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《公共科学图书馆·综合》。2013; 8（2）：e56116。
2013年2月20日在线发布。 数字对象标识：10.1371/日志.pone.0056116
预防性维修识别码：项目经理3577806
PMID：23437087

内皮素过度表达对新型永生化小鼠肝星状细胞TGF-β1信号通路的调节

斯特芬·K·梅尔,#1 穆罕默德·阿尔萨曼,#2 哈塞·萨欣,2 赫尔曼·瓦斯穆特,2 塔蒂亚娜·基塞莱娃,三 大卫·A·布伦纳,三 克里斯蒂安·特劳特温,2 拉尔夫·魏基尔琴,1和大卫·肖尔滕2,*
萨达希娃·卡尼克，编辑器
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

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补充资料

摘要

肝星状细胞（HSC）在肝纤维化的发病机制中起着重要作用。在主要HSC上工作需要困难的隔离程序；因此，我们在胶原蛋白1（I）启动子/增强子的控制下，生成了表达GFP的小鼠肝星状细胞系，并对其进行了表征。这些细胞对前成纤维细胞刺激（如PDGF或TGF-β1）有反应，并能够激活包括Smads和MAP激酶在内的细胞内信号通路。然而，由于基础水平的激活，TGF-β1没有显著诱导GFP表达，而TGF-β1调节的内源性I型胶原表达相反。我们可以证明，辅助TGF-β-受体内切蛋白（内源性表达水平很低）在短暂过度表达时对这些细胞的信号传递有不同的影响。在内皮素的存在下，Smad1/5/8的活化显著增强。此外，ERK1/2的磷酸化增加，波形蛋白、α-平滑肌肌动蛋白和结缔组织生长因子的表达上调。内皮素诱导分化抑制因子-2的表达略有增加，而内源性I型胶原的数量减少。因此，这种来源于肝星状细胞的促纤维化细胞系不仅是一种有前途的新型实验工具，而且可以用于体内用于细胞追踪实验。此外，它还可以研究各种调节蛋白（如内皮素）对促纤维化信号转导、分化和肝星状细胞生物学的影响。

介绍

为了应对肝损伤，肝星状细胞（HSC）从静止的维生素a储存表型转分化为活化的肌纤维母细胞样细胞（MFB）[1]HSC调节炎症和细胞外基质（ECM）沉积，是损伤肝脏胶原形成的主要来源[2]由于HSC在肝脏病理学中的关键作用，多年来一直是科学研究的重点。从那以后，这些细胞的整体可塑性一直是一个科学挑战。然而，使用初级HSC需要复杂的分离和分选过程，这通常显示出低产量、耗时、昂贵并且只允许有限数量的实验[3]因此，一些永生化HSC细胞系被用于在体外多年的实验。不幸的是，所有这些细胞系都代表了具有肌纤维母细胞样表型的细胞，与原代HSC/MFB相比，可塑性大大降低，蛋白质表达模式也大不相同。[4]由于其起源于神经原嵴，HSC是唯一表达胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、神经纤维蛋白、突触素和p75受体的肝细胞[5],[6]在激活和转分化为MFB后，HSC失去其维生素A滴，上调间充质标志物的表达，如α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、结蛋白、波形蛋白和纤维连接蛋白[7].

TGF-β1是一种主要的促纤维化细胞因子。它通过多种机制发挥作用，包括直接激活HSC和刺激ECM生成，以及促进基质金属蛋白酶组织抑制剂（TIMP）的合成，从而抑制ECM降解[8]I型胶原是TGF-β1在纤维化中调节的关键基质成分[2],[9]此外，TGF-β配体家族调节许多生理和病理过程，如增殖、细胞分化和凋亡[10].

有三种不同的TGF-β亚型（TGF-α1，β2，β3）被表达，它们与位于细胞膜上的异寡聚受体复合物结合。对于TGF-β1，该复合物包含I型受体（TβRI）ALK5和II型受体（TβRII）的二聚体。TGF-β1与TβRII结合导致与ALK5共组装，ALK5通过Smad蛋白（即Smad2和Smad3）的磷酸化将信号传递到细胞内隔间[11]这些反过来转移到细胞核，在那里它们与其他转录共激活物或共抑制物相互作用以调节基因表达[12]在包括HSC在内的多种细胞类型中，TGF-β1与另一种I型受体，即ALK1结合。与ALK5相反，ALK1作用于Smad1、Smad5和Smad8的磷酸化，以调节不同的基因子集[13],[14]β-聚糖和内皮素是两种III型TGF-β受体。内皮素（CD105）是一种二硫键、同二聚体跨膜糖蛋白[15]在增殖的血管内皮细胞上高度表达[16]、成纤维细胞[17]，巨噬细胞[18]、血管平滑肌细胞和HSC[19]在TβRI和TβRII存在下，Endoglin结合TGF-β-超家族的不同配体[20]作为一种辅助的TGF-β共受体，它调节TGF-α1-ALK1和TGF-γ1-ALK5信号通路之间的平衡[21].

最近，内皮素的表达与纤维化疾病有关。在人系膜细胞上表达并调节ECM合成[22]以及它对成纤维细胞功能的影响[19]大鼠HSC和MFB表达大量内皮素；从而调节TGF-β的两种不同的相互连接的信号通路[20],[23]我们最近可以证明内皮素调节CFSC-2G细胞的TGF-β1信号传导和分化，CFSC-2G细胞是一种起源于大鼠HSC的永生化细胞系[24]此外，丙型肝炎感染患者[23]或肝硬化显示高水平脱落的可溶性内皮素[25].

我们在此生成并表征了一种新的永生化小鼠HSC细胞系，该细胞系在胶原α1（I）启动子/增强子的控制下携带GFP转基因，并证明该细胞系是一种很有前景的工具，可用于研究促纤维生成信号的特殊问题。在该细胞系中，内皮素调节TGF-β1 Smad/非Smad信号通路，导致这些永生化HSC具有不同的成纤维特性。

材料和方法

原代肝星状细胞的分离培养

使用Nycodenz梯度离心法分离正常C57BL/6和Col-GFP转基因小鼠以及Sprague-Dawley大鼠的原代HSC，并按之前所述进行培养[26],[27],[28]GRX细胞、CFSC-2G、HSC-Col-GFP、HSC-Sv40/mTert、HepG2和COS-7细胞的来源和培养条件列于表S1取Dulbecco改良Eagle培养基（Lonza，Walkersville，MD，USA）、胎牛血清（FCS，Perbio Science，Cramlington，UK）、4mM L-谷氨酰胺、100IU/ml青霉素和100µg/ml链霉素（均来自Cambrex，Verviers，Belgium）和非必需氨基酸（CFSC，Lonza，Walkersville，MD，USA）制备最终培养基。

Col-GFP永生化肝星状细胞系的建立、产生和培养

在293 Phoenix生态细胞系（Invitrogen，Life Technologies，Darmstadt，Germany）中生成了包含SV40大T抗原（加利福尼亚大学圣地亚哥分校Jean Y.J.Wang博士馈赠的礼物）和潮霉素抗性基因的慢病毒载体。将纯化的载体AL-118 Polybrene（Sigma，Taufkirchen，Germany）和潮霉素（Sigma-）添加到Col-GFP细胞的原代培养物中。确定了Hygromycin耐药菌落和Hygrumycin的单细胞克隆+GFP公司+细胞生成。

质粒

荧光素酶报告子结构（CAGA）12-MLP-Luc和组成活性人类ALK5（ca-ALK5）的过表达构建物是荷兰莱顿大学医学中心Peter ten Dijke博士的礼物。大鼠内皮素（L型，pcDNA-endoglin）的表达载体已经描述过[29],[30]小鼠内切蛋白表达载体（IRAVp968G0448D6）购自imaGenes GmbH（德国柏林）。

瞬时转染实验

COS-7和小鼠HSC在生长培养基中培养（GM，参见表S1)直到80%融合。对于瞬时转染，将细胞系以2.5–3×10的密度放置在6孔培养皿中5每口井。用2µg DNA和6µl Mirus转染试剂转染COS-7细胞（Mirus，VWR International GmbH，Darmstadt，Germany）。用2µg DNA和4µl Lipofectamine 2000试剂（Invitrogen）转染小鼠HSC。24小时后，更新培养基，将细胞用于刺激实验，或在含有蛋白酶抑制剂的完全™混合物的裂解缓冲液中提取蛋白质[50 mmol/l Tris/HCl（pH 7.2）、250 mmol/l NaCl、2%（v/v）NP-40、0.1%（w/v）SDS、0.5%（w/v）脱氧胆酸钠、2.5 mM EDTA]（德国曼海姆罗氏）和磷酸酶抑制剂鸡尾酒集II（Sigma），稀释度为1∶100。

刺激和抑制实验

Col-GFP细胞在含有10%（v/v）FCS的生长培养基中培养。接下来，将培养基更换为无血清DMEM，并将细胞与100或250 ng CXCL9/ml（德国威斯巴登研发系统公司）、100或200 ng/ml PDGF（Sigma）或不同浓度（0.5、1、5、10和25 mg/ml）乙酰半胱氨酸（德国霍尔兹基兴Hexal AG）孵育24小时。此后，按照前面所述分离蛋白质或mRNA。对于用重组TGF-β1（0.1/1.0 ng/ml）、BMP-2、BMP-7、PDGF-BB（各25 ng/ml，或EGF（50/100 ng/ml。如有指示，用5µM SB431542（Tocris Bioscience，BIOZOL，Eching，Germany）或1µM Dorsomorphin（Biomol，Hamburg，Gerany）预处理细胞30分钟。分别是。在指定的时间间隔后，使用RIPA裂解缓冲液提取细胞蛋白。使用DC分析试剂（德国慕尼黑Bio-Rad）对裂解产物中的蛋白质进行定量，并通过Western blots进行分析。

免疫荧光分析

CCl的福尔马林固定冷冻肝组织4-使用Olympus IX71荧光显微镜（Olympus，Melville，NY，USA）在没有进一步染色的情况下分析处理的胶原α1（I）-GFP小鼠的GFP表达。

免疫细胞化学分析

对于Col-GFP转基因细胞的免疫荧光染色，细胞固定在4%多聚甲醛中。在用0.2%BSA封闭30分钟后，使用针对α-SMA、GFAP、突触体素的特异性抗体或适当的同种对照物对细胞进行染色，然后使用二级Alexa Fluor抗体和4,6-二氨基-2-苯基吲哚对细胞核进行共染。本分析中使用的所有抗体和稀释液见表S2为了进行GFP表达分析，Col-GFP细胞在含有10%FCS培养基的DMEM培养基中以7-8×10的密度放置在96孔细胞培养皿中过夜三细胞/孔。刺激前，细胞在无血清DMEM培养基中保存24小时。使用FLx800荧光微孔板阅读器（德国巴德弗里德里希郡BioTek）在400 nm激发和508 nm发射下分析GFP表达。

Western Blot分析

为了进行Western blot分析，将培养的细胞在冰镇PBS溶液中洗涤，并在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液中提取。在NuPAGE LDS电泳样品缓冲液（Invitrogen）中在还原条件下稀释等量的蛋白裂解物，在75°C下加热10 min，并使用MOPS-SDS流动缓冲液[50 mmol/l 3-（N-吗啉）-丙烷磺酸，50 mmol/l Tris-HCl（pH7.7）]在4–12%双三凝胶（Invitrone）中分离、3.47 mmol/l SDS和1.025 mmol/l EDTA]或MES-SDS运行缓冲液[50 mmol/l 2-（N-吗啉基）-乙烷磺酸、50 mmol/l Tris-HCl（pH 7.3）、3.47 mmol/l SDS和1.025 mmol/l EDTA]。使用NuPAGE转移缓冲液（Invitrogen）将蛋白质电印迹到硝化纤维膜（0.2µm，Schleicher&Schuell，Dassel，Germany）上，并在胭脂红S染色中通过β-肌动蛋白抗体探测监测相等的蛋白质负载。含5%（w/v）非脂奶粉的TBST[10 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，0.1%（v/v）Tween 20，pH7.6]中的非特异性结合位点被阻断。使用的主要抗体列于表S2使用辣根过氧化物酶（HRP）结合二级抗体（美国加利福尼亚州圣克鲁斯的圣克鲁斯生物技术公司），使用SuperSignal West Dura Extended Dura底物（Perbio Science）观察一级抗体。

使用LumiAnalyst软件（3.1版）和Lumi-Imager系统（均来自Roche）进行密度分析。带强度归一化为β-肌动蛋白，对照强度设置为1，其他强度作为折叠诱导。

RNA分离、cDNA合成及定量RT-PCR分析

根据制造商手册，使用Purelink RNA Mini Kit（Invitrogen）从粘附细胞中提取总RNA，并进行柱上DNA消化。对于RT-PCR实验，使用Superscript II逆转录酶试剂盒（Invitrogen）和随机六聚体引物在42°C下逆转录60分钟总RNA的纯化样品（每个1µg）。将等分的第一链cDNA在1×PCR缓冲液[10 mmol/l Tris-HCl（pH8.3）、50 mmol/lKCl、1.5 mmol/lMgCl中进行PCR2]使用2µM正向/反向引物，每个dATP、dCTP、dGTP、dTTP和2.5 U塔克DNA聚合酶（罗氏）。根据制造商的说明，使用ABI PRISM仪器（Invitrogen）的SYBR GreenER qPCR SuperMix试剂系统，在7300实时PCR系统（美国加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）上进行定量实时PCR（qRT-PCR）。本研究中使用的循环条件和引物组合见表S3.对结果进行了分析通过第2个-ΔΔCt方法β-肌动蛋白作为参考基因。

统计

结果显示为三个独立实验的平均值（±SEM）。使用未配对的Student t检验进行统计分析。

结果

Col-GFP永生化肝星状细胞的制备

在胶原α1（I）启动子/增强子的控制下，从表达绿色荧光蛋白（GFP）的Col-GFP小鼠中分离出HSC(图1A和1B)[27],[28].这些小鼠接受CCl治疗48周后，激活的HSC中的胶原蛋白启动子活性通过GFP表达反映出来。入口显示未经处理的Col-GFP小鼠没有胶原蛋白启动子活性。通过使用蓝色滤光片的自发荧光，可以在未经治疗的小鼠的肝组织中检测到维生素A液滴。事实上，HSC的分离和FACS的分选仅仅是基于之前报道的这种自荧光[27],[28]CCl导致肝组织中的这种自体荧光降低4治疗小鼠是因为活化的HSC会失去维生素A滴。为了产生永生化细胞系，用表达SV40-大T抗原和潮霉素耐药基因的慢病毒载体构建物感染HSC。在含有潮霉素的培养基中通过选择分离单个细胞克隆(图1C).

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产生携带Col-GFP的永生化细胞。

永生化Col-GFP星形细胞的特性

为了表征分离的HSC细胞系，我们首先分析了永生化Col-GFP细胞的HSC/MFB典型标记。α-SMA、GFAP和突触体素的免疫荧光染色显示这些间充质和神经源性标记物的表达(图2A–C). GFP的强烈表达反映了胶原α1（I）启动子/增强子的激活，正如在活化的、产生胶原的HSC中所看到的那样(图2D). 免疫组织化学染色显示间充质和神经源性标记物与活化标记物胶原α1（I）共同表达，这是活化肝星状细胞的特征[31]我们得出结论，永生化细胞代表了高纯度的活化HSC群体。

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Col-GFP细胞系的特性。

携带α-SMA Col-GFP报告盒的细胞的免疫荧光染色(A类)、GFAP(B类)、突触素(C类). (天)用紫外荧光显微镜检测GFP信号。(E类)通过定量PCR分析α-SMA、I型胶原、GFAP和p75的表达，并与静止的原代HSC（qHSC）和培养7天的活化HSC（aHSC）的表达进行比较。结果代表三个独立的实验，每个实验重复进行，误差条代表SEM值。(F类)细胞在各自的生长介质中培养，并使用纤维连接蛋白、ColIV、ColI、β-聚糖（与Endoglin、，[20])、波形蛋白、结蛋白、α-SMA、CTGF、Id2、GFP和作为负荷控制的β-actin。(G公司)为了演示ColI的表达，显示了曝光时间较长的图像（n=3）。

接下来，通过RT-PCR将永生化HSC的特性与初级qHSC或体外激活的aHSC进行比较。与静止和激活的HSC相比，永生化Col-GFP细胞表达的α-SMA和p75的mRNA数量高16倍。此外，与静止的HSC相比，胶原α1（I）的表达上调了70倍，而GFAP的表达结果与活化的原发性HSC相似。α-SMA和胶原mRNA的高表达反映了与MFB中观察到的类似的强烈激活程度，并且表达GFAP的能力再次表明胶原α1（I）阳性细胞来源于星状细胞。永生化细胞中Col-GFP的高表达反映了几代后的肌纤维母细胞样表型在体外.

Western Blot分析显示纤维连接蛋白、IV型胶原（未显示）和I型胶原的表达，这些都是由活化的HSC产生的ECM的所有成分(图2F). 间充质和神经源性标记物，如波形蛋白和GFAP（未显示）仅由HSC在肝脏中表达。此外，结蛋白、活化标记物α-SMA、纤维相关蛋白结缔组织生长因子（CTGF）以及分化抑制因子-2（Id2）也表达。不同物种细胞系和原代细胞表达水平的比较表明，所分析的标记在所有永生化细胞系中表达较低。这种效应对内皮素尤其明显（另见下文）。总之，表达分析显示永生化Col-GFP细胞在神经原标记物旁边表达间充质，并产生部分细胞外基质，如纤维连接蛋白和胶原。因此，我们认为这些细胞是起源于HSC的MFB。

GFP表达分析

为了更详细地分析GFP的表达，将Col-GFP细胞在96孔细胞培养板中培养，并使用自动荧光读取器分析消光。图3A显示了细胞数与GFP表达量之间的线性相关性。基于0到1.5×10范围内的线性消光4细胞，我们以5×10的浓度进行了进一步的实验三将预期GFP表达置于GFP测量线性范围内的细胞/孔。

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通过荧光信号进行功能表征。

(A类)将Col-GFP细胞培养到不同的细胞密度，并在自动荧光阅读器中测量荧光信号。在密度为1.5×10的电池电镀后进行以下实验三/嗯。(B、 C类)用指示浓度的CXCL9刺激细胞24小时，并且GFP含量相对于未处理细胞(天)和手机号码(E类)测量。(D、 E类)用指示浓度的ACC刺激细胞24小时，并且相对于未处理的细胞，GFP含量(天)和手机号码(E类)已测量。(F类)显示用指示浓度的PDGF-BB刺激24小时，测量相对于未处理细胞的GFP含量。GFP的增加反映了细胞数量的增加（未显示）。结果代表三个独立的实验，每个实验在16个重复中进行，误差条代表SEM。

为了分析永生化细胞是否对抗纤维化刺激（例如已知会降低HSC活性的CXCL9）产生反应，用100和250 ng CXCL9刺激Col-GFP细胞[32]24小时。我们可以显示GFP消光显著降低约8.8%（p<0.05）(图3B). 这是因为细胞数量/孔减少(图3C)，反映了先前报道的CXCL9的抗增殖特性。通过将Col-GFP细胞与不同浓度的乙酰半胱氨酸（ACC）共同培养，也获得了类似的结果。已知ACC在不同的分子步骤阻断TGF-β1信号传导，包括生物活性TGF-[30],[33]这些实验表明，增加ACC浓度会导致GFP消光率显著降低41%（p<0.001）(图3D)这反映了ACC的抗增殖特性。ACC共同孵育后，细胞数量显著减少（p<0.05），为未处理对照的三分之二(图3E). 正如预期的那样，用PDGF-BB等强促纤维化剂处理Col-GFP细胞，可诱导增殖（未显示），并进一步与约16%GFP表达的显著增加（p<0.001）相关(图3F). 然而，TGF-β1治疗对GFP消退没有任何影响(图3G)，反映了这些永生化细胞已经高度激活的MFB表型，已知这些细胞的TGF-β表面受体可用性降低[34].

Col-GFP细胞对纤维化相关配体的敏感性

为了评估这些细胞作为“模型系统”分析纤维生成信号处理的适用性，我们首先以时间和浓度依赖的方式用TGF-β1处理细胞(图4,图S1和S2系列)显示PDGF-BB和TGF-β1诱导的Smad2诱导的p42磷酸化约为10倍(图S3A). 此外，Smad2（pS2L）、Smad1/5/8、p42、pATF-2和p38中连接区的磷酸化是由EGF通过2到20个因子触发的(图S3B). 两条Smad途径，即ALK5/Smad2/Smad3和ALK5/Smad1/Smad5/Smad8，在TGF-β1作用下瞬间（10分钟）磷酸化(图4A，I). 与Smad2的持续激活（长达4小时）相反，Smad1/5/8的激活只是暂时的，最多可增加1小时，并在刺激后2小时开始被抑制。这种激活模式与Smad1/5/8的直接靶基因Id2的表达相似（与Smad1/1/5/8阻遏相比有轻微延迟）(图4A，III）。由于ALK5抑制剂SB431542消除了Smad通路的激活，因此ALK5是这两种反应的重要组成部分(图4A，I，II）。

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刺激Col-GFP细胞中的纤维生成信号。

(A类)用指定浓度的TGF-β1（0.1 ng/ml；1.0 ng/ml）、BMP-2（25 ng/ml。制备细胞提取物，并通过Western blot检测细胞蛋白PDGFRβ、磷酸化Smad1/5/8（pSmad1/8/8）和Smad2（pSmad2）（I）、磷酸化形式的p38（p-p38）和ERK1/2（pERK1/2）、磷酸化ATF-2（pATF-2）（II）、Id2和GFP的表达。(B类)用EGF（50 ng/ml；100 ng/ml）刺激细胞达到指定的时间间隔。随后，制备细胞提取物，并使用特异性抗体对连接物磷酸化Smad2（pSmad2L）、磷酸化Smad 1/5/8（pSmad 1/8/8）（I）、磷酸形式的p38（p-p38）和ERK1/2（pERK1/2）、磷酸ATF-2（pATF-2）（II）和GFP进行Western blot分析。膜(A、 B类)与β-肌动蛋白特异性抗体一起孵育，以证明相同的蛋白质负载。指示蛋白质的条带强度(A、 C类)测量、归一化为β-actin并表示为未刺激样品的折叠诱导。结果显示了三个独立实验之一的代表性图像。

与TGF-β1相比，BMP-2引起Smad1/5/8及其靶基因Id2的强烈持续激活，Smad2的微弱持续激活，这与0.1 ng/ml TGF-α1治疗后的效果相当。PDGF-BB单独对Smad激活没有影响。

关于MAP激酶，TGF-β1诱导p38微弱但快速的激活（刺激10分钟后开始）和ERK1/2延迟激活（刺激1小时后开始），这与ATF-2的激活类似(图4A，II）。同样，这些反应依赖于ALK5活性，因为SB431542能够阻断两种MAPK的激活。BMP-2引起p38的快速激活，类似于TGF-β1，延迟ATF-2的激活，但对ERK1/2无明显影响。另一方面，PDGF-BB瞬时激活ERK1/2、ATF-2和GFP的表达，但对p38无明显影响。

EGF是肝纤维化发生中的另一种关键激动剂，可导致p38、ERK1/2和底物ATF-2的快速瞬时激活(图4B，II）。此外，由于EGF导致Smad2连接区的快速瞬时磷酸化（与PDGF-BB相当，数据未显示）和Smad1/5/8的C末端区域的微弱激活，因此可以显示Smad通路的收敛(图4B，I).

CoI-GFP细胞中TGF-β1的信号转导

使用短时间点（10分钟）和中间时间点（最多4小时）进行刺激，我们定义了信号传递的时间限制（见上文）以及关键调节点（在诱导和减少Id表达之间切换）。

在下一步中，我们将短期反应（30分钟或1小时）和长期反应（48小时）的最佳时间点描述为内皮素分析的先决条件（见下文）。短期刺激后，Smad1/5/8和Smad2/Smad3在测试的TGF-β1浓度下均被激活(图5A). 总之，Smad3靶基因CTGF很强，Smad1/5/8靶基因Id1和Id2略有增加。在两种浓度的TGF-β1下，MAP激酶p38和ERK1/2也被激活。此外，Smad2（Smad2L）的连接区被磷酸化以响应TGF-β1的应用，反映了ALK5和MAP激酶信号的整合（数据未显示）。所有这些反应都依赖于ALK5（对SB431542的敏感性），但不受BMP受体抑制剂多索吗啡（DM）的影响。此外，分析显示ALK5在这些细胞中表达(图S4). 由于多索吗啡对TGF-β1信号传导没有影响（参见图5;图S5和S6系列)，包括ALK1在内的其他BMP型ALK的表达很可能与功能无关。

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详细分析TGF-β1介导的短期和长期反应。

(A类)用TGF-β1（0.1 ng/ml；1.0 ng/ml）、BMP-7（25 ng/ml。当指示时，在SB431542（SB，5µM）或多索吗啡（DM，1µM。此后，使用磷酸化Smad1/5/8（pSmad1/8/8）、C末端磷酸化Smad2（pSmad2）、磷酸化Smad 3（pSmad 3）、磷酸形式的p38（p-p38）和ERK1/2（pERK1/2）、CTGF、Id1、SV40-大T抗原（SV40）和GFP的特异性抗体，通过Western blot分析蛋白质提取物。(B类)用pSmad3-反应性荧光素酶报告子（CAGA）瞬时转染细胞12-MLP-Luc公司。此后，在SB431542（5µM）存在或不存在的情况下，用（0.1 ng/ml；1.0 ng/ml）或不使用（0）TGF-β1刺激细胞6小时。对细胞进行裂解并测定荧光素酶活性，将其归一化为相应样品的蛋白质含量，并表示为对未刺激对照样品的折叠诱导。(C类)用TGF-β1（0.1 ng/ml；1.0 ng/ml）刺激细胞48小时或不处理细胞（Co），并在饥饿期间（～16小时）用SB431542（SB，5µM）预培养。此后，在刺激前（Co，0 h）采集第一个样本以监测蛋白质表达。刺激后，通过蛋白质印迹分析Endoglin（具有对小鼠Endoglin特异性的抗体）、TGF-β受体II（RII）、纤连蛋白、ColI、波形蛋白、α-SMA、CTGF、Id2和GFP的表达。膜(A、 C类)与β-肌动蛋白抗体孵育以监测等蛋白负荷.指示蛋白质的谱带强度(A、 C类)测量、归一化为β-actin并表示为未刺激样品的折叠诱导。所示结果显示了三个独立实验之一的代表性图像。

密度分析(图S7A)发现TGF-β诱导Smad1/5/8（高达10倍）、其靶基因Id2（高达5倍）和Smad2（40倍）及其靶基因CTGF的磷酸化（高达五倍）。所有反应均被SB-431542（SB）显著阻断。转化生长因子β1将MAP激酶（即p38和p42）诱导为四倍。

另一方面，BMP-7以与TGF-β1相似的方式激活MAP激酶，但主要导致Smad1/5/8磷酸化，仅Smad2/Smad3微弱激活。Smad3的转录活性和对ALK5的依赖性对TGF-β1的反应也由（CAGA）显示12-MLP-Luc记者(图5B).

在TGF-β1刺激48小时后，基质蛋白纤维连接蛋白和I型胶原、激活标记物α-SMA和促成纤维蛋白CTGF被浓度依赖性诱导(图5C，左侧面板 ). 此外，GFP的表达与ColI的模式相似。Id2的表达与前面提到的蛋白质反向调节，被TGF-β1（1 ng/ml）下调，该蛋白可被ALK5抑制剂SB431542部分阻断。为了进一步提高TGF-β1反应的信噪比，尤其是GFP诱导，我们在饥饿阶段（诱导前16小时，图5C，右侧面板 ). 这种治疗降低了α-SMA的表达，增加了Id2的表达（与车道1和车道6相比）。令人惊讶的是，TGF-β1效应降低。应用SB431542可增加TGF-β1受体endoglin和TRII的表达。意外的是，当细胞在含有0.5%FCS的培养基中瞬时培养（饥饿）时，胶原蛋白I、α-SMA和Id2的表达更高(图5C，泳道1、6）与在刺激条件下培养的细胞（0.2%FCS，图5C，车道2、8）。

密度分析表明，在本实验中，所有被分析基因（即Col i，α-SMA）的基础表达在血清饥饿时显著降低（高达80%），在添加TGF-β1后诱导表达达8倍(图S7B). 添加TGF-β1后表现出最高刺激性的基因是CTGF（高达14倍）。SB-431542再次抑制了TGF-β1的刺激作用。

内皮素在CoI-GFP细胞中的表达

图2F已经表明内皮素在原代HSC中的表达通常很高，在小鼠或大鼠细胞系中几乎检测不到。这在图6A其中我们使用了一种小鼠内皮素特异性抗体。与endoglin在早期原代（mHSC3d）和晚期（mHSC7d）活化的HSC中的非常强的表达相比，endoglin在永生化细胞系中的内源性表达几乎是检测不到的。这种低endoglin表达很可能反映了与我们之前报道的活化的原代HSC相比，在完全转分化的原代MFB样细胞中观察到的endoglin丰度降低[24].

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内皮素的内源性和异源性表达。

(A类)将指示的小鼠细胞培养在生长培养基中（见图2F），并使用胶原蛋白I、内皮素（小鼠特异性）、波形蛋白、CTGF、α-SMA、Id2和GFP的特异性抗体通过Western blot分析细胞蛋白。为了验证瞬时转染小鼠内皮素cDNA（mEng）或空pcDNA载体作为对照（Co）的COS-7细胞的抗体特异性蛋白，我们进行了平行分析。实验重复了三次。(B类)使用指定的转染试剂和DNA与试剂的比率，用编码大鼠内切蛋白（rEng）的cDNA瞬时转染Col-GFP或COS-7细胞。制备相应细胞的细胞蛋白，并使用大鼠内皮素特异性抗体（PPabE2，[24].膜(A、 B类)与β-actin抗体孵育以监测等蛋白负荷。

由于Col-GFP细胞的功能特性和内皮素的低表达，我们推断这些细胞可能是分析内皮素对TGF-β1介导的促成纤维细胞反应影响的理想系统。由于瞬时转染（尤其是原代细胞转染，也包括细胞系转染）并不总是适用的，我们首先使用不同的转染试剂和条件在Col-GFP细胞中建立了大鼠Endoglin的瞬时过表达(图6B). 在这些研究中，我们使用大鼠内皮素，通过我们的特异性大鼠内皮激素抗体区分内源性（小鼠）内皮素和外源性（大鼠）内皮素，因为大鼠内皮蛋白以前在CFSC-2G细胞中具有纤维生成信号的功能特征[24]虽然以2∶4的比例用Lipofectamine 2000试剂转染并没有产生最高的蛋白表达，但它是所有测试试剂中关于培养条件的最佳选择，因此用于以下实验。

Col-GFP细胞内Endoglin过度表达对TGF-β1信号转导和标记蛋白表达的影响

为了分析内皮素在Col-GFP细胞TGF-β1信号传导中的功能，我们评估了短期（1小时）和长期（48小时）的反应(图7A–C). 关于Smad信号传导，我们只能证明对Smad1/5/8通路的增强作用，而Smad2/Smad3分支不受内切蛋白过度表达的影响(图7A).

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内皮素对Col-GFP细胞TGF-β1反应的影响。

(A类)用大鼠内皮素（Eng）或控制载体（pcDNA）的cDNA瞬时转染细胞。此后，用TGF-β1（0.1 ng/ml；1.0 ng/ml）刺激细胞或不治疗（Co）。在指定的时间后，制备细胞蛋白并通过Western blot使用针对大鼠内皮素（endoglin，PPabE2）、磷酸化Smad1/5/8（pSmad1/8/8）、C末端-（pSmad2）和连接蛋白磷酸化Smad2（pSmad2L）、磷酸化Smad3（pSma3）、ERK1/2磷酸化形式（pERK1/2）、，磷酸化ATF-2（pATF-2）、CTGF、Id2和GFP。(B、 C类)瞬时转染细胞并用TGF-β1刺激，或不按(A类)48小时。此后(B、 C类)和秘密的(B类)制备蛋白质并使用endoglin的特异性抗体通过蛋白质印迹进行分析(B类)胶原蛋白I和CTGF(C类)波形蛋白、α-SMA和GFP。膜(A–C)与β-actin抗体孵育以监测等蛋白负荷。结果显示了三个独立实验之一的代表性图像。

除Smads外，TGF-β1还诱导MAP激酶ERK1/2和底物的激活，例如激活转录因子-2（ATF-2）。在基础或TGF-β1诱导条件下，内切蛋白存在时，这两种激酶的磷酸化更强。总之，Smad1/5/8的较强激活与即刻早期蛋白Id2的稍高表达平行。CTGF的表达依赖于ALK5(图5A、C)以及由ERK1/2调节[24],[35]，在endoglin的存在下也增加。然而，Smad2连接区（pSmad2L）的磷酸化在内皮素存在时仅略微增加（0.1 ng/ml TGF-β1）(图5A).

根据我们公布的数据[24],[35]，我们发现长期内切蛋白降低了胶原蛋白I的表达和分泌，以及由相应启动子转录控制的转基因GFP(图7B、C). 相反，内皮素存在时CTGF、波形蛋白和α-SMA增强(图7B、C). 然而，与I型胶原相比，CTGF在上清液中的分泌水平很低(图7B，右侧面板 ). 在另一个实验中，我们可以证明，在存在TGF-β1（1.0 ng/ml，24 h）的情况下，上清液中只能检测到少量CTGF。(图S8). 这可以被SB431542阻断，与细胞裂解物中获得的结果类似（参见图5C). CTGF的这种低分泌在所有进行的实验中都可见（n=3），很可能反映了HSC Col-GFP中CTGF分泌率低。由于所有这些蛋白质都依赖于ALK5活性（参见。图5A、C)，endoglin对基于ALK5的信号转导进行差异调制。

Col-GFP细胞内Endoglin过度表达对PDGF-BB介导ERK1/2活化的影响

研究表明，内皮素不仅能增强肌纤维母细胞样细胞对TGF-β1的反应，还能增强对BMP-7的反应，从而增强pSmad1/5/8信号传导[36]此外，由于内皮素能够调节基础和TGF-β1介导的ERK1/2激活，我们询问内皮素是否也可以调节ERK1/2的激活，以响应导致ERK1/2活化的真正配体，即PDGF-BB。如图8ABMP-7引起Smad1/5/8的强烈激活（另请参阅图5A)但endoglin对这种激活没有影响(图8A). 相反，PDGF-BB介导的ERK1/2激活在内皮素的存在下被促进。有趣的是，这种作用并不依赖于ALK5活性，因为ALK5特异性小抑制剂SB431542不会干扰PDGF-BB对ERK1/2的诱导，也不会消除endoglin的增强作用(图8B).

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内皮素对PDGF-BB信号传导的影响。

(A类)使用Lipofectamine 2000和编码大鼠内皮素的cDNA瞬时转染细胞。此后，用或不用BMP-7（25 ng/ml）刺激细胞1小时或用PDGF-BB（25 ng/ml）刺激细胞10分钟。用内皮素（PPabE2）、PDGFRβ、磷酸化Smad1/5/8（pSmad1/8/8）、磷酸化ERK1/2（pERK1/2）和GFP的特异性抗体制备细胞蛋白并在Western blot中进行分析。(B类)如中所述，瞬时转染细胞(A类)在有或无SB431542（5µM）的情况下，用PDGF-BB（25 ng/ml）刺激或不刺激。随后，使用内切蛋白（PPabE2）、PDGFRβ、磷酸化ATF-2（pATF-2）、磷酸化ERK1/2（pERK1/2）和GFP的特异性抗体制备细胞蛋白并在Western blot中进行分析。所有膜均与β-肌动蛋白抗体孵育，以证明蛋白质负载量相等。为了进行密度分析，扫描了β-肌动蛋白和p-p42的条带，后者归一化为β-肌动蛋白。结果表示为相对于pcDNA对照的折叠诱导。结果显示了三个独立实验之一的代表性图像。

讨论

HSC在肝纤维化的发病机制中起着重要作用。因此，在原代HSC培养物中分析了HSC生物学的许多特征，包括ECM的表达、维生素A的储存、收缩性机制和细胞内信号传导。原代HSC经历从静止细胞到激活MFB的复杂细胞转变在体外在塑料盘子上，它们在几天内就转变成MFB。一些永生化星状细胞系也已经产生，但有许多缺点。由于在永生化过程中（通常约3周），静止的HSC快速转分化为激活的MFB，HSC细胞系代表激活的肌成纤维细胞，而不是静止的HSCs。如所示图2F和2GHSC细胞系中不同的蛋白表达模式与原代HSC相似。此外，这里描述的Col-GFP细胞系与观察到的表达模式非常相似，例如在另一个已建立的永生小鼠HSC细胞系（即GRX）中观察到的。

此外，一些细胞系的细胞起源并不完全基于肝星状细胞。例如，广泛使用的GRX细胞系是由C3H/HeN小鼠肝脏中的实验感染诱导的纤维化肉芽肿产生的曼氏血吸虫 [37]广泛使用的LX2细胞系[38]以及hTert细胞系[5]来源于人类，不能直接与小鼠星状细胞相比较。鉴于纤维化肝脏中MFB的多种不同来源（即HSC、门脉周围成纤维细胞、骨髓源细胞[39],[40],[41],[42]拥有一个细胞起源明确、尽可能靠近HSC的细胞系似乎至关重要。在这里，我们描述了由静态HSC（Nycodenz离心和维生素A滴显微分析）产生的永生化MFB细胞系的特征，该HSC来源于在胶原α1（I）启动子/增强子控制下表达GFP的小鼠[43]在免疫荧光、mRNA和Western blot分析中，我们清楚地显示间充质细胞的表达紧邻神经原标记物以及胶原蛋白的表达，这是HSC起源细胞的独特特征。

通过使用此小鼠分离的静止HSC，我们不仅使HSC衍生的MFB永生化，而且还利用这些细胞的内源性特性在激活时表达GFP。因此，在体外这些细胞表现出强烈的GFP表达，反映了胶原蛋白启动子/增强子的激活。这有助于通过免疫荧光或FACS分析直接检测这些细胞。此外，荧光板阅读器的使用可以方便地对多种刺激下的细胞增殖进行批量分析。然而，很可能由于塑料表面的强烈激活，GFP的表达并不能直接反映胶原蛋白的表达。与内源性胶原表达相比，GFP表达仅受这些处理的轻微影响，内源性胶原在TGF-β1治疗后显著上调，在ALK5抑制剂SB421543的存在下显著下调。由于这种稳定的表达，可以在共培养和动物实验中追踪细胞，因为实验环境不会影响标记的表达。

为了分析与纤维生成过程相关的细胞功能，我们首先评估了分离的Col-GFP细胞中TGF-β1信号的一些特征/特征。其他人和我们之前已经证明TGF-β1可激活原代大鼠HSC和细胞系CFSC-2G中的Smad1/5/8和Smad2/3通路，以及正在进行的肝纤维化[23],[24]在Col-GFP细胞系中也观察到类似的激活模式：TGF-β1以时间和浓度依赖的方式诱导两种Smad途径的磷酸化（参见。图4和​和5）。5). 总之，Smad3靶基因CTGF的表达较强，Smad1/5/8靶基因Id1和Id2的表达略有增加。同样，这种模式遵循从主要HSC已知的Smad激活[44],[45]此外，Id蛋白的定时调节（此处显示Id2）是HSC功能的调节器[45]，可以显示(图4和​和5）。5). 在早期时间点（至～1小时），TGF-β1激活Id2表达，而从2小时开始（至48小时）Id2表达被抑制。这两种效应都对SB421543敏感，强调了ALK5在这些反应中的作用。

除了激活Smad蛋白外，TGF-β1还可在Col-GFP细胞中激发非Smad信号。MAP激酶p38和ERK1/2以时间和浓度依赖的方式被激活。通过使用特异性抑制剂SB421543验证，这两种反应均依赖于ALK5。总之，这些实验清楚地表明，信号中间产物和靶基因的激活与HSC原代培养中发现的模式非常相似，并反映了Col-GFP细胞与来自静止HSC的MFB的密切关系。

与endoglin在原代活化的HSC中的高表达相反，endoglin在永生化细胞系中的内源性表达几乎是检测不到的。通常完全转分化的原代MFB样细胞不表达大量endoglin[23],[24]由于星状细胞来源紧密，内皮素的低表达，我们将这些细胞作为分子工具，进一步研究内皮素对TGF-β1介导的促成纤维细胞反应的影响。通过在这些细胞中短暂过度表达大鼠内皮素，我们能够用特异性抗体区分内源性（小鼠）内皮素和外源性（大鼠）内皮素。与CFSC-2G的结果一致，Col-GFP细胞内内皮素的过度表达导致Smad1/5/8通路的激活增强，不影响Smad2/3信号传导（短期）和α-SMA的表达增加（长期，比较。图7A/B） ●●●●。

除Smad细胞内信号传导介质外，TGF-β1还可激活MAP激酶ERK1/2（见上文）。在内切蛋白的存在下，这些激酶的磷酸化明显增加。由于在用PDGF-BB刺激ERK1/2的强激活剂时也观察到这种增加，内皮素对ERK1/2产生的影响似乎是一种普遍现象。内皮素参与调节ERK1/2活性已在一些报告中得到一致证实[46]–[49]然而，与HSC中的观察结果相反，内皮素抑制了除T细胞外的其他细胞类型中ERK1/2的激活。

考虑到硬皮病成纤维细胞中纤维生成基因程序是介导的，内皮素的积极作用更为有趣通过激活Smad1和ERK1/2通路[50]，受endoglin正调控。用内皮素长期刺激可降低细胞和分泌的胶原蛋白I水平以及轻微转基因GFP的表达。相反，内皮素增加了CTGF和波形蛋白（除α-SMA外）的表达，这些反应是ALK5依赖性的。因此，内皮素对基于ALK5的信号转导进行差异性调节，并且很可能改变导致HSC激活和转分化的途径，从而触发肝脏的纤维化反应。

未来的工作将展示新型永生化Col-GFP HSC细胞系的用途在体外应用将是在一个类似于原代HSC/MFB的可靠、易于操作的细胞培养系统中监测治疗药物，建立联合培养系统，其中不同细胞的结合应易于区分，或在特定条件下分析促纤维生成信号级联。此外，细胞系将允许进行细胞追踪实验，在这些实验中可以解决纤维化归巢、寿命和可逆性的不同方面，甚至可以解决HSC/MFB在肿瘤发生中的更多参与。

支持信息

图S1

实验重复次数如所示 图4A .

（畅通节能法）

图S2

实验重复次数如所示 图4B .

（畅通节能法）

图S3

中所示的一个代表性实验的密度分析 图4 .

（畅通节能法）

图S4

ALK5在HSC Col-GFP中的表达。（A）为了证明ALK5在HSC Col-GFP细胞中的表达，在生长培养基（GM）中培养，或饥饿（0.5%FCS）并用10%FCS、TGF-β1（1.0 ng/ml）或未经处理（Co）处理指定时间（30 min，48 h）。此后，提取细胞蛋白，并使用针对TGF-β-受体Betaglycan（TGFβRIII，糖基化形式）、TGFβRII和TGFβRI（ALK5）的特异性抗体通过蛋白质印迹进行分析。作为TGF-β1应用的对照，分析磷酸化Smad2（短期，30分钟）或α-SMA（长期，48小时）。（B）为了进一步证明ALK5在各种抑制剂存在下的表达，细胞处于饥饿状态，或者未经处理（Co），或者在所示物质存在下用TGF-β1（1.0 ng/ml）刺激。此后，使用TGF-β受体β-β-β（TGFβRIII，糖基化形式）、TGFβRII和TGFβ-RI（ALK5）的特异性抗体提取细胞蛋白并通过Western blot进行分析。为了控制TGF-β1活性并监测SB431542的作用，分析了α-SMA和CTGF的表达。这两种蛋白都是由TGF-β1诱导的，在SB431542的存在下，这种作用被消除。多索啡肽（DM）无效，因为该物质在该实验环境中不影响Smad的激活（另请参阅图5A). 总之，所有三种TGF-β受体都在HSC Col-GFP中表达，并且在所有测试条件下都存在ALK5。

（畅通节能法）

图S5

中所示的重复实验 图5A .

（畅通节能法）

图S6

重复的实验如所示 图5C .

（畅通节能法）

图S7

中所示实验的密度分析 图5A和5C .

（畅通节能法）

图S8

HSC Col-GFP中CTGF的分泌。在为证明CTGF分泌而进行的另一项实验中，在存在TGF-β1（1.0 ng/ml，24 h）的情况下，上清液中只能检测到少量CTGF。在SB431542的存在下，上清液中的丰度被阻断，与细胞裂解液中获得的结果类似（参见图5C). 相比之下，ColI分泌量更高，TGF-β1增加（1.0 ng/ml，24 h），SB431542降低。在图7B上清液中分泌的CTGF蛋白检测非常低，只有在Endoglin存在下使用1.0 ng/ml TGF-β1时才可见。CTGF的这种低分泌在所有进行的实验中都可见（n=3），很可能反映了HSC Col-GFP中CTGF分泌率低。

（畅通节能法）

表S1

本研究中使用的细胞和培养基。

（文件）

表S2

本研究中使用的抗体。

（文件）

表S3

本研究中使用的底漆和循环条件。

（文件）

资金筹措表

这项工作得到了德国联邦科学基金会（SFB/TRR 57 P13）、亚琛工业大学和亚琛国立卫生研究院医学院START计划的资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。

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文章来自PLOS ONE系列由以下人员提供多环芳烃