可塑性的分子基础提供有趣的未来目标。

结果

我们开始使用定量2D液相色谱法和串联质谱法（LCLC-MS/MS）鉴定小鼠大脑皮层发育感觉经验调节的突触蛋白。受感觉剥夺影响的突触被认为是新形成的突触，无法变得强大和稳定。在突触可塑性的关键窗口之后，我们每天将所有胡须从接近突触发生初期的P4修剪到P30，从而降低了大脑皮层的活动(4,22)产生在低活动（感觉缺失）条件下发育的桶状皮层突触(图1A类). 在第二组感觉正常的动物中，每天刷洗所有的胡须，以控制在胡须操作期间对动物的操作(图1A类). 为了确保广泛的突触蛋白质组覆盖，我们准备了桶状皮层突触组部分进行分析。突触体复杂性的降低使得LCLC-MS/MS方法能够分析样本中几乎所有的蛋白质(23). 我们使用了第三组动物，即标记为¹⁵N个(图1A类)，作为内部标准，并使用比率方法对每个MS运行进行相对蛋白质定量(24).

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图1。

在出生后发育期间，在桶状皮层正常和减少输入活动后，用于分离突触的方法。(A类)LCLC-MS/MS用于通过使用¹⁵N只小鼠（红色）作为内部标准。(B类)穿孔皮层的100μm厚切向截面的图像显示了桶形穿孔的位置，导致周围皮层中没有大的桶形结构，这将确定相应的穿孔可以纳入实验。(插入)相应筒冲头的100μm厚截面，包含许多大型筒结构。(C类)用甲酚紫对可接受的穿孔桶状皮层样品进行冠状切片成像，以验证完整的柱状皮层细胞构筑(左侧)通过谷氨酸转运体（VGlu2）的免疫反应勾勒出桶结构(赖特). (天)突触体制剂的电子显微照片，显示突触前（红色星号表示突触小泡簇）和突触后结构的存在。

使用组织穿孔机从整个皮层中分离出桶状皮层组织。如果剩下的甲酚染色的皮层在穿孔周围没有几个大的感觉桶，并且大多数是小的桶，这些桶接收从鼻尖到穿孔的小鼻须的输入，那么穿孔组织被认为可以用于研究(图1B类). 通过一个可接受的穿孔筒状皮层样品进行的冠状切片表明，甲酚紫成像的皮层结构(图1C类,左侧)通过谷氨酸转运体（VGlu2；图1C类,赖特)在穿孔组织中保持完整。将可接受的穿孔桶状皮层样品的匀浆以1:1混合(¹⁴N个/¹⁵N） 在工作流程的早期，以最大限度地减少突触小体制备、样品处理或MS分析过程中引入的任何潜在偏差。从三只不同的小鼠中为修剪和刷毛实验组生成三个生物复制品。从桶状皮层制备的突触小体通过免疫印迹显示突触蛋白富集，通过电子显微镜显示突触前和突触后结构的保存(图1天).

在每个突触体样本中，我们从约35000个肽中鉴定了约3500个蛋白质，蛋白质假发现率（FDR）<1%。所有样品中鉴定出的蛋白质总数为60962个总肽中的7134个蛋白质。然后，我们根据置信度测量量化了约75%的已识别肽（参见串联质谱分析中的节材料和方法详细信息）。通过首先生成一个¹⁴N修剪/¹⁵N刷（修剪）或¹⁴N型电刷/¹⁵N刷（刷）比率生成最终¹⁴N修剪/¹⁴N刷“比率”(图2A类). 我们比较了三个“修剪”数据集和三个“刷”数据集，通过方差分析计算褶皱变化和显著性，并将这些结果绘制成火山图(图2B类). 89种蛋白质显著减少(表S1)，161个蛋白质显著升高(表S2)相对于刷过的样品，修剪至少1.2倍。其中，只有少数被修改了1.5倍以上（非粗体文本图2B类 插入和浅灰色填充表1)或2.0倍（粗体文本图2B类 插入和深灰色填充表1). 在这里，我们重点分析了在失去感觉的动物中显著下调的突触蛋白，这表明它们通过稳定突触的正常活动而富集（绿色点位于图2B类 插入,表1和中的粗体文本表S1,左侧列).表1列出了剥夺性突触中显著减少的突触蛋白，按突触下的位置进行分组，并报告了相应的国际蛋白质指数（IPI）数量、平均修剪：刷毛蛋白水平（T/B）的比率、定量肽的数量(¹⁴N个/¹⁵N对），从中计算平均值，方差分析P（P）以及之前的研究，这些研究已经证明了蛋白下调或上调对脊椎形态、轴突形态、突触传递和/或行为的影响。

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图2。

感觉缺失和感觉正常突触中突触蛋白的定量方法。(A类)以GluA1为例，通过LCLC-MS/MS量化蛋白质水平的示意图。含有这两种成分的重组肽色谱仪¹⁴N和¹⁵N种物种用于计算修剪/刷子（修剪，上部)或刷子/刷子（刷子，下部)比率。蛋白质比率由每个生物复制的平均肽比率产生。所有三个生物复制品的平均蛋白质比率用于生成最终的修剪/刷毛比率。所示结果是一个单一的生物复制。(B类)通过LCLC-MS/MS对来自桶皮层突触体的完整鉴定和量化蛋白质队列的火山图，用Log2倍变化修剪/刷与-Log10方差分析进行绘图P（P）值。(插入)满足统计阈值（ANOVA）的蛋白质P（P）<0.05）和减少≥20%。显著减少的突触蛋白用绿点表示。(C类)通过LCLC-MS/MS和统计截止值（ANOVA）对全细胞突触体中所有蛋白质进行量化的火山图P（P）<0.05）和≥20%的还原截止值。感觉缺失的桶状皮层突触中显著减少的突触蛋白（B类，在中列出表1)被指示为红色数据点。注意，55种突触蛋白中有32种在桶状皮层中显著减少(表1)在小脑中也有发现，只有一个在小脑也显著减少。

在修剪和刷毛小鼠的桶状突触体之间显示出显著差异（向上或向下）的250个蛋白质中，只有四个在全细胞突触体中也发生了显著变化(表S1和S2系列，浅灰色填充），表明这些报告的变化显示了对桶皮层的高度特异性。小脑的结果被绘制为火山图，突触蛋白列在表1在图中用红点表示(图2C类). 值得注意的是，在表1小脑也显著减少，小脑的减少程度小于大脑皮层。为了用一种独立的技术验证MS数据，用22种抗体进行半定量免疫印迹，这些抗体在预测的分子量下识别不同的条带，使用β-肌动蛋白染色进行归一化(图3). 所有22项免疫分析均报告修剪样品与刷洗样品中的蛋白质水平（修剪样品中有19项降低，2项不变，1项增加）与MS数据一致，因此表明几乎没有假阳性鉴定。

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图3。

免疫化学分析证实了MS结果预测的变化。所有六个桶状皮层样品（三个修剪过的和三个刷过的）的Western blot检测了MS鉴定为显著减少（Down）的19个蛋白质，两个鉴定为不变（Control）的蛋白质，以及一个鉴定为修剪过的与刷过的桶状皮层样本中升高（Up）的蛋白质。计算每个带的光密度，并将其归一化为β-肌动蛋白免疫反应性，然后计算修剪与刷毛的平均归一化光密度之比（T/B）。百分比越低，表示修剪后的减少越大(*P（P）< 0.05., **P（P）< 0.01).

在完整的大脑中，突触蛋白的表达并不局限于突触，因为这些蛋白是在整个神经元中合成和运输的，并且在完整的皮层中很少观察到突触蛋白的层状定位的依赖性改变(67). 因此，我们测试了突触蛋白表达的定量变化是否可以转化为完整大脑中空间定位的改变。我们比较了感觉缺失（修剪）和感觉正常（刷毛）大脑皮层切片中SynGAP1蛋白的分布(图4). SynGAP1是一种突触后密度蛋白，其在前脑中的丰度与PSD-95几乎相等(68)在发育过程中，靶向突变导致SynGAP1的丢失对桶皮层的形成有害(69)并导致学习障碍(59,70). 此外，先前已经证明SynGAP1 mRNA在P35小鼠的第II层和第V层中具有空间集中性(69). 在感觉正常（刷状）的皮层中，SynGAP1蛋白免疫反应集中于第一层，而第二层至第六层则呈弥漫染色，除了第四层皮层皮层桶的轮廓模糊，第五层稍高染色(图4B类). 尽管先前证实神经元胞体中mRNA表达水平较高(69)，神经元胞体SynGAP1蛋白免疫反应性普遍较差，仅在第五层可见散在的SynGAP2阳性神经元胞体。第二层至第六层感觉缺失（修剪）的桶状皮层也呈弥漫染色；然而，在感觉剥夺的皮层中，I层没有观察到高SynGAP1免疫反应(图4A类). 当SynGAP1染色表示为第I层的比率时(图4C类)至第四层（由桶状传入纤维的VGlu2免疫反应性定义；图4天)，这一比率在感觉正常的桶状皮层中显著升高(图4E类). 这些数据表明，通过蛋白质组学和免疫印迹技术在失去感觉的突触中检测到的蛋白质表达的显著降低转化为该突触蛋白质层流表达的变化，从而影响到完整的皮层。

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图4。

SynGAP1蛋白在冠状面上的分布与感觉缺失（修剪）和感觉正常（刷毛）的桶状皮层不同。(A类和B类)代表性修剪脑皮质全化学脑切片的免疫组织化学(A类)和刷子(B类)仅对SynGAP1进行桶场染色(左侧)并用VGlut2染色覆盖以标记第四层（红色荧光）(赖特). (C类和天)SynGAP1免疫反应性A类（修剪，红色）和B类（拉丝，蓝色）被绘制成通过第一层皮层深度的函数(C类)和第四层(天). (E类)在感觉缺失（修剪）与感觉正常（刷毛）的桶状皮层中，总第一层与第四层SynGAP1染色的比率显著降低(P（P）=0.012，双尾配对t吨测试，n个=每种情况4只动物）。通过将第一层的平均免疫反应除以给定组织切片的第四层的平均阳性反应，计算第一层到第四层SynGAP1的总阳性反应比率，并在每种情况下对四只动物的这些值进行平均。染色比率的这种表示提供了内部标准化，以便可以比较不同切片中的染色。此处所示的所有动物的所有皮质层的SynGAP1免疫反应如图所示图S1.

蛋白质降解机制是一类在缺失突触中显著积累的蛋白质(表2和粗体文本表S2,左侧列)包括蛋白酶体亚单位（Psmb7、Psmd1和Psmd11）、E2连接酶（Ube2o和Ube2l3）和E3连接酶类（Ubr4和Nedd4）。表2列出了在缺失突触中显著升高的蛋白酶体蛋白，并报告了它们相应的IPI数量、平均修剪比率：刷状蛋白水平（T/B）、定量肽数量(¹⁴N个/¹⁵N对），从中计算平均值，方差分析P（P）以及之前的研究，这些研究已经证明了蛋白下调或上调对脊椎形态、轴突形态、突触传递和/或行为的影响。

讨论

先前试图鉴定和表征赋予突触稳定性的关键突触蛋白，在很大程度上依赖于个体候选者的上调或下调来估计对突触强度或成熟度的影响。无偏见地寻找由于感官刺激而上调的蛋白质的想法并不新鲜，但以前的尝试基于凝胶电泳分析的体外放射标记(73)被低灵敏度、低分辨率和无法识别显示出改变的分子所阻碍。重稳定同位素标记与基于MS的鉴定和定量(74)为鉴定体外活化突触中富含的蛋白质提供了一种强大且几乎无偏见的策略。现在已经证明哺乳动物氨基酸的稳定同位素标记（SILAM）(75)该方法对于研究体内突触蛋白对经验依赖性可塑性的反应至关重要。当前基于MS的技术的敏感性仍然需要对整个异质脑区进行采样，而不是对单个细胞或突触进行采样(76). 因此，基于MS的蛋白质组学在鉴定赋予突触稳定性的突触蛋白时面临的挑战是可以在分析之前对整个组织样品进行操作。

众所周知，在突触发生和成熟过程中，大脑特定区域的感觉活动减弱，会显著改变整个组织的突触特性。事实上，胡须修剪被广泛用于减少对大脑皮层的感觉输入，而此前的研究表明，这种技术会影响突触的形态和在该组织中的传递(77,78). 使用基于MS的定量技术和¹⁵以N只小鼠为内标，将每日进行双侧胡须修剪的感觉缺失小鼠与进行双侧胡须刷洗的感觉正常小鼠的大脑皮层突触蛋白谱进行比较。该体内蛋白质组学筛查的结果用于搜索在剥夺性突触和正常突触中减少的突触蛋白质，从而预测接受正常感觉输入的稳定突触中的富集。我们确定了在失去感觉的突触中同时上调（161个蛋白质）和下调（89个蛋白质）的蛋白质，并通过免疫化学验证了其中20个蛋白质(图3和​和4），4)从而支持MS数据准确的结论。正如预期的那样，突触体样品中含有兴奋性突触和抑制性突触的蛋白质，如谷氨酸和GABA受体(表1)从而表明我们的分析中包含了这两类突触。我们将重点讨论在感觉缺失动物中显著下调的突触蛋白(图2B类,插入和表1)这表明它们在稳定的突触中以活动为基础的富集。

95%以上的定量蛋白，包括丰富的突触蛋白，如PSD-95和凝胶蛋白，在高活性和低活性饲养条件下没有显著差异，表明兴奋性或抑制性突触密度没有组织范围的变化。剥夺大脑皮层突触中显著减少的突触蛋白(表1)代表几种突触蛋白，如受体、通道、跨膜、分泌型、突触后密度、下游信号、突触前小泡和细胞骨架蛋白(图5). 此前研究表明，剥夺性突触中的几种蛋白质在统计学上下调，可促进大的蘑菇状棘，这是成熟、稳定突触的一个明确形态特征（参考文献见表1). 在这些蛋白质中，有许多突触后膜相关蛋白（GluA2、GluN1、Flotillin1、ICAM5和Teneuri2）、突触后密度蛋白（GKAP、kalirin、Sap102、Shank1和SynGAP1），它们是细胞内支架膜信号的支架，以及三种独特的突触后连环蛋白（α2、β1和δ2），它们将支架连接到肌动蛋白网络。调节轴突形态的蛋白质（有关参考，请参阅表1)并影响体内记忆任务的行为或表现（有关参考，请参阅表1)虽然这些蛋白中的许多在突触稳定性方面没有显示出明确的分子作用，但也被鉴定为剥夺性突触减少。我们预测，这些特征不明显的突触蛋白将成为未来进一步阐明引起突触稳定性的分子动力学的有趣靶点。

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图5。

总结已确定的突触前或突触后位置、蛋白家族和所有已确定的在失去感觉的桶状皮层突触中显著下调的突触蛋白的推测功能，并在表1感觉剥夺的影响显然不限于一类蛋白质。

许多促进突触强度（成熟和稳定突触的另一个关键特征）的蛋白质在失去感觉的突触中也在统计上下调（参考文献见表1). 这些蛋白质中有几个兴奋性突触后离子型谷氨酸受体（GluA1、GluA2、GluN1、GluN2A、GluN2B）。GluA3也被确定为下调，但不符合统计指南。TARP-γ3是一种已知的GluA辅助亚单位，在我们的筛查中也被确定为随着剥夺而下调。此外，GluA1在感觉剥夺突触和正常突触之间表现出最大的对比之一，这是基于先前的报告所预期的，该报告表明，胡须经历将GluA1驱动到L4到L2/3突触，从而产生经验依赖性突触可塑性(79). GABA受体（GABAA-α2）也被鉴定为下调，这表明抑制性突触信号传导也受到感觉剥夺的影响。虽然谷氨酸和GABA受体在剥夺性突触、PSD-95和凝胶蛋白中显著下调，但谷氨酸能突触和GABA能突触中的突触后支架蛋白分别保持不变，这表明这些变化不仅仅是谷氨酸能和GABA能够突触密度显著变化的结果。然而，如前所述(77,78,80,81)在我们的整个大脑样本中，突触密度的局部变化可能已经被稀释了。未来需要使用不同技术进行研究，以确定突触数量变化与每个突触表达水平变化在多大程度上导致表达变化。不管怎样，电路都会被改变。

虽然大多数在剥夺性突触中被鉴定为减少的蛋白质以前被认为与稳定突触有关，但SynGAP1以前也被认为与脊椎消除有关，其下调被证明可以增强突触强度(59). 因此，我们没有预测到这种蛋白在剥夺性突触中会减少，我们在失去感觉的和正常的大脑皮层中对这种蛋白进行免疫染色，以确定这种蛋白在何处显示出减少的水平。通过免疫组织化学，我们证明双侧胡须修剪导致的感觉剥夺改变了SynGAP1在桶状皮层中的层流分布，因为只有第一层桶状皮层在感觉剥夺皮层与感觉正常皮层中表现出明显较低的SynGAP2蛋白水平(图4). 这些数据表明，MS检测到的SynGAP1蛋白水平的降低以及整个大脑皮层突触体的免疫印迹主要是由于第一层棘的减少。之前的研究表明，修剪晶须可以降低第一层皮层的脊椎消除率(82)，这一发现与SynGAP1的减少一致，SynGAP1与该区域的脊柱消除有关。因为之前研究表明，降低神经元中SynGAP1的水平可以稳定脊椎中的肌动蛋白网络，从而实现活动无关的脊椎稳定性(59)，我们的数据表明，感觉剥夺导致的第一层脊椎稳定可能部分由该区域SynGAP1蛋白水平降低引起，并且这些第一层突触可以独立于活动水平而稳定。因此，除了它在认知中的独特作用外(83,84)SynGAP1似乎在经验依赖性可塑性中发挥着重要作用。此外，I层脊髓中SynGAP1的减少表明，SynGAP2可能是未来体感可塑性活体内光学成像研究的一个有吸引力的候选者。进一步研究以确定在感觉剥夺后表现出SynGAP1水平降低的第一层脊椎的突触伙伴，将进一步深入了解感觉信息的局部组织。

我们发现许多突触蛋白在哺乳动物神经系统中尚未引起注意，但在体内对突触动力学有明显贡献果蝇属或在体外培养的神经母细胞瘤细胞系中。例如，Fry已被证明对组织果蝇属感觉神经元树突通过避免同源树突分支覆盖整个感受野而无冗余(25). 尽管Fry已在哺乳动物胚胎脑组织中表达(85)Fry在哺乳动物系统中的作用尚未研究。肌腱蛋白是跨突触信号传递和突触细胞骨架组织所必需的果蝇属神经肌肉突触和嗅觉受体神经元(33,86). 最近，哺乳动物的teneurins被证明是latrophilin（Lphn）受体，已知其能介导黑寡妇蜘蛛毒液α-latrotoxin引起的大规模突触胞吐，也被确定为在缺乏突触中减少(48,87). 研究表明，刺突2能够调节神经突起的形成和生长，但仅限于神经母细胞瘤细胞系(55). 对哺乳动物初级突触中这些蛋白质的进一步研究将为突触成熟和稳定的机制提供关键见解。

蛋白质降解机制是一类在缺失突触中显著积累的蛋白质(表2)包括蛋白酶体亚单位（Psmb7、Psmd1和Psmd11）、E2连接酶（Ube2o和Ube2l3）和E3连接酶类（Ubr4和Nedd4）。此前已有研究表明，Ubr4通过稳定微管来稳定神经元过程，而这种蛋白的敲除会导致细而弯曲的神经突起(71). Nedd4以前曾参与GluA1的泛素化，导致其内化，从而降低突触强度(72,88). 因此，这些被剥夺的突触中Nedd4的上调可能与观察到的突触GluA1的减少有关(表1)导致神经突触减弱。感觉缺失突触中蛋白质降解途径的上调表明突触蛋白质的更替更大。再加上剥夺性突触中下调的蛋白质数据，这些数据表明，感觉剥夺可能会导致桶状皮层突触的长期抑制，导致较弱的突触和较高的突触消除率，正如之前所建议的那样(89). 未来，将蛋白质降解机制的这些变化定位于特定区域和特定细胞类型，可以为突触蛋白在经验依赖性可塑性过程中如何调节提供有价值的见解。

PKMζ和CPEB3是长期突触可塑性背后的蛋白质开关的两个流行候选者，这两种蛋白质一旦被激活，就会自我维持，在被激活的突触上建立局部正反馈回路，以维持长期强度(90,91). 在本研究中，MS在桶状皮层突触中未检测到PKMζ，PKCζ的一种剪接变体，这表明该蛋白在该年龄段可能不在该区域表达。MS确实检测到了PKC的α、β、γ、δ、δIV、δV、δVI、δVII、ε、θ和Ⅰ亚型，其中只有PKCγ在修剪和刷毛动物之间表现出差异(表1)表明MS对相关信号分子具有足够的敏感性。CPEB3在剥夺性突触中显著升高(表S2). 然而，由于目前的MS数据没有揭示CPEB3在剥夺性突触和正常突触中的激活状态，该蛋白是否抑制或激活了这两组动物突触中局部蛋白的合成尚不明确。在未来的基于MS的屏幕中，监测翻译后修饰可以解决这种模糊性，并发现缺失突触和正常突触之间的额外分子差异。

蛋白质组学筛选的结果与转录组研究是互补的，例如最近对大鼠海马树突中富含mRNA转录物的无偏见筛选(92). 蛋白质丰度受合成和周转的影响，通常仅从mRNA水平无法预测(93). 我们的研究涵盖了大脑皮层的突触前和突触后小室，在蛋白质合成位置方面没有偏见，并侧重于对感觉输入的反应变化，而当前的转录组数据侧重于突触后可翻译的mRNA，尚未包括环境调制。然而，公布的本地转录组(92)包括我们的250种蛋白质中的229种的信使核糖核酸，这些蛋白质被胡须修剪显著调节，这一显著的一致性表明，大多数丰度取决于突触活性的蛋白质确实被局部翻译。之前已经测量过视觉皮层中突触蛋白水平的变化，以应对黑暗饲养引起的感觉剥夺(94)但该筛选使用了不同的标记策略（iTRAQ），并量化了较少的蛋白质（总计467个）。在我们确定的250种因感觉剥夺而改变的蛋白质中，只有58种在前一个屏幕中进行了量化，只有11种在视觉皮层中发生了显著改变。在这11种蛋白质中，只有三种改变了1.2倍以上，这是我们研究中使用的截止值，这三种蛋白质在两项研究的剥夺组织中都以相同的方向改变，因此表明受到剥夺感官体验影响的突触蛋白质部分重叠。然而，我们整个大脑皮层样本中的组织和细胞异质性可能掩盖或稀释任何特定蛋白质的变化(95).

这一无偏见的蛋白质组学筛选确定了动物体感输入变化引起的突触蛋白谱的变化。正如预期的那样，剥夺性突触中许多突触后蛋白的下调通常会促进脊椎扩大和突触强度，这两个特征促进了突触的稳定性。值得注意的是，许多在调节突触稳定性方面特征较少但与肌动蛋白依赖性神经突起形态或与学习任务相关的体内行为有关的蛋白质在失去感觉的突触中也被下调。这些蛋白质有望成为研究突触稳定性的未来靶点。此外，该蛋白质组学筛选鉴定出许多特征不明显的突触蛋白，这些突触蛋白对感觉发育和经验依赖性可塑性有明显贡献。因此，本研究为监测具有高空间和时间分辨率的单个基因标记蛋白质的合成和周转的强大新技术提供了大量良好的候选者(96——98). 此外，需要对单个蛋白质进行过表达或下调，以剖析其功能作用。因此，这项研究为无数研究突触调制的分子基础提供了一个重要的起点。

原始文件和完整参数文件将在http://fields.scripps.edu/published/stound网站/发布后。

材料和方法

补充材料

致谢

脚注

工具书类