肝脏的葡萄糖生成对于在禁食期间为大脑提供底物至关重要。胰岛素不能抑制肝葡萄糖输出是2型糖尿病（T2DM）高血糖和其他胰岛素抵抗疾病的主要病因1,2五十年来，双胍类药物一直是为数不多的有效降低血糖生成的药物之一，其中包括二甲双胍和二甲双胍，二甲双胍是治疗T2DM最常用的药物三尽管如此，双胍类药物的作用机制仍不完全清楚。十年前，二甲双胍通过激活AMP-活化蛋白激酶（AMPK）酶来减少葡萄糖合成的说法最近在基因功能丧失实验中受到严重质疑4在这里，我们提供了一种新的机制，二甲双胍通过这种机制拮抗胰高血糖素的作用，从而降低空腹血糖水平。二甲双胍导致AMP和相关核苷酸的积累，这些核苷酸抑制腺苷酸环化酶，降低环AMP和蛋白激酶A（PKA）活性水平，消除PKA关键蛋白靶点的磷酸化，并阻断肝细胞依赖于胰高血糖素的葡萄糖输出。这些数据支持二甲双胍的作用机制，包括拮抗胰高血糖素，并建议开发抗糖尿病药物。
双胍类化合物通过抑制肝脏葡萄糖生成发挥其主要作用，尽管在一些研究中已注意到葡萄糖处理的增强5,6尽管二甲双胍被广泛接受为糖尿病的一线治疗药物，但其作用机制尚不清楚。二甲双胍抑制线粒体呼吸复合物1，从而降低肝脏能量电荷；十年前，人们认为二甲双胍通过激活AMPK激酶发挥作用7–10最近，在利用缺乏AMPK或其上游激活酶LKB1的肝脏和原代肝细胞进行的实验中，这一点受到了挑战4由于糖原分解和糖异生在空腹状态下部分由胰高血糖素激素控制，而胰高血糖激素在T2DM中的异常分泌是高血糖病理生理学的主要因素，因此我们探讨了二甲双胍通过抑制胰高血糖原信号通路发挥作用的观点11–13.
胰高血糖素与肝细胞质膜上的受体结合，导致腺苷酸环化酶（AC）激活，产生第二信使环腺苷酸（cAMP），并刺激蛋白激酶A（PKA），蛋白激酶A磷酸化协同作用的蛋白靶点，以增加肝葡萄糖输出12我们在原代小鼠肝细胞中测试了一组化合物，这些化合物通过降低或模拟降低的能量电荷来激活AMPK，以抑制胰高血糖素依赖性的cAMP增加。所有药物治疗均增加了AMPK磷酸化，并拮抗了cAMP中胰高血糖素依赖性升高(补充图1a–b). Phenformin对胰高血糖素诱导的cAMP积累表现出剂量依赖性抑制作用，半数最大抑制浓度约为150μM，与细胞内AMP密切相关(). 为了更接近双胍类药物对糖尿病患者的慢性治疗，我们测试了肝细胞24小时暴露于苯乙双胍或二甲双胍以降低胰高血糖素增加的cAMP水平。长期治疗后，二甲双胍在浓度显著较低的情况下有效，浓度为10μM或更高，导致胰高血糖素刺激的cAMP水平显著降低(). 二甲双胍还抑制了浓度为125μM或更高的cAMP积聚，其水平略高于服用1 mg二甲双胍的糖尿病患者血清中的水平，但可能与内脏组织中的积聚水平相似()14,15在大鼠中，给予50 mg/kg的治疗剂量会导致肝脏中的水平大于250μM14,15与二甲双胍一样，二甲双胍的治疗浓度会显著增加原代肝细胞中的AMP水平(补充图2a–c). 胰高血糖素不会改变原代肝细胞中的腺嘌呤核苷酸水平或激活AMPK，也不会影响二甲双胍产生的变化(补充图2a–d).
双胍类化合物抑制cAMP生成答：。将原代肝细胞与指定浓度的二甲双胍孵育2小时，5 nM胰高血糖素孵育15分钟，裂解并分析细胞总cAMP和蛋白质。每个点N=4。B。将原代肝细胞与指定浓度的二甲双胍孵育2小时，然后用高氯酸和用HPLC定量的细胞核苷酸提取。每个点N=4。C–D。原代肝细胞与指定浓度的二甲双胍孵育(C类)或二甲双胍(天)24小时，用5 nM胰高血糖素处理，溶解并分析细胞总cAMP。每个点N=4。E.公司。将原代肝细胞与指定浓度的二甲双胍孵育2小时，用5 nM胰高血糖素处理，裂解，并测定PKA激酶活性。0μM和1000μM苯乙双胍组N=6，100μM和300μM苯乙双胍组N=4。F、。将原代肝细胞与二甲双胍孵育2小时，然后用胰高血糖素，用磷酸-PKA底物基序抗体、总和磷酸-PFKFB1抗体以及总和磷酸IP3R抗体通过western blot分析蛋白质。误差条表示标准误差。
为了确定二甲双胍对PKA活化动力学的影响，我们使用AKAR3 FRET报告子16。原代肝细胞被编码AKAR3的腺病毒感染，18小时后随着时间的推移获得共焦图像(补充图3a). 胰高血糖素在1分钟内增加了肝细胞细胞质中AKAR3的FRET比率（FRET/CFP），在2分钟达到最大值，之后仅在15分钟内表现出轻微的衰减。苯甲醛既延缓了PKA活性的上升，又加速了PKA的衰变(补充图3b). 生物化学测定的PKA活性抑制的浓度依赖性类似于阻断原代肝细胞中cAMP的积累(). AICAR是一种腺苷模拟物，可被磷酸化形成AMP模拟物ZMP，也可拮抗胰高血糖素依赖性增加的分离肝细胞PKA活性(补充图4a).
用二甲双胍处理原代肝细胞可抑制PKA底物基序处细胞蛋白的胰高血糖素依赖性磷酸化(). 使用针对这些蛋白的磷酸特异性抗体进行的Western blots显示，苯甲醛还拮抗PKA底物PFKFB1和IP3R的磷酸化(和补充图5a). 如果内源性cAMP水平的降低对双胍类药物的作用很重要，我们预计后者会阻止PKA靶蛋白的磷酸化，以响应胰高血糖素，而不是cAMP、SP-8br-cAMPS-AM的膜透性类似物。胰高血糖激素诱导原代肝细胞中PKA靶蛋白质PFKFB1、CREB和IP3R的磷酸化；二甲双胍激活AMPK并抑制这些PKA靶蛋白的磷酸化(和补充图6a). 相反，引起PKA底物类似磷酸化的SP-8br-cAMPS-AM浓度未被苯乙双胍拮抗(和补充图6b). 这些结果表明，苯乙双胍抑制胰高血糖素，但不抑制SP-8br-cAMPS-AM，依赖性磷酸化PKA底物，这与双胍在PKA激活上游的信号步骤工作最一致。胰高血糖素和SP-8Br-cAMPS-AM均增加了原代肝细胞的葡萄糖输出；然而，用治疗浓度的二甲双胍治疗肝细胞可以阻止胰高血糖素（而不是SP-8Br-cAMPS-AM）刺激的葡萄糖输出增加(). 值得注意的是，较高浓度的二甲双胍降低了基础葡萄糖以及胰高血糖素和SP-8Br-cAMPS-AM依赖的葡萄糖输出。如果双胍的主要作用是由cAMP的减少介导的，人们会认为该药物在PKA已经被抑制的细胞中无效。在过度表达无法结合cAMP的显性负PKA调节亚单位的肝细胞中，PKA活性是胰高血糖素刺激葡萄糖输出所必需的，而双胍并没有进一步降低葡萄糖输出率(补充图6c).
双胍类药物抑制胰高血糖素信号传导A–B类。原代肝细胞在65μM二甲双胍存在或不存在的情况下培养18小时，在指定浓度的胰高血糖素下培养15分钟(A类)或细胞渗透性PKA激动剂SP-8Br-cAMPS-AM(B类). 全磷酸化PFKFB1、CREB、IP3R和AMPK的蛋白质印迹分析。E.公司。用指定浓度的二甲双胍和1 nM胰高血糖素或3μM SP-8Br-cAMPS-AM处理细胞14小时，然后测量5小时的葡萄糖输出量。数据表示三个实验的平均值，每个实验N=6。误差条表示标准误差。
由于上述双胍类药物和其他药物在激活AMPK的同时降低cAMP，我们询问双胍的作用是否需要激酶。AMPK复合物催化α1和α2亚单位的floxed等位基因纯合子小鼠感染表达腺相关病毒Cre公司重组酶和western blots证实AMPKα蛋白缺失，AMPK底物乙酰辅酶A羧化酶（ACC）的二甲双胍依赖性磷酸化缺失(). 在缺乏任何可检测到的AMPK活性的肝细胞中，二甲双胍以与对照细胞中无法区分的方式阻断胰高血糖素依赖性cAMP的积累(). 在缺乏AMPK的情况下，AICAR也降低了cAMP(补充图4b). 这些数据表明，双胍对cAMP代谢的影响与AMPK无关。
双胍对cAMP生成的影响机制答：。
AMPKα1液氧/液氧/α2液氧/液氧小鼠感染AAV-TBG-GFP或AAV-TBC-Cre病毒，14天后分离原代肝细胞。用指定浓度的二甲双胍处理细胞2小时，然后用5 nM胰高血糖素处理15分钟。答：。通过western blot分析总细胞蛋白，以检测总和磷酸化T172 AMPK以及总和磷酸-S79 ACC。B。肝细胞被裂解，细胞总cAMP水平通过ELISA定量。所有点的N=4。C、。原代肝细胞与指定浓度的二甲双胍孵育2小时，50μM RO-20-1724（PDE4i）孵育最后30分钟。然后用5 nM胰高血糖素处理细胞15分钟，进行裂解，并测定细胞总cAMP。所有点的N=4。D。通过差速离心分离出原代肝细胞的膜部分，并用于在AMP和ATP浓度、100 nM胰高血糖素和100μM GTP存在的情况下测定腺苷酸环化酶活性。所有点N=6。误差条表示标准误差。
为了确定cAMP中胰高血糖素依赖性增加的减少是否是由cAMP磷酸二酯酶（PDE）的激活引起的，我们使用了PDE的药理抑制剂。如果抑制cAMP降解也不能抑制二甲双胍对cAMP的作用，这意味着作用部位不太可能是PDE。将胰高血糖素处理的肝细胞暴露于IBMX（一种非特异性PDE抑制剂）或Ro-20-1724（一种特异性PDE4类抑制剂），而不是西洛他胺（一种特殊的PDE3类抑制剂）cAMP水平增加，表明PDE4是这些细胞中主要的cAMP降解酶(补充图7a). 即使在IBMX或Ro-20-1724存在的情况下，二甲双胍也能抑制胰高血糖素刺激的cAMP积累(补充图7a). 此外，Ro-20-1724不影响肝细胞对二甲双胍的剂量反应性(). 为了进一步解析二甲双胍的作用位点，我们测量了其对福斯克林（forskolin）反应中cAMP积累的影响，福斯克林的结合和刺激不依赖于活化的Gα蛋白的腺苷酸环化酶。二甲双胍和AICAR都在相同程度上阻断了胰高血糖素和福斯科林对cAMP的积累，表明这些药物的作用不太可能是由于调节胰高血糖激素受体或G蛋白信号(补充图4c和7b).
由于二甲双胍在与其对AMP水平的影响密切相关的浓度下阻断了胰高血糖素诱导的cAMP生成，因此我们试图确定AMP是否能直接抑制腺苷酸环化酶，正如之前报道的那样17–20Forskolin和胰高血糖素在从小鼠原代肝细胞分离的细胞膜中刺激腺苷酸环化酶活性约四倍(补充图8a). 当ATP存在于160μM时，AMP抑制胰高血糖素刺激的腺苷酸环化酶活性，这代表了检测的典型条件，以及更高的生理浓度1.28 mM ATP(). 为了确定二甲双胍治疗小鼠肝脏中的AMP是否积累到足以抑制腺苷酸环化酶的水平，我们测量了禁食野生型小鼠的肝脏AMP。与最近的报告一致，我们发现喂食正常饮食的小鼠在二甲双胍治疗后AMP浓度为2.3 mM，并上升至2.9 mM(补充表1)21,22由于这些值似乎不符合生理学，我们还测量了原代肝细胞中的核苷酸(补充表2). 在未处理的细胞中，AMP浓度为215μM，这与Masson和Quistorff在灌注大鼠肝脏中报告的300μM的值密切相关，通过31核磁共振波谱23用二甲双胍治疗后，肝细胞中的AMP以剂量依赖性的方式上升到1 mM以上(补充表2).
为了测试双胍类药物对原代肝细胞中cAMP积累的影响是否具有体内代表性，我们检测了小鼠注射胰高血糖素后二甲双胍的作用。胰高血糖素迅速升高血糖，这一作用因二甲双胍预给药而减弱(). 二甲双胍灌胃小鼠后，AMPK和ACC磷酸化均增加，表明肝脏细胞能量电荷减少(补充图9a). 最重要的是，二甲双胍消除了随后肝cAMP、PKA活性和PKA底物磷酸化中胰高血糖素依赖性增加，表明体内双胍阻断了这一途径(). 为了评估二甲双胍对内源性胰高血糖素作用的影响，给禁食小鼠灌胃水或250 mg/kg二甲双胍，1小时后测定血糖并收集肝组织。这种剂量的二甲双胍导致血糖水平显著下降，肝脏AMP升高(补充图9b,补充表1)与肝脏cAMP含量的同时降低密切相关(). 接下来，我们测试了二甲双胍对喂食高脂肪饮食10周的糖尿病小鼠的影响。与喂食食物的动物相比，这些小鼠的空腹血糖水平和肝脏AMP升高(补充表1和补充图10a–b). 给禁食的HFD小鼠灌胃水或250 mg/kg二甲双胍，1小时后测定血糖并收集肝组织。二甲双胍显著降低血糖水平并升高肝脏AMP(补充图10c和补充表1). 重要的是，用二甲双胍治疗这些小鼠后，两种关键PKA靶蛋白PFKFB1和IP3R的磷酸化降低，AMPK磷酸化增加(和补充图10d). Akt磷酸化缺乏变化表明二甲双胍没有严重影响胰岛素反应性(补充图10d–e).
双胍类拮抗体内胰高血糖素信号答：。用500 mg/kg二甲双胍灌胃小鼠，1小时后腹腔注射200μg/kg胰高血糖素，并在指示时间N=6（水/pbs和二甲双胍/胰高血糖激素）、N=7（水/胰高糖素和二甲双酮/pbs）测量血糖水平。B–C类。喂食的小鼠禁食1小时，并用水或500毫克/千克体重的二甲双胍灌胃。一小时后，向小鼠腹腔内注射2 mg/kg胰高血糖素，五分钟后收集肝组织。对肝脏进行分析B。ELISA测定的总肝cAMP（每组N=3）和C、。肝脏PKA总活性（水/pbs、水/胰高血糖素、二甲双胍/pbs、二甲双酮/胰高糖素分别为N=7、8、6、7）。D–F。将禁食18小时的小鼠灌胃给水或250 mg/kg二甲双胍，1小时后收集肝组织，用高氯酸和全肝提取肝代谢物(D.）AMP和(E.）测定cAMP水平。水和二甲双胍组N=12和9。G–I。喂食高脂肪饮食10周的小鼠隔夜禁食，灌胃水或250 mg/kg二甲双胍，1小时后收集肝组织进行Western blot分析(G.）AMPK、，（高）PFKFB1和（一）IP3R。每组N=3。误差条表示标准误差。
了解二甲双胍药物降低肝葡萄糖输出量的机制是一个相当重要的问题。使用多种生化和细胞生物学方法，我们证实了早期关于双胍类化合物对cAMP影响的报道24–27此外，我们已经证明，正是通过细胞内AMP的升高，二甲双胍才能实质上消除胰高血糖素对腺苷酸环化酶的激活。这导致对维持肝葡萄糖输出至关重要的关键底物的磷酸化减少。近40年来，人们已经认识到含有腺嘌呤部分的分子与腺苷酸环化酶的“P位点”结合并抑制其活性17尽管内源性P位点配体已被认为是AMP，但这种调节事件的生理或药理学意义以前尚未被认识到17–20,28我们现在支持这样的观点，即二甲双胍的治疗水平会在肝细胞中引起轻微的能量应激，导致AMP浓度增加到能够直接抑制腺苷酸环化酶的水平。这些研究表明腺苷酸环化酶的P位点可能是胰岛素抵抗和T2DM治疗药物开发的新靶点。
扩展实验方法部分
试剂和材料
重组GlucaGen（Novo Nordisk）用于所有胰高血糖素研究。磷酸化酶激酶B抗体购自Acris Antibodies Inc.。PFKFB1总抗体购自Santa Cruz Biotechnology。兔抗PFKFB1磷酸化-S33抗体由Cell Signaling Technology，Inc.生产。所有其他抗体均购自Cell Signoaling Technical，Inc.。SP-8Br-cAMPS-AM购自AXXORA，LLC（加利福尼亚州圣地亚哥）。所有其他试剂均购自Sigma Aldrich。在宾夕法尼亚大学病毒载体核心（University of Pennsylvania Viral Vector Core）中，从肝脏特异性TBG启动子产生并纯化了表达PKA RIα亚基PKA-DN Rab突变体的腺相关病毒。
老鼠
小鼠被安置在一个设施中，进行12小时的光暗循环，可以自由获取食物和水。所有程序均由宾夕法尼亚大学动物护理和使用委员会审查和批准。用OneTouch超血糖分析仪测量血糖值。通过快速颈椎脱位或通过2,2,2-三溴乙醇麻醉检测核苷酸水平的研究将小鼠处死。肝脏样本被迅速取出并冷冻在预冷金属钳中，然后冷冻在液氮中。对于颈椎脱位或基于麻醉的方法，从肝脏缺血到冷冻组织的时间分别约为30秒或5秒。
原代肝细胞
使用改良的两步灌注法，使用肝脏灌注介质和肝脏消化缓冲液（Invitrogen）从小鼠中分离出原代肝细胞。细胞在M199培养基+10%FBS+Pen/Strep+1 nM胰岛素/100 nM T3/100 nM地塞米松中，用胶原I涂层的6孔或12孔板（每孔分别为200万或100万个细胞）进行培养。在附着3小时后，用新鲜培养基替换培养基，并将细胞培养过夜。在分离细胞后18-24小时进行实验。对于肝细胞的24小时治疗，在3小时附着期后添加化合物。
腺嘌呤核苷酸的定量
如前所述，从原代肝细胞中提取腺嘌呤核苷酸29为了定量肝脏核苷酸，从麻醉小鼠中采集样品并立即冷冻。称重约50 mg的肝脏，并用0.5 M高氯酸提取核苷酸。通过离心将不溶性材料制成颗粒，并用0.25体积的2M KOH、1M PO中和可溶性部分4pH值7.8。中和后的样品储存在−80°C下。高氯酸可溶物质在离子注入反相HPLC系统中通过等度洗脱分离（使用的缓冲液为200 mM KH2人事军官4pH 6.25，5 mM四丁基磷酸铵（TBAP），3%乙腈）。通过与在相同条件下分离的已知量的纯核苷酸的定量产生的标准曲线进行比较，计算AMP、ADP和ATP峰面积并将其转换为摩尔量。使用原代肝细胞的细胞体积将nmols/mg蛋白值转换为浓度22.
cAMP定量
根据制造商的替代裂解方案，使用cAMP ELISA试剂盒（GE Healthcare）检测cAMP。对于原代肝细胞，用250μL裂解缓冲液1B对12孔板中的细胞进行裂解，并对cAMP进行定量。肝脏样本。用ELISA测定cAMP，并将其归一化为肝脏总重量。
体外PKA分析
使用裂解缓冲液（1%Triton-X100，150 mM NaCl，20 mM PO）从原代肝细胞或肝脏中获得总可溶性裂解物4pH值7.4）。使用对PKI抑制敏感的PKA激酶检测试剂盒（Millipore），使用ATP-γ-P32检测PKA活性。
显微镜
将原代肝细胞接种在涂有I型胶原的盖玻片底部组织培养板上，并感染表达PKA FRET报告子AKAR3的腺病毒16.18小时后，将培养基更换为成像培养基（不含碳酸氢钠和酚红的M199培养基，补充20 mM HEPES pH 7.4），并使用蔡司共焦显微镜对细胞进行研究。以20秒的间隔获得FRET（442 nm激发/560 nm发射）、CFP（442 nm-激发/480 nm发射）和YFP（523 nm-激发/560 nm-发射）。将5 nM胰高血糖素作为500 uL 50 nM胰高糖素添加在预热的成像缓冲液中至2 mL培养基中。FRET比率（（FRET背景）/（CFP背景））取自细胞质和细胞核的随机片段，每个细胞有一个感兴趣的区域，每个条件有40多个感兴趣区域。比率标准化为采集时间的前4分钟。
葡萄糖输出分析
从禁食12小时的小鼠中分离出原代肝细胞，并在含有10%FBS的M199培养基中培养4小时。附着后，用无血清M199培养基替换培养基，其中含有100 nM地塞米松和100 nM T3以及指示药物。14小时后，用葡萄糖输出培养基（118 mM NaCl、4.7 mM KCl、1.2 mM MgSO）清洗细胞4，1.2 mM千赫2人事军官4，1.2 mM氯化钙2、20 mM NaCO3、25 mM HEPES pH 7.4和0.025%BSA），并在添加葡萄糖新生底物（20 mM乳酸、2 mM丙酮酸、10 mM谷氨酰胺）的新鲜葡萄糖输出培养基中测量5小时的葡萄糖输出。葡萄糖输出量归一化为总蛋白，并表示为未经处理的基础葡萄糖输出量的百分比。
腺苷酸环化酶分析
如前所述测量腺苷酸环化酶活性30从15 cm的原代肝细胞中获得膜制剂。用PBS清洗细胞，并用低渗缓冲液（10 mM Tris pH 7.4，5 mM EDTA）和10次冲洗均质器进行溶解。将未裂解的细胞和细胞核制成丸，并在3000×g下离心去除。上清液在12000×g下进行离心，制成丸膜，再悬浮在裂解缓冲液中，并在−80°C下冷冻。在不同ATP浓度下进行腺苷酸环化酶分析，示踪量为腺苷-5′-三磷酸[α-32P] （美国放射性标记化学品），最终分析条件如下：15 mM HEPES pH 7.4，200 mM NaCl，1 mM EGTA，10 mM MgCl2、1 mM IBMX、10 mM磷酸肌酸、60 U/mL肌酸激酶（Sigma-Aldrich）。在30°C下进行10分钟的分析，并加入等量的停药溶液（2%SDS、1 mM ATP、1 mM-cAMP、~ 2000 cpm-cAMP[2,8三H] （美国放射性标签化学品）。加入800mL水，并使用Dowex 50WX8-200（Sigma-Aldrich）和中性氧化铝（Sigma-Aldrich）柱通过色谱法纯化该溶液。产生的cAMP被测量为cAMP[32P] cAMP[2,8的恢复校正三H] ●●●●。在存在和不存在AMP的情况下，在与纯化的膜和AC测定缓冲液孵育之前和之后测定ATP的比活性（cpm/total ATP）。未观察到比活性或总ATP的显著降低(补充图8b-c).
统计分析
所有结果均表示为平均值±SEM。如果p<0.05，则通过非配对双尾学生t检验，所有两组比较均具有统计学意义。所有的体外研究要么是三个独立实验的汇编，要么是三个独立实验的代表。每个体内条件下使用的小鼠数量如图例所示
