Nat Protoc公司。作者手稿；PMC 2013年5月1日提供。
以最终编辑形式发布为：
预防性维修识别码：项目经理3571618
NIHMSID公司：美国国家卫生研究院429303
在化学定义的培养条件下，通过无酶分解实现人类多能干细胞的传代和菌落扩展
,1 ,2,三 ,4 ,1 ,4中，5 ,2,三，6和1,2
珍妮特·比尔斯
1马里兰州贝塞斯达国家心肺血液研究所分子医学中心；Magnuson临床中心10号楼，5N214；10中心医生。；贝塞斯达，马里兰州20892，美国
丹尼尔·古尔布兰森（Daniel R.Gulbranson）
2Morgridge研究所，威斯康星州麦迪逊；乌节街北330号。；威斯康星州麦迪逊53715；美国
三威斯康星州麦迪逊市威斯康星大学医学与公共卫生学院细胞与再生生物学系；大学大道1300号；威斯康星州麦迪逊53706；美国
妮可·乔治
4威斯康星州麦迪逊WiCell研究所；邮政信箱7365；威斯康星州麦迪逊53707；美国
劳伦·辛尼斯卡尔奇（Lauren I.Siniscalchi）
1马里兰州贝塞斯达国家心肺血液研究所分子医学中心；Magnuson临床中心10号楼，5N214；10中心博士。；贝塞斯达，马里兰州20892，美国
杰弗里·琼斯
4威斯康星州麦迪逊WiCell研究所；邮政信箱7365；威斯康星州麦迪逊53707；美国
5威斯康星大学医学与公共卫生学院妇产科，威斯康星州麦迪逊53706:美国
詹姆斯·汤姆森
2Morgridge研究所，威斯康星州麦迪逊；乌节街北330号。；威斯康星州麦迪逊53715；美国
三威斯康星州麦迪逊市威斯康星大学医学与公共卫生学院细胞与再生生物学系；大学大道1300号；威斯康星州麦迪逊53706；美国
6加州大学圣巴巴拉分校分子、细胞和发育生物学系；生命科学大厦3314室；加利福尼亚州圣巴巴拉，邮编93106；美国
陈国凯
1马里兰州贝塞斯达国家心肺血液研究所分子医学中心；Magnuson临床中心10号楼，5N214；10中心博士。；贝塞斯达，马里兰州20892，美国
2威斯康星州麦迪逊市莫格里奇研究所；乌节街北330号。；威斯康星州麦迪逊53715；美国
1马里兰州贝塞斯达国家心肺血液研究所分子医学中心；Magnuson临床中心10号楼，5N214；10中心医生。；贝塞斯达，马里兰州20892，美国
2威斯康星州麦迪逊市莫格里奇研究所；乌节街北330号。；威斯康星州麦迪逊53715；美国
三威斯康星州麦迪逊市威斯康星大学医学与公共卫生学院细胞与再生生物学系；大学大道1300号；威斯康星州麦迪逊53706；美国
4威斯康星州麦迪逊WiCell研究所；邮政信箱7365；威斯康星州麦迪逊53707；美国
5威斯康星大学医学与公共卫生学院妇产科，威斯康星州麦迪逊53706:美国
6加州大学圣巴巴拉分校分子、细胞和发育生物学系；生命科学大厦3314室；加利福尼亚州圣巴巴拉，邮编93106；美国
- 补充资料
方框1。
GUID:7B09A212-7B83-4E65-BE4F-D24F587168AB
图S1。
GUID:A549C280-3E0D-44A4-B1F9-57F9F3505003
图S2。
GUID:DF96863E-3DC7-4B6F-AC2B-3EE5730B87B0
图S3。
GUID:FDFE317F-F69A-447A-B97A-247C1DC11919
图S4。
GUID:2D69EF7E-1B6F-4FDC-A5F9-D04EB86F5C54
补充方法。
GUID:2834EFF3-06E4-438F-B45C-DC98FBCBCBAF
表S1。
GUID:137A9CDB-F8E6-4508-9D3C-424701E396
表S2。
GUID:C3D8EDED-72F0-4F7E-A48B-4A3F0E6BF189
摘要
本协议描述了一种基于EDTA的传代程序，该程序与化学定义的E8培养基一起使用，作为人类多能干细胞（iPSCs）基础和转化研究的工具。在该方案中，通过一个6孔或10厘米的细胞板大约需要6-7分钟。该无酶方案无需酶中和、离心或药物处理即可获得最大的细胞存活率。它还允许更高的吞吐量，需要最少的材料，并限制污染。在这里，我们描述了如何产生用于常规维护和重编程的一致E8培养基，以及如何将基于EDTA的传代程序纳入人类诱导的PSC（iPSC）衍生、菌落扩增、冷冻保存和畸胎瘤形成中。该方案已成功用于常规细胞扩增，并能有效扩增大容量培养物或大量优先分离PSC的细胞。该程序对所有培养阶段都有效，为在E8培养基中传代人类多能干细胞提供了一致和通用的方法。
关键词：细胞培养，人类胚胎干细胞，诱导多能干细胞细胞存活，细胞分离
介绍
人类胚胎干细胞（ESCs）的研究，第一个建立的人类PSC系1,2导致从人类体细胞衍生iPSCs三——5人类胚胎干细胞和诱导多能干细胞都能从所有三种生殖系中产生细胞，因此它们的实用价值和科学价值引起了人们极大的兴趣。在细胞培养中，两者都受到不同培养条件和细胞处理技术的影响。
人类胚胎干细胞和多能干细胞的细胞培养条件已经从依赖饲料和无饲料培养基演变为特定细胞外基质（ECM）上的特定培养基1,2,6——9提高对自我更新和分化的理解意味着生长介质和ECM正变得越来越明确和简化。同时，多单元处理技术也在发展，以促进PSC研究。然而，没有一种单一的技术可以用于培养的每个阶段，从扩张到分化和冷冻保存。
ESC分离
对于常规的细胞培养实践，细胞在传代过程中通常是个体化的，以实现均匀分布和均匀处理。然而，人类胚胎干细胞在个体化（即成为单细胞）后存活率很低，因为这些细胞对治疗更敏感，容易导致细胞死亡，这一事实使得通用分离方法的发展尤其具有挑战性。在常规实验中，分离方法是根据细胞存活率或敏感性来选择的。在常规扩张中，细胞存活是首要任务。ESCs和iPSCs通常以酶解聚集体的形式传代，胶原酶用于饲养细胞的培养1,2和Dispase用于无饲料细胞培养8机械方法，如细胞刮片和其他传代工具，也已被开发用于将细胞分离为聚集物。此外，在分化或转染实验中，TryPLE和Accutase可用于使ESCs个体化，但生存率低往往导致异常核型10,11,12; 在这个过程中，必须使用诸如Rho相关蛋白激酶（ROCK）抑制剂等小分子化学物质来提高细胞存活率13所有这些方法都需要专门的工具或试剂，这些工具或试剂对于长期或大规模实验来说成本高昂。同时，酶法的一致性通常受到不同批次酶的质量的影响。鉴于这些方法的多样性，我们非常希望找到一种适用于所有目的的通用方法。
培养条件的质量对PSC的维护和扩展也至关重要。与饲养细胞或动物产品相关的培养基成分通常会极大地影响细胞培养的一致性，当细胞在翻译研究中具有潜在应用时，这可能会更成问题。为了提高细胞培养的一致性，我们系统地分析了单个培养基成分的功能，并最终制定了一种无异种、化学定义的干细胞培养基E8，它包含人类ESCs的八个基本因子14在E8的最小修饰的情况下，人iPSC可以在化学定义的条件下从皮肤活检中直接衍生。该培养体系在未来的PSC研究中有很大的应用前景。随着细胞培养基的发展，一致的无异种解离方法对于实现规定培养条件的潜力非常重要。
我们之前研究了个体化后的细胞死亡机制，发现肌球蛋白-肌动蛋白依赖性收缩导致细胞死亡，细胞间粘附通过抑制收缩促进生存15细胞在分离后的最初几个小时内通过重组小聚集体存活。这一观察结果为一种方法提供了理论基础，该方法产生的聚集物强度足以生存，但体积小到可以被生长因子或转染试剂访问。结合化学定义细胞培养的发展，我们着手设计一种通用的分离技术，用于在特定条件下人类PSC的扩增、冷冻保存和实验。我们发现，经过特定EDTA处理后，细胞可以部分解离，生成存活的小聚集体，以及经置换处理的细胞，这些细胞更容易接受各种处理。当与化学定义的E8介质一起使用时，这种分离方法可用于在衍生、膨胀和保存期间处理人类PSC。在本方案中，我们描述了如何从成纤维细胞中获得iPSC，作为如何在iPSC衍生过程的每个阶段使用我们的EDTA分离方法和定义的化学培养条件的示例。
协议的制定
传统上，人类PSC是以含有酶的聚集体形式传代的，个体化细胞通常会因肌动球蛋白收缩而死亡。然而，个体化细胞可以通过抑制ROCK-肌动蛋白-肌球蛋白途径成分而存活。或者，细胞可以通过相邻细胞的重新聚集而自然存活，这表明较高的局部密度可能导致不依赖药物治疗的再结合效率(). 我们发现EDTA处理可以部分分离人类ESC，并且ESC很容易被培养基洗掉(补充图1a). 细胞之间的松散粘附产生了非常高的局部密度，有利于细胞存活。大多数细胞呈小聚集体，在几分钟（5分钟）内附着在Matrigel涂层板上，在2小时内扩散，并以菌落形式存活（24小时；). 通过TryPLE，EDTA游离的ESCs比个体化细胞存活率高，存活效率与使用Dispase协议将细胞作为大聚集体进行传代相似(和补充方法). 使用此EDTA方法时的细胞存活率与使用ROCK抑制剂处理的细胞的存活率相当(补充图1b)，并且依赖于E-钙粘蛋白(补充图1c). 这表明EDTA采集的细胞不需要药物治疗就能存活，但需要直接的细胞间粘附。
EDTA解离是多能干细胞传代的有效方法a） 通过不同方法总结细胞存活效率。解离后，酶/机械生成的大聚集体有效存活；个体化细胞在克隆密度下死亡，但在抑制剂或高负载密度下存活；EDTA生成的小聚集体通过高局部密度而有效存活，无需药物治疗。b） 电镀后人类ESC菌落形态。H1细胞与EDTA部分分离，在几分钟内附着在平板上，在2小时内扩散，并作为菌落存活（24小时）。比例尺，50μm。c） 比较不同传代方法的细胞存活率。细胞通过TrypLE、EDTA或Dispase分离并添加到Matrigel涂层板上；接下来，在24小时后对活细胞进行计数。星号（*）表示EDTA的存活率有显著差异(P（P）< 0.05,n个=3）在24小时时从TrypLE。
由于EDTA解离的存活效率，我们已将其广泛用于人类PSC的长期培养扩展，在不同的无饲料培养基（包括TeSR和E8）中培养50多个不同的人类ESC和iPSCs。在这些病例中，长期培养都能有效地保持正常核型。我们研究中最长的iPSC培养持续51代以上，持续时间超过6个月，细胞保持正常核型(补充表1列出了这些ESC和iPSC线路中的一些）。EDTA解离的细胞不仅能在基质和卵磷脂表面有效存活，而且能在不依赖ROCK抑制剂的合成表面有效存活(补充图1d). 由于其简单性和一致性，该协议已用于我们的常规细胞培养实践14——17，和其他组已成功利用EDTA分离来维持人类PSC18.
EDTA分离在转染和分化实验中也很有用(补充图2和补充方法). 在转染实验中，EDTA分离细胞被高效转染，同时保持较高的存活率(补充图2a–c). 同时，这些细胞对生长因子诱导的分化敏感(补充图2d). 我们假设EDTA解离使小聚集体比个体化细胞存活得更好，并且与使用酶（如Dispase）收集的传统聚集体相比，使用这种方法更容易获得分化实验中使用的试剂。EDTA方法也可用于收集PSC，以在免疫缺陷小鼠中有效形成畸胎瘤。EDTA分离已成功用于人类PSC的所有培养阶段。
EDTA分离也可以改善PSC与分化细胞混合的处理。在重编程实验中，iPSC菌落被机械分离以进行菌落扩展，在此过程中，它们经常被未编程的体细胞污染。传统上，菌落采摘是用来富集干细胞的，但这种方法容易受到细菌和真菌的污染，并且在涉及太多细胞系时不实用。结合E8培养基和EDTA解离方法的优点，我们能够避免污染。首先，定义的E8培养基允许干细胞比成纤维细胞生长更快，需要额外的因素，如氢化可的松。即使没有菌落分离，PSC也可能在几代内以较高的传代效率生长出体细胞。其次，我们发现PSC对EDTA的反应与体细胞（如成纤维细胞）不同。EDTA治疗优先收获ESC菌落，将大多数成纤维细胞留在原始培养板上(补充图3a、b). 相比之下，TrypLE普遍解离ESCs和成纤维细胞。
这些观察结果使我们使用EDTA分离进行iPSC衍生和菌落扩展，这需要人类PSC和体细胞。在传统的iPSC衍生程序中，细胞通常作为单个细胞进行传代，在挑选单个菌落之前，ROCK抑制剂可以提高iPSC的存活率。然而，我们使用了EDTA差异解离，并在没有ROCK抑制剂的帮助下获得了高存活率的iPSC(补充图3c)；我们发现大多数EDTA分离细胞表达干细胞标记物SSEA-4(补充图3d). 因此，EDTA的分离能够在过度拥挤的重编程培养基中富集潜在的多能干细胞，在该培养基中需要二次传代。我们还使用EDTA分离来扩大分离的iPSC菌落。我们经常将分化细胞留在原始培养板中，发现干细胞在一到两次传代中达到了高纯度。此外，在基于EDTA的细胞扩增中，我们常规保持已建立的ESC和iPSC系的高纯度（即，>95%的人群对干细胞标记物Oct4呈阳性），而不通过人工挑选进行富集。EDTA传代产生的小聚集体很容易获得生长因子，这可能会抑制自发分化，并且差异解离可以在每次传代后使干细胞富集，同时留下一些分化细胞。
除了优先解离外，EDTA传代还有另一个优点：它是一个快速的过程，污染的机会最小。该程序可以在生物安全柜中进行，不需要酶中和和离心。因此，我们能够在15分钟内通过24条单独的管线，而污染风险最小。此外，由于EDTA处理不会损坏ECM，分离后的一部分iPSC可以保留在原始井中，为维护或进一步表征提供备用或复制板。
实验设计
E8中等产量
本方案描述了如何生产化学定义的干细胞培养基E8，其配方列于和为了保持细胞培养的一致性，我们建议每次制作大量培养基，将其储存在冰箱中，并在实际实验中使用培养基之前进行批量测试。首先根据（另请参见补充表2). 全E8培养基可以用额外的自我更新要素制备(). 也可以使用下列试剂小规模制备培养基和.
表1
| 试剂 | 股票 | 1升培养基所需量 | 50升介质所需量 | 最终浓度 | 来源 |
|---|
| DMEM-F12型 | | 1升 | 50升 | | Gibco猫。编号11330-032 |
| L-抗坏血酸 | | 64毫克 | 3200毫克 | 64毫克/升 | 西格玛猫。编号A8960 |
| 亚硒酸钠 | 0.7毫克/毫升 | 19.4μl | 970微升 | 13.6微克/升 | 西格玛猫。编号S5261 |
| HCl或NaOH | 将pH值调节至7.4 | | | | |
| 氯化钠 | | 1克 | 50克 | | 西格玛猫。编号S5886 |
表2
| 试剂 | E8（转化生长因子-β1） | 重新编程1 | 重新编程2 | 最终浓度 |
|---|
| E8基培养基 | 500毫升 | 500毫升 | 500毫升 | |
| 全息转铁蛋白 | 500微升 | 500微升 | 500微升 | 每毫升10微克 |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | 500微升 | 500微升 | 500微升 | 每毫升100纳克 |
| 转化生长因子-β1 | 500微升 | --- | --- | 1.74纳克/毫升 |
| 胰岛素 | 1毫升 | 1毫升 | 1毫升 | 20微克/毫升 |
| 氢化可的松 | --- | 50微升 | --- | 1微米 |
| 丁酸钠 | --- | | 500微升 | 100微米 |
EDTA解离常规细胞培养扩增
当E8培养基准备好后，我们用H1 ESCs和一个对照成纤维细胞iPSC系对其进行测试。用EDTA分离法传代细胞至少五代，然后用流式细胞仪和核型分析细胞。E8培养基通过测试后，冷冻后的原液可用于常规细胞培养扩增和其他实验。我们发现，当我们使用EDTA传代方法和E8培养基时，OCT4阳性细胞始终占总人口的95%以上。
从成纤维细胞衍生人iPSCs
E8组分通过质量测试后，使用一套基于E8的培养基对人类皮肤成纤维细胞进行重新编程。转导后，细胞首先在基于E8的重组培养基1中培养，然后在重组培养基2中培养(). 我们通常在六孔板上进行重编程实验，以便在同一实验中对细胞进行多次处理(). 丁酸钠处理通常用于提高重编程效率。
在化学定义的培养基中从人成纤维细胞衍生iPSCa） 在基于EDTA/E8的iPSC衍生程序中，EDTA是大多数细胞培养阶段所必需的主要处理方法。相比之下，传统程序使用多重分离方法(补充图4a). b） 本协议中所述步骤的简要总结。c） iPSC衍生过程中的细胞形态变化。比例尺，40μm。d） 成纤维细胞衍生iPSCs多能性标记的FACS分析。细胞在规定的培养基中衍生，然后用EDTA法扩增。IgG控制：未填充峰值；FITC-结合抗体：绿色峰。抗体：OCT4-Alexa-488（Millipore，目录号FCMAB113A4）；SSEA4-FITC（生物传奇，猫号330410）；Tra1-60-FITC（Millipore，目录号FCMAB115F）；msIGg-FITC和非免疫控制（Millipore，目录号MABC006F）。e） 来自成纤维细胞的iPSCs上多能性标记物的免疫染色。左，相位对比图像；右，荧光图像。比例尺，20μm。抗体：OCT4-Alexa-488（Millipore，目录号FCMAB113A4）；SSEA4-FITC（生物传奇，目录号330410）；Tra1-60-PE（Biolegend，目录号330610）。
重编程细胞通常在转导后3-5天左右出现，菌落在转导后20-30天成熟。在此期间，细胞通常需要传代以避免过度融合，这可能会抑制真正的iPSC集落的出现。EDTA方法用于在重编程细胞出现后分离细胞，重编程细胞优先富集潜在的iPSC。
该程序已成功用于慢病毒、仙台病毒和基于DNA的上位体重编程。为了简单起见，我们在该方案中使用了市售的STEMCCA多顺反子慢病毒。该程序也可以修改，以重新编程人类脐静脉内皮细胞（HUVEC）和脂肪细胞。
人类iPSCs的菌落扩展和保存
当多能干细胞成熟时，单个菌落被机械隔离到24孔板中进行菌落扩展。随后用EDTA方法扩增细胞，并可在3-5天内冷冻保存。细胞可扩增，并应通过碱性磷酸酶染色（APS）和其他适当的特征进行表征。通过核型分析和免疫染色对多能性标记进行进一步确认后，经验证的iPSC系可用于EDTA法的畸胎瘤形成。
材料
试剂
细胞
人类ESCs:H1细胞，WA01（美国国立卫生研究院（NIH），人类ESC注册号0043）
来自成纤维细胞的人iPSC:ND1（NIH对照iPSC株）
人包皮成纤维细胞：CCD-1079Sk（ATCC分类号CRL-2097）
SCID米色小鼠（仅畸胎瘤可选，步骤28C；Taconic猫，编号CBSCBG-F）
人类STEMCCA Cre-Excisable组成性多顺反子（OKSM）慢病毒重组试剂盒（Millipore cat.no.SCR545）
氯化钠（Sigma S5886或同等产品）
氯化钠（NaCl、Sigma、分类号S5886或同等产品）
DMSO（Sigma，目录号D4540或同等产品）
Matrigel，生长因子减少（BD Biosciences，目录号354230）
岩石抑制剂Y-27623（Tocris，目录号1254）
Holo-transferrin（Sigma，目录号T0665或等效物）
重组人成纤维细胞生长因子（FGF，Peprotech，目录号100-18B或等效物）
重组人转化生长因子（TGF-β1，研发系统，分类号240-B/CF）
人胰岛素，10 mg/mL溶液（Sigma，目录号I9278-5ML）
氢化可的松（西格玛，目录号H-0396）
丁酸钠（西格玛，目录号303410）
Dulbecco的无钙无镁PBS（Invitrogen，产品目录号14190-250或同等产品）
E8媒体组件(——)
重新编程媒体组件(——)
表3
| 步骤 | 问题 | 可能的原因 | 解决 |
|---|
| 5 | 殖民地不会消失 | 移液太轻 | 用强力动作一次冲洗掉大部分细胞。 |
| | 治疗不足 | 延长治疗时间 |
| EDTA处理过程中菌落脱落过多 | 治疗时间过长 | 缩短处理时间或跳过一个清洗步骤。 |
| | 更换缓冲器时板受到过多干扰 | 治疗期间，不要摇晃或旋转盘子。 |
| | | 细胞可以用E8培养基中和和收集。旋转并电镀，或直接电镀悬浮液并在1小时后再次更换介质 |
| 8 | 细胞存活率低 | 细胞传代不够频繁 | 细胞需要每隔4天传代一次。如果培养超过5天，则添加ROCK抑制剂 |
| | 细胞过度融合 | 当细胞达到80%汇合时通过细胞。可以添加ROCK抑制剂以帮助存活。 |
| | 移液过多 | 不要重复用吸管吸取细胞。经过充分处理后，细胞很容易从平板上洗掉。 |
| | 过度治疗导致单个细胞过多 | 缩短处理时间或跳过一个清洗步骤。 |
| | EDTA浓度过高 | 将EDTA浓度从5降至0.5–2 mM。 |
| 9 | 多能性标记表达不良 | 试剂质量 | 中所列试剂的批量测试. |
| 17 | 假定iPSC不会从板上脱落 | 汇流板需要更多EDTA来去除钙 | 增加EDTA处理时间或增加更多清洗步骤。 |
| | | 如果iPSC菌落罕见，则瞄准潜在的
专门去除iPSC菌落
iPSC。 |
| 细胞存活率低 | 细胞过度融合 | 添加岩石抑制剂。 |
| 26 | 无附加菌落 | 殖民地太大了 | 收获前将菌落切成小块。 |
| | 非iPSC形态 | 采集的菌落可能不是iPSC菌落，改进iPSC鉴定 |
| 27 | 生存率低 | 细胞过度融合 | 添加岩石抑制剂 |
| | | 将培养物移至缺氧状态（5%O2) |
表4
| 方法 | 流离失所 | 胰蛋白酶/淀粉酶 | 乙二胺四乙酸 |
|---|
| 细胞存活 | 很好 | 可怜的 | 很好 |
| 岩石抑制剂处理 | 不 | 基本 | 不需要 |
| 酶的清洗或中和 | 是的 | 是的 | 不 |
| 离心 | 不 | 是的 | 不 |
| 一个六孔板所需的时间 | 7-10分钟 | 10-15分钟 | 5-6分钟 |
| 细胞外基质或膜蛋白损伤 | 是的 | 是的 | 不 |
| 对不同镀层材料的依赖性14 | 不适用 | 高 | 低 |
| 可转染 | 效率较低 | 高效 | 高效 |
| 差异化 | 不太敏感 | 敏感 | 敏感 |
| 低温保存 | 很好19 | 适用于岩石抑制剂20 | 良好，岩石抑制剂可选 |
| 干细胞富集 | 不 | 不 | 是的 |
| 批次一致性 | 可怜的 | 很好 | 很好 |
| 畸胎瘤形成 | 很好 | 可怜的 | 很好 |
| 来源 | 商业 | 商业 | 自制的 |
| 成本 | 高 | 高 | 低 |
聚brene（Sigma，产品目录号H9268）
TrypLE（Invitrogen，目录号12563）
BCIP/NBT碱性磷酸酶底物试剂盒IV（Vector Laboratories，目录号SK-5400）
三氯化氢，100 mM，pH 9.5
EDTA，0.5M，pH8.0储备溶液（K&D Medical分类号RGF-3130或同等产品）
人血清白蛋白（HSA，0.05%（wt/vol）；西格玛猫。编号A6608；参见试剂设置）
PBS中HCl中的HSA（0.05%（wt/vol）；西格玛猫。编号A6608；参见试剂设置）
液态氮
乙醇
Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）-F1
亚硒酸钠
L-抗坏血酸
氢氧化钠
设备
真空层流罩
离心机（Beckman Coulter Allegra X15-R，带SX4750摆动式铲斗转子或同等产品）
细胞培养培养箱（37°C，95%湿度，5%CO2和5%O2atmosphere、Heracell、Thermo Scientific）
倒置相差显微镜（x4和x10物镜、蔡司或同等产品）
冷冻柜−80°C（热科学）
水通道，37°C异丙醇细胞冷冻容器
冷冻液，1.2 ml（美国科学公司，目录号1412-9100或同等产品）
Six-well Nunclon Delta表面组织培养皿（Thermo Scientific产品目录号140675或同等产品）
P1000移液管和带过滤器的无菌尖端
吸管辅助和无菌5毫升和10毫升一次性塑料吸管
无菌过滤装置，500 ml（Millipore，Stericup，分类号SCGPU05RE）
锥形管，15和50 ml（Falcon，产品目录号352097和352098或同等产品）
Eppendorf管
仪表指针（20.5）
试剂设置
EDTA解离液
向500 ml无钙/无镁PBS中添加500μl 0.5 M EDTA（pH 8.0）储备液。添加0.9g NaCl并将渗透压调节至340 mOsm。通过过滤对溶液进行消毒，并将其储存在4°C下长达6个月。
关键：为了使细胞在分离过程中受到的干扰最小，EDTA溶液的渗透压设计为与E8培养基的渗透压相同。
岩石抑制剂
Y-27632是最常用的岩石抑制剂，可溶解于H2O或DMSO。将Y-27632溶解在无菌H中2O或最终浓度为10 mM（1000x）的无菌二甲基亚砜，然后等分并储存在−80°C下。该溶液至少稳定一年。
关键：在EDTA协议中，ROCK抑制剂不像酶协议中那样重要。在iPSC线路的日常维护中，ROCK抑制剂处理是可选的。然而，如果干细胞培养物过于融合，或者没有传代4天或更长时间，ROCK抑制剂可以大大提高细胞存活率。如果大多数细胞是个体化的，建议使用ROCK抑制剂治疗。
全息转铁蛋白（1000倍）
将500 mg Holo-transferrin溶于50 mL Dulbecco的PBS中，过滤消毒。这就形成了1000倍（10 mg/ml）的储备，可分为500μl等分样品，并在−80°C下冷冻，在该温度下可稳定至少1年。
FGF（1000倍）
应将一毫克FGF溶解在10 mL无菌0.05%HSA PBS中。这1000倍FGF（0.1 mg/mL）应分为500μl等份，并在−80°C下冷冻，在该温度下至少稳定一年。
转化生长因子-β1（1000倍）
TGFβ1应在无菌0.05%HSA和4 mM HCl中的PBS中再次悬浮至1.74μg/ml（1000x）的浓度。然后将其等分为500μl等分样品，并在−80°C下冷冻；在这种温度下至少可以稳定一年。
氢化可的松（10000倍）
将3.625 mg氢化可的松溶于1 ml无菌水（10mM储备液）中。然后将该溶液分为50-μl等分溶液，并在−80°C下冷冻；在这种温度下至少可以稳定一年。
丁酸钠（1000倍）
将110 mg丁酸钠溶于10 ml无菌水中并过滤（100 mM储备）。然后将其分为500-μl等分样品，并在−80°C下冷冻；在这种温度下至少可以稳定一年。
超低温保存介质（2x）
向8 ml E8培养基中添加2 ml无菌DMSO和20μl 10 mM ROCK抑制剂储备，以制备2倍的iPSCs冻存培养基，用于菌落扩展。介质可在4°C下储存最多1周。
聚乙烯原料（1000倍）
将聚合物在PBS中溶解至1000x（6μg/ml），过滤消毒。在−80°C下将溶液冷冻在小份中，并在使用前保存一年。感染期间细胞的最终浓度为6 ng/ml。
E8基培养基
将50升DMEM-F12培养基倒入合适的容器中，并在搅拌板上搅拌。保存空瓶子。向培养基中添加3200 mg L-抗坏血酸和970μL亚硒酸钠（0.7 mg/ml储备液），并充分混合。用10 N氢氧化钠将pH调节至7.4。添加NaCl，将渗透压调节至340 mOsm。将培养基等分回原装瓶中。培养基的最终成分应包含64 mg/l l-抗坏血酸和13.6μg/l亚硒酸钠。有关如何制作这种介质的详细信息，请参见.该碱性E8培养基应冷冻并储存在−20°C下，在此温度下至少稳定一年。
全E8（TGFβ1）培养基
解冻一瓶（500 ml）E8碱性培养基。添加500μl 1000x全转铁蛋白、500μl 1000 x FGF、500μl 1000 x TGFβ1和1 ml 10 mg/ml胰岛素。通过500-ml Millipore Stericup过滤器过滤E8（TGFβ1）培养基。使用前将介质储存在4°C的温度下。培养基在4°C下稳定2–3周。使用前不要在37°C水浴中加热该培养基，因为它会缩短生长因子的使用寿命。请注意，现在可以从Life Technologies（目录号A14666SA）或干细胞技术（目录号05840）购买完整的E8培养基作为Essential 8培养基。有关如何制作这种介质的详细信息，请参见.
警告：这些购买的培养基仅用于干细胞维护。它们含有TGF-β1，可以干扰重编程。
重新编程媒体1和2
制备500 ml与Full E8培养基配方相同的重编程培养基，但保留TGF-β1。在过滤之前，添加50μl 10000s氢化可的松（重编程培养基1）或500μl 1000x丁酸钠（重编程介质2）代替TGF-β1。
有关如何制作这些媒体的详细信息，请参见。介质可在4°C下储存最多2周。
PBS中的HSA
将25mg HAS加入50ml PBS中，过滤消毒。在4°C下储存1-2个月，或制作小份，在−20°C下保存1年。
HCl-PBS中的HAS
将25 mg HAS溶于50 ml 4 mM HCl PBS中，过滤消毒。在4°C下储存1-2个月，或制作小份，在−20°C下保存1年。
程序
步骤1-9：人PSC在全E8培养基（TGF-β1培养基）中用EDTA扩增
计时，每块板6-7分钟
1|
放置涂有Matrigel的新六孔板(方框1)并在组织培养罩中加热至室温（RT，20–25°C）。此外，保持EDTA溶液准备就绪，并将其加热至室温。 2|
在新的Matrigel-coated板上贴上标签，并从井中抽出Matrigel。每口井更换1.5–2 ml全E8培养基（或E8培养液+岩石抑制剂，如果需要）。关键步骤：这一步骤也可以在EDTA孵育期间进行，但如果大量细胞通过，由于时间有限，最好提前准备平板。
3|
从即将分割的ESC或iPSC吸入介质。用每孔1 ml EDTA溶液冲洗孔，以去除培养基中的镁和钙。关键步骤：冲洗时，将EDTA溶液添加到微孔中，然后立即再次抽吸EDTA而不进行培养。关键步骤：用EDTA清洗时，将EDTA缓慢添加到井壁上，以避免菌落过早地从平板上洗掉。
4|
再次重复EDTA清洗（如步骤3所述），以确保去除所有镁和钙。每孔再加入1毫升EDTA溶液，在室温下放置2–5分钟。关键步骤：细胞在EDTA中停留的时间越长，产生的菌落越小。此外，重要的是要将培养皿的移动保持在最低限度，以避免在这一步骤中菌落完全脱离培养皿。
5|
2-5分钟后，小心地从细胞中吸取EDTA溶液。使用1–4 ml E8培养基（或E8培养液+ROCK抑制剂）并快速添加，以将菌落从平板上洗掉，并尽快分散菌落。培养基中的钙和镁将中和任何剩余的EDTA。关键步骤：不要用过多的移液管将菌落过度分离。关键步骤：这一步和下一步应该迅速进行，因为菌落在添加钙和镁后会很快重新附着到平板上。
6|
确保细胞悬浮液充分混合，然后在新制备的平板中每孔板上所需的细胞量。
7|
前后左右摇晃培养板，使细胞分布均匀。将盘子放在培养箱中。让它整夜保持最大程度的依恋。
8|
第二天，从4°C冰箱中取出E8培养基，如果需要，让它在室温下加热。从细胞中取出培养基，并向六孔板中的每个孔中添加2 ml E8培养基。
9|
第二天，重复步骤8，每天监测细胞，当汇流达到约80%时，重复步骤1-7（通常在播种后的3至5天内）。使单元格通过所需的通道数。五次传代后，我们建议收集一些细胞用于FACS，以测量多能性标记和进行核型分析。如果FACS和核型分析结果令人满意，那么培养基组件适合iPSC的维护和重新编程。这种无酶传代协议可用于从其他细胞类型衍生iPS细胞。准备好重新编程后，继续下一节。
步骤12-18：在基质上培养转导的成纤维细胞
时间：3-4周
12|
还是在同一天，用TrypLE传代重组细胞。与常规胰蛋白酶-EDTA相比，胰蛋白酶分离能更好地保存细胞，并且不需要基于血清的中和作用。为此，从细胞中取出培养基，并向微孔中添加0.5 ml TrypLE。在培养箱中培养5分钟，然后用成纤维细胞培养基将细胞从培养板上清洗到离心管中，并用成纤维培养基将其稀释五倍，以灭活TrypLE。关键步骤：一些细胞系在TrypLE中不能很好地从培养皿中分离出来。有了这些线条，您可能需要在添加TrypLE之前用EDTA将盘子洗两次。
13|
在200的RT下将细胞向下旋转5分钟克在摆动桶转子中，将其重新悬浮在24ml成纤维细胞培养基中。从两个六孔板中取出Matrigel/DMEM-F12，并在每个孔中添加2 ml细胞。这使一孔感染细胞最后通过成纤维细胞培养基，进入两个涂有Matrigel的六孔板，或直接进入重编程培养基1。
14|
将细胞保存在重编程培养基1中，每隔一天更换培养基3-5天。
15|
取出介质并用重新编程介质2替换。为了提高重编程效率，在一个平板上向培养基2中添加100μM丁酸钠。关键步骤：将重编程介质1替换为2的时间基于单元汇流。培养基1起到促进成纤维细胞生长的作用，当汇合达到约20–30%时，应切换到培养基2。如果细胞仍然非常稀疏，您可能需要将其保存在重编程介质1中几天。
16|
继续每隔一天更换培养基，使用含或不含丁酸钠的重新编程培养基2。
17个|
每天监测细胞，如果在等待iPSC菌落成熟时细胞过于融合，可能需要在2周内的某个时间用EDTA传代细胞。选择三个或四个孔，用EDTA穿过两个新的Matrigel涂层板（比例为1:3）。使用上述步骤1–7中所述的EDTA传代方法，但使用重编程培养基2代替完整的E8（TGF-β1）培养基。
18|
转导后20至25天，菌落应准备好采摘。此时，转至步骤19。大约在这个时候，开始每天给原来的重编程板注入全E8（TGF-β1）培养基。
步骤19-27：机械分离人iPSc菌落
时间：2–3天
19个|
为了进行挑选，用Matrigel涂层准备一个24孔板（如方框1，每孔使用250 ul Matrigel储备液，每24孔板总共使用1 mg Matrigel）。 20|
在Matrigel培养30分钟后，用含有1x岩石抑制剂的完整E8（TGF-β1）培养基替换Matrigel/DMEM-F12。关键步骤：虽然岩石抑制剂在EDTA传代方法中被描述为可选，但岩石抑制剂将大大增加新采集菌落的存活机会。
21|
将70%（vol/vol）乙醇喷洒在显微镜和周围区域，以及吸管和针头盒上。关键步骤：我们用普通的倒光显微镜在实验室的工作台上挑选菌落。如果空间允许，可以将显微镜放在层流罩或台式PCR清洁罩内，以便在采集菌落时有一个无菌区域。如果愿意，可以使用解剖显微镜寻找菌落并手动通过。
22个|
戴口罩时，用x4物镜在显微镜下寻找iPSC菌落。使用带有尖端的P20移液管，围绕菌落旋转，直到菌落从周围的细胞中松开。
23|
在仍然使用吸液管尖端的同时，交叉填充菌落，使其以较小的碎片离开培养皿。
24|
接下来，用移液管将菌落推出培养皿，并将其吸入移液管尖端。将菌落块转移到24孔板的一个孔中。
25|
对其他菌落重复步骤22–24，将一个菌落放在24孔板的每个孔中。在组织培养箱中培养细胞过夜。
26|
采摘后第二天，取出培养基，用不含岩石抑制剂的完整E8（TGF-β1）培养基替换。
27|
每天更换E8培养基，直到附着的菌落足够大可以通过。菌落通常在2-3天后即可传代。
A） 人iPSC菌落的冷冻保存和回收
定时，每条线6-10分钟
按照步骤1-7所述，在冷冻保存前2-3天以1:4的比例分裂细胞。
当细胞达到约70–80%的汇合时，用EDTA方法分离细胞（如步骤3和4所述）。
2-5分钟后，从细胞中小心吸取EDTA溶液，并在六孔板的每孔中快速添加1 ml完整的E8培养基。
以滴状方式，向EDTA收集的细胞悬浮液中添加等量（1 ml）的2x低温保存培养基（全E8培养基中20%（vol/vol）DMSO），以获得最终浓度为10%（vol/vol）的DMSO。
将250–500 ul细胞等分放入每个标记的冷冻管中。对于六孔板上的一个孔，有70-80%的汇流，可以冷冻四到八个小瓶。在早期重新编程期间，如果iPSC更稀疏，则更常见的做法是从一个孔中冷冻两瓶。
在−80°C的异丙醇冷冻容器中冷冻细胞至少2小时。
将细胞转移到液氮中长期保存。
暂停点：细胞可以在液氮中储存5年以上。
要解冻细胞，请将冷冻管从液氮罐中取出，直接置于37°C水浴中。
用管子轻轻搅拌水，并仔细检查冰是否消失。
当只有一个小冰粒漂浮时，用70%（vol/vol）乙醇彻底喷洒小瓶，并将试管转移到生物安全柜中。
将细胞转移到15-ml锥形管中
滴加10 ml E8培养基，同时在试管中连续混合溶液。
在200℃下离心细胞克在4°C下保持5分钟
仔细抽吸上清液，并使用E8培养基重新悬浮细胞。将细胞板放入Matrigel涂层六孔板的一到三个孔中。如果需要，电镀时可以在E8介质中添加岩石抑制剂。
B） APS染色
计时1–2小时
当通过EDTA方法传代菌落时（步骤1–7），取一小部分细胞并接种12孔基质涂层板。
当细胞生长并准备传代时，就可以进行APS染色了。通过使用BCIP/NBT碱性磷酸酶底物试剂盒IV，对细胞进行APS染色。首先混合足够的试剂用于染色孔（每孔0.5 ml）。
向5 ml 100 mM Tris-HCl（pH 9.5）中加入两滴试剂A并充分混合。添加两滴试剂B并混合，然后添加两滴药剂C并混合（注意试剂A、B和C是试剂盒的一部分）。
从细胞中取出培养基，每孔添加0.5 ml APS染色试剂混合物。菌落通常在20分钟后可见。当菌落可见时，清除液体；否则，等待菌落被与周围细胞形成鲜明对比的独特信号染色。
C） EDTA法检测畸胎瘤形成
时间安排6-9周
在iPSCs通过不同的特性得到确认后，选择一个细胞系进行畸胎瘤形成分析。按1:4的比例拆分选定的单元格（如步骤1-7所述）。这应该在计划注射前2-3天完成。
当细胞达到约70–80%的融合时，用EDTA分离细胞（如步骤3–4所述）。同时，在冰上预溶200μl Matrigel，并用400μl冰镇E8培养基稀释。
每孔（六孔板）用1 ml E8培养基进行EDTA培养后收集细胞。
在100毫升的1.5毫升Eppendorf管中旋转细胞克RT5分钟。
去除上清液，并用600μl E8培养基/Matrigel混合物重新悬浮颗粒。
将细胞悬液放入1000μl注射器中，并在注射前将其置于冰上。
使用20.5号针头，尽快为每只小鼠注射100–300μl悬浮液。肌肉注射时，细胞悬液应沿长轴注射到后腿四头肌的肌肉中心。
正常饲养小鼠并定期评估其是否形成畸胎瘤。这些应该在注射后约4周时看到。
首次发现畸胎瘤后约2周，取出畸胎瘤进行组织学分析。注意安全：确保移除方法符合所有相关动物处理和实验指南。
时间安排
试剂制备，大规模培养基制备：2 d
步骤1-7，EDTA通过中等认证：每块板6-7分钟
步骤8和9，每3-4天送料和iPSC维护一次：（可选）持续至少20天，以验证一批介质
步骤10和11，成纤维细胞培养和病毒转导：3d
步骤12-18，在化学定义的介质中重新编程：3-4周
步骤19-28，机械隔离和菌落扩展：1-2周
步骤28A，冷冻保存，每条线6-10分钟
步骤28B，APS染色：1-2小时
步骤28C，畸胎瘤形成：6-9周。
预期结果
化学定义的E8培养基为人类PSC研究提供了理想的细胞培养条件。通过改变一些生长因子，我们能够为人类iPSC的衍生和扩展创造细胞培养条件(和). EDTA分离也提供了一种在不同情况下处理干细胞的简单而有效的方法(). 这种培养基和处理方法的结合能够实现有效的培养扩展和其他处理。所有这些实验都可以在没有药物治疗的情况下进行，但ROCK抑制剂包括在本方案中，供那些喜欢使用它的人使用。
当人类成纤维细胞在基于E8的无饲料系统中重新编程时，转导后5-6天可以看到转化细胞。真正的iPSC菌落成熟到足以进行菌落扩展需要20-30天(). 过度拥挤的成纤维细胞通常抑制iPSC集落的出现，因此EDTA分离可用于不同程度地富集iPSC。
机械分离iPSC菌落后，EDTA分离可在1-2周内有效扩张和冷冻保存，显著减少保存细胞所需的时间。由于其简单性，我们能够在15分钟内通过24孔板上的24条独立线。
扩增的iPSCs应首先通过APS染色和流式细胞术或免疫染色的多能性标记染色进行确认(和补充图4b). 应通过将细胞注射到SCID小鼠中，在选定的iPSC系上进行畸胎瘤形成测定。畸胎瘤通常在4周后出现，注射后6-7周即可进行分析。
致谢
这项工作得到了NHLBI、NIH共同基金通过再生医学中心（发给G.C.和J.B.）、夏洛特·盖尔基金会、莫格里奇研究所、NIH赠款UO1ES017166（发给J.A.T.）、NIH合同RR-05-19（发给J.A.T.）和NIH合同HHSN309200582085C（发给J.J.）的支持以及威斯康星州校友研究基金会（给J.J.）的私人资金。我们感谢M.Boehm、T.Finkel和M.Rao的建议。我们感谢K.伊斯曼的编辑协助。
脚注
贡献
G.C.和J.A.T.构思了实验并监督了项目；G.C.制定的分离方案；J.B.和G.C.执行了论文中的重新编程实验程序；G.C.和D.R.G.显示EDTA优先解离；N.G、J.J.、D.R.G.和G.C.进行长期培养；G.C.、D.R.G.和J.B.进行了畸胎瘤形成试验；L.I.S.进行免疫染色和EDTA序列分离成像；J.B.和G.C.写了这篇论文。
竞争性财务利益
J.A.T.是Cellular Dynamics International的创始人、股东、顾问和董事会成员。他还担任Tactics II干细胞风险投资公司的科学顾问，并在该公司拥有财务利益。
工具书类
1Thomson JA等人。来源于人类囊胚的胚胎干细胞系。科学。1998;282:1145–1147.[公共医学][谷歌学者] 2Reubinoff BE、Pera MF、Fong CY、Trunson A、Bongso A.人类囊胚胚胎干细胞系：体细胞分化在体外.国家生物技术。2000;18:399–404.[公共医学][谷歌学者] 4Yu JY等。从人体体细胞诱导多能干细胞系。科学。2007;318:1917–1920.[公共医学][谷歌学者] 5Takahashi K等。通过特定因子从成人成纤维细胞诱导多能干细胞。单元格。2007;131:861–872.[公共医学][谷歌学者] 6Xu RH等。基本FGF和BMP信号的抑制维持了人类ES细胞的未分化增殖。自然方法。2005;2:185–190.[公共医学][谷歌学者] 7Levenstein ME等，人类胚胎干细胞自我更新的基本成纤维细胞生长因子支持。干细胞。2006;24:568–574. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 8Ludwig TE等人，人类胚胎干细胞的不依赖饲养者的培养。自然方法。2006;三:637–646.[公共医学][谷歌学者] 9Ludwig TE等人。在规定条件下人类胚胎干细胞的衍生。国家生物技术。2006;24:185–187.[公共医学][谷歌学者] 10Ellerstrom C，Strehl R，Noaksson K，Hyllner J，Semb H。通过单细胞酶解促进人类胚胎干细胞的扩增。干细胞。2007;25:1690–1696.[公共医学][谷歌学者] 11Bajpai R、Lesperance J、Kim M、Terskikh AV。单细胞Accutase游离人胚胎干细胞的高效繁殖。摩尔再现偏差。2008;75:818–827.[公共医学][谷歌学者] 12Thomson A等人。使用酶法传代的人类胚胎干细胞保留正常核型并表达CD30。克隆干细胞。2008;10:89–106.[公共医学][谷歌学者] 13渡边K等人。ROCK抑制剂允许分离的人类胚胎干细胞存活。国家生物技术。2007;25:681–686.[公共医学][谷歌学者] 15Chen G、Hou Z、Gulbranson DR、Thomson JA。肌动蛋白-肌球蛋白的收缩性是导致分离的人类胚胎干细胞活性降低的原因。细胞干细胞。2010;7:240–248. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 16Howden SE等。旋回萎缩患者诱导多能干细胞的遗传校正和分析。美国国家科学院程序。2011;108:6537–6542. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 17Chen G、Gulbranson DR、Yu P、Hou Z、Thomson JA。成纤维细胞生长因子蛋白的热稳定性是调节人类多能干细胞自我更新、分化和重编程的决定因素。干细胞。2012;30:623–630. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 18Zheng X等。Cnot1、Cnot2和Cnot3维持小鼠和人类ESC的特性并抑制胚胎外分化。干细胞。2012;30:910–922. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 19Ware CB，Nelson AM，Blau CA。人类ES细胞的控制速率冷冻。生物技术。2005;38:879–880. 882–883.[公共医学][谷歌学者] 20Li X，Krawetz R，Liu S，Meng G，Rancourt DE。ROCK抑制剂提高冷冻保存的血清/无饲料单个人类胚胎干细胞的存活率。哼哼重复。2009;24:580–589.[公共医学][谷歌学者] 
